فإن الكتاب أود أن أنوه ديتليف شومان، جينيفر ساتون (الحرارية فيشر العلمية) وناثانيل سنايدر (جامعة بنسلفانيا) لإجراء مناقشات قيمة حول المعايرة الشامل ومعالجة البيانات. وأيد البحوث التي أعلن عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للسرطان التابع لمعاهد الصحة الوطنية في إطار جائزة عدد R00CA168997. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

1. إعداد LC-MS الكواشف، إنشاء طرق اللوني، وإنشاء صك إجراءات التشغيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المذيبات LC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 500 مل مراحل المحمول. (أ) هو خلات الأمونيوم 20 ملي و 15 ملي هيدروكسيد الأمونيوم في 3٪ الأسيتونيتريل / المياه، ودرجة الحموضة 9.0 النهائي؛ وB هو 100٪ أسيتونتريل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضفاضة لحد الزجاجة، وضعه في sonicator حمام الماء، ويصوتن لمدة 10 دقيقة دون تدفئة إضافية. (هذه الخطوة هو التأكد من أن كل من أملاح الأمونيوم تذوب تماما وأنه لا توجد فقاعات الهواء المتبقية.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 250 مل من المذيب لزجاجة 250 مل زجاج للاستخدام LC-MS، والحفاظ على ما تبقى في 4 درجات مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل معايرة انخفاض نطاق شامل. من المهم استخدام مجموعة مخصصة انخفاض كتلة خليط المعايرة للتطبيقات الايض لضمان الكشف عن أن الجماهير دقيقة في أوزان جزيئية منخفضة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن 5 ملغ من كلا سودىأم فلوروآسيتات وحمض homovanillic وحل لهم في 5 مل من الماء لجعل تركيز النهائي من 1 ملغ / مل. حل ديازينون في الميثانول لجعل تركيز النهائي من 10 ملغ / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد 1 مل من محلول المعايرة السلبية منخفضة الشامل، وخلط 960 مل من محلول المعايرة الحرارية السلبية مع 20 مل من fluoroaceate الصوديوم ومحلول حمض homovanillic. لجعل 1 مل من محلول المعايرة إيجابية منخفضة الشامل، وخلط 990 مل من محلول المعايرة الحرارية إيجابية و 10 مل من محلول الديازينون. (يجب أن يتم تخزين الحل معايرة انخفاض كتلة في 4 درجات مئوية، ويكون مستعدا جديدة كل 2 أشهر.) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة QE-MS في نطاق كتلة منخفضة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تنفيذ منخفض مجموعة كتلة المعايرة، وإجراء معايرة الكتلة القياسية (م / ض، 150-2،000) في أوضاع كل من الإيجابية والسلبية بناء على تعليمات الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يمر معايرة الكتلة العادية، وضبط لمسح مجموعة 60-900 م / ض في لوحة التحكم الصكويتم تطبيق CID مصدر 25 فولت لوضع إيجابي و 35 إلكترون فولت لوضع سلبي. (وهذا يعطي إشارات قوية من الكافيين جزء ايون وايون الكبريتات. تم إصلاح مسح مجموعة هنا، وذلك لأن مشاركة م / ض لا ينبغي أن يكون أكبر من 15X بدءا من م / ض) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة المصدر أيون مستقرة، ثم إجراء معايرة حسب الطلب. ملاحظة: يتم تعريف مصدر مستقر وأقل من 10٪ من إجمالي التباين أيون الحالية في وضع إيجابي، وأقل من 15٪ في وضع سلبي. يتم سرد أيونات المعايرة حسب الطلب والمقابلة م / ض في الجدول 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء الأجهزة LC-MS لتحليل المستقلب القطبية. ويقترن LC إلى QE-MS لفصل الأيض والكشف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجهيز QE-MS مع بتدفئة التحقيق التأين electrospray (H-ESI). تعيين المعلمات ذات الصلة لضبط التحقيق على النحو المبين: درجة حرارة سخان، و 120 درجة مئوية؛ الغاز غمد، 30؛ الغاز المساعدة، 10؛ اكتساح الغاز، 3؛ رذاذ الجهد، 3.6 كيلو فولت لوضع إيجابية و 2.5 كيلو فولت لوضع سلبي. ضبط درجة الحرارة الشعرية في 320 درجة مئوية، وS-العدسة في 55. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء طريقة مسح كامل على النحو التالي: كامل تفحص نطاق: 60-900 (م / ض)؛ القرار: 70،000؛ الحد الأقصى للوقت حقن: 200 ميللي ثانية مع أوقات نموذجية حقن حوالي 50 مللي ثانية؛ التحكم الآلي مكسب (AGC): 3،000،000 الأيونات. هذه الإعدادات تؤدي إلى دورة العمل من حوالي 550 ميللي ثانية لتنفيذ عمليات التفحص في وضع حد سواء الإيجابية والسلبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء الأسلوب اللوني. توظيف عمود أميد (100 × 2.1 مم الهوية، 3.5 ملم) لفصل المركب في درجة حرارة الغرفة 13،15. الطور المتحرك (أ) هو كما هو موضح أعلاه، والطور المتحرك B هو أسيتونتريل. استخدام الانحدار الخطي كما يلي: 0 دقيقة، 85٪ B؛ 1.5 دقيقة، 85٪ B، 5.5 دقيقة، 35٪ B؛ 10min، 35٪ B، 10.5 دقيقة، 35٪ B، 14.5 دقيقة، 35٪ B، 15 دقيقة، 85٪ B، و 20 دقيقة، و 85٪ B. معدل تدفق 0.15 مل / دقيقة 0-10 دقيقة و 15 إلى 20 دقيقة، و 0.3 مل / دقيقة 10،5-14،5 دقيقة. </li></ol></li></ol> 2. العلاقات العامةeparation العينات المستقلب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المذيبات استخراج. خلط 40 مل الميثانول (LC-MS الصف) و 10 مل من الماء (LC-MS الصف) في أنبوب 50 مل، ويبقيه في الفريزر -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل قبل الاستخدام. ملاحظة: هذا الإجراء والخطوات التالية يمكن تعديلها لاستخراج عينات الأنسجة البيولوجية والسوائل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة القولون HCT السرطان 8 خلايا في ثلاثة أطباق 10 سم أو 6 لوحات جيدة مع متوسط ​​النمو الكامل، 1640 RPMI تستكمل مع 10٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني و 100،000 وحدة / L البنسلين و 100 ملغم / لتر الستربتوميسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تصل خلايا التقاء 80٪، وإزالة بسرعة متوسطة، ووضع طبق أو لوحة على رأس 13،15 الثلج الجاف. إضافة 1 مل الاستخلاص بالمذيبات على الفور (80٪ الميثانول / الماء)، ونقل لوحة إلى -80 ° C الفريزر. لطبق 10 سم، وإضافة 3 مل من الاستخلاص بالمذيبات إلى كل بئر. (في محاولة لإزالة المتوسطة قدر الإمكان لتجنب تأثير قمع أيون بسبب الأملاح المتبقية من المتوسط.)</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك لوحة لمدة 15 دقيقة. إزالته من الثلاجة، وتتخلص من الخلايا في المذيب على الثلج الجاف. نقل الحل إلى 1.7 مل أنابيب إيبندورف، وأجهزة الطرد المركزي مع سرعة 20،000 XG في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. (إعداد نواتج الأيض الخلوي من ثلاثة أطباق منفصلة لجعل ثلاث عينات تكرار. الغرض من حفظ أنبوبين هو أن يكون واحدا على سبيل الاحتياط.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طاف لاثنين من أنابيب إيبندورف جديدة، وتجفيفها في فراغ السرعة. وهذا يستغرق حوالي 3-6 ساعة اعتمادا على الفراغ سرعة استخدامها. (العينات ويمكن أيضا أن تجفف بين عشية وضحاها تحت غاز النيتروجين.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التجفيف، وتخزين الأنابيب من كل عينة في الفريزر -80 درجة مئوية. عندما تصبح جاهزة، إعادة عينة واحدة في 20 مل من الماء (LC-MS الصف)، وحقن 5 مل لLC-MS-التيسير الكمي للتحليل. </li></ol></li></ol> 3. إعداد عينة من تسلسل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم تنفيذ معايرة بشكل صحيح خارج على QE-MS، تتوازن العمود LC لمدة 5 دقائق مع 85٪ A في تدفقمعدل 0.15 مل / دقيقة، وهو الشرط بدءا من التدرج LC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تسلسل العينة في ترتيب عشوائي. ملاحظة: في هذه الطريقة، فإنه يوزع التقلبات التي أدخلتها LC-MS لكل عينة ويضمن المقارنة أكثر دقة بين عينات مختلفة. كل 6 عينات، إضافة إلى غسل المدى، والذي يسير على نفس طريقة MS، باستثناء التدرج LC 95٪ A لمدة 10 دقيقة وتليها عمود موازنة 5 دقائق في 85٪ A مع معدل تدفق 0.15 مل / دقيقة. إضافة عينات فارغة (100٪ ماء) يغسل بعد كل شوط لتقييم خلفية النظام وتحمل أكثر المستويات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ تسلسل ومرة ​​يظهر العمود LC الضغط مستقر، حوالي 400 رطل، بدء تشغيل التسلسل. إذا لم يكن هناك عينة أخرى يتم ليتم تشغيلها بعد هذا التسلسل، ثم تضاف تشغيل المحطة في نهاية تسلسل، والتي لديها معدل تدفق 0 مل / دقيقة في نهاية التدرج واختر &quot;الاستعداد&quot; بعد الانتهاء من التسلسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تشغيل تعيين نفس العينة 12 ساعة بعد المعايرة. (هذا أناق لتقييم تقلب الخطأ الشامل بعد المعايرة.) </li></ol> 4. مشاركة وتحليل الصك التنظيف والصيانة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية تسلسل، وغسل العمود مع 95٪ A بمعدل تدفق 0.2 مل / دقيقة لمدة 2 ساعة، وإذا لزم الأمر، عكس العمود قبل الغسيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العمود LC والاتصال مباشرة LC إلى مصدر أيون من قبل الاتحاد. إعداد تنظيف المذيبات والماء / الميثانول / حامض الفورميك (ت: ت: ت، 90:10:0.2)، تعيين MS على وضع الاستعداد، ونظام غسيل LC-MS في معدل تدفق 0.1 مل / دقيقة لمدة 1 ساعة لإزالة المتبقي عجلت أملاح أو غيرها من الشوائب. خفض معدل التدفق إذا كان هناك الكثير من الضغوط النظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحرارة الشعرية عند 50 درجة مئوية، وإزالة القفص أيون. تأخذ بعناية مخروط أيون الاجتياح وأنبوب نقل أيون بعد انخفاض درجة الحرارة الشعرية إلى 50 درجة مئوية. استخدام شبكة الخام، مثل الصنفرة، لإزالة الشوائب المتبقية على سطح مخروط أيون الاجتياح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع نقل أيونأنبوب إلى أنبوب 15 مل الصقر تحتوي على 10 مل 90٪ من المياه / الميثانول مع حمض الفورميك بنسبة 0.1٪. بعد sonicating الأنبوب في sonicator حمام الماء لمدة 20 دقيقة، صب المذيب الداخل، استبدالها مع 10 مل الميثانول النقي ويصوتن لمدة 20 دقيقة أخرى. (إذا لزم الأمر، يمكن أن يتم صوتنة عند 40 درجة مئوية أو درجة حرارة أعلى من ذلك لتحقيق نتائج أفضل التنظيف.) </li></ol> 5. تحليل LC-MS البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضمان تسلسل عينة تدير على نحو سلس، وبعد الانتهاء من العينتين الأولى في التسلسل، والتحقق من قمم لمستقلبات غير معروفة. استخدام ملف CSV سرد أسماء الأيض، والصيغة الكيميائية محايدة طريقة الكشف عن (إما إيجابية أو سلبية)، وملف الإدخال، ويحتوي على ملف الإخراج استخراج القمم والخطأ الشامل في جزء في المليون. إذا كان شكل ذروة غير طبيعي أو الخطأ الشامل هو خارج من قبل أكثر من 5 جزء في المليون، ثم بقية التسلسل يحتاج إلى وقفه واستكشاف الأخطاء وإصلاحها يحتاج إلى القيام به. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار طريقة &quot;محاذاة الذروةوالإطار استخراج &quot;على البرمجيات المتاحة تجاريا. حدد البيانات الخام من LC-MS وتجميعها. اختيار العينات في منتصف تسلسل تشغيل ك عينة مرجعية اللوني للمحاذاة الذروة. تحميل البذور الإطار بما في ذلك التمثيل الغذائي المعروفة لتحليل نواتج المستهدفة مع البيانات التي تم جمعها والمقابلة البذور الإطار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تحليل البيانات في وضع الإيجابية والسلبية بشكل منفصل. استخدام الإعداد الافتراضي لغيرها من المعالم. إيقاف وظيفة البحث قاعدة البيانات وتشغيل سير العمل. تصدير البيانات التي تتم معالجتها بوصفها ورقة اكسل تحتوي على منطقة ذروة كل إطار. مجموعات الأولى من إطارات تتوافق مع نواتج الأيض في القائمة المستهدفة. ملاحظة: للاطلاع على تحليل المستقلب المستهدفة، يتم الحصول على المعلومات الأيض استنادا إلى دراسات سابقة 13،15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل المستقلب تشتته، واختيار طريقة &quot;استخراج مكون&quot;. تحميل عينات فارغة للالطرح الخلفية. تعيين ذروة كثافة عتبةر 10 5، عرض م / ض من 10 جزء في المليون وإشارة إلى نسبة الضوضاء 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام قاعدة البيانات metabolome الإنسان لتحديد المركبات غير معروف. استخدام مرشح السيرة الذاتية لإزالة المكونات مع السير الذاتية كبيرة داخل عينات تكرار. تذهب يدويا من خلال كل مكون واختيار تلك مع ذروة محددة جيدا أو فرق كبير نسبيا في أنواع عينات مختلفة للبحث قاعدة البيانات. تصدير البيانات مع يضرب في قاعدة بيانات. (محاذاة الذروة يمكن تجاوزه إذا كانت النتيجة المحاذاة الذروة منخفض جدا.) </li></ol>

<ol>
	<li>Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+genomics,+metabolome+analysis,+and+biochemical+modelling+to+understand+metabolic+networks.">Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks.</a> Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).</li><li>Mulleder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prototrophic+deletion+mutant+collection+for+yeast+metabolomics+and+systems+biology.">A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology.</a> Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).</li><li>Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CircadiOmics:+Integrating+circadian+genomics,+transcriptomics,+proteomics+and+metabolomics.">CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics.</a> Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).</li><li>Ideker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+genomic+and+proteomic+analyses+of+a+systematically+perturbed+metabolic+network.">Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network.</a> Science. 292 (5518), 929-934 (2001).</li><li>Jonsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+identifying+differences+in+large+series+of+metabolomic+samples+analyzed+by+GC/MS.">A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS.</a> Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).</li><li>Jonsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+data+analysis+for+detecting+and+identifying+differences+between+samples+in+GC/MS-based+metabolomic+analyses.">High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).</li><li>Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+profiling:+Quantitative+analysis+of+1H+NMR+metabolomics+data.">Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data.</a> Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).</li><li>Wiklund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+GC/TOF-MS-based+metabolomics+data+for+identification+of+biochemically+interesting+compounds+using+OPLS+class+models.">Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models.</a> Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).</li><li>Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboMiner--semi-automated+identification+of+metabolites+from+2D+NMR+spectra+of+complex+biofluids.">MetaboMiner--semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids.</a> BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C+NMR+isotopomer+analysis+reveals+a+connection+between+pyruvate+cycling+and+glucose-stimulated+insulin+secretion+(GSIS).">13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+rate+of+the+glutamate/glutamine+cycle+in+the+human+brain+b.+in+vivo+13C+NMR.">Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).</li><li>Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+reaction+monitoring+for+quantitative+biomarker+analysis+in+proteomics+and+metabolomics.">Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).</li><li>Locasale, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+human+cerebrospinal+fluid+identifies+signatures+of+malignant+glioma.">Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).</li><li>Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+reaction+monitoring+for+robust+quantitative+proteomic+analysis+of+cellular+signaling+networks.">Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).</li><li>Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+positive/negative+ion-switching,+targeted+mass+spectrometry-based+metabolomics+platform+for+bodily+fluids,+cells,+and+fresh+and+fixed+tissue.">A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue.</a> Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).</li><li>Ramanathan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It+is+time+for+a+paradigm+shift+in+drug+discovery+bioanalysis:+From+SRM+to+HRMS.">It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS.</a> Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).</li><li>Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+analysis+via+reversed-phase+ion-pairing+liquid+chromatography+coupled+to+a+stand+alone+orbitrap+mass+spectrometer.">Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer.</a> Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).</li><li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+high+resolution+linear+ion+trap+orbitrap+mass+spectrometer+(orbitrap+elite)+facilitates+top+down+LC+MS/MS+and+versatile+peptide+fragmentation+modes.">Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).</li><li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+using+Q+exactive,+a+high-performance+benchtop+quadrupole+orbitrap+mass+spectrometer.">Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).</li><li>Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+Metabolomics+from+Biological+Sources+Using+Ultraperformance+Liquid+Chromatography-High+Resolution+Mass+Spectrometry.">Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry.</a> UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).</li><li>Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-day+reproducibility+of+an+HPLC-MS-based+method+for+metabonomic+analysis:+Application+to+human+urine.">Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine.</a> Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).</li><li>Want, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+metabolic+profiling+procedures+for+urine+using+UPLC-MS.">Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS.</a> Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).</li></ol>

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

الخطوات الأكثر أهمية بالنسبة لالتنميط المستقلب ناجحة في الخلايا باستخدام هذا البروتوكول هي: 1) السيطرة على النمو المتوسطة واستخراج الدقيق للخلايا؛ 2) تعديل طريقة LC يعتمد على طريقة MS الإعداد لضمان وجود ما يكفي من (عادة لا يقل عن 10) نقاط البيانات عبر الذروة لتحديد الكمي?...

الايض، الذي يعرف بأنه تجربة يقيس نواتج متعددة في وقت واحد كان، وهي منطقة شديدة الأهمية. يوفر الايض قراءات مباشرة لعلم وظائف الأعضاء الجزيئية وقدمت رؤى في التنمية وأمراض مثل السرطان 1-4. الرنين المغناطيسي النووي (NMR) والغاز اللوني الطيف الكتلي (GC-MS) هي من بين الأكثر شيوعا الصكوك 5-9. NMR، وخاصة استخدمت لتدفق التجارب منذ النظائر الثقيلة المركبات المسمى، مثل C 13 الأيض المسمى، هي NMR-النشطة 10،11. ومع ذلك، يتطلب هذه الاستراتيجية عالية نسبيا نقاء عينة وكمية كبيرة العينة، الأمر الذي يحد من تطبيقاتها في الايض. وفي الوقت نفسه، البيانات التي تم جمعها من NMR تحليل الاحتياجات مكثفة وتخصيص مجمع معقدة NMR أطياف أمر صعب. وقد GC-MS تستخدم على نطاق واسع لنواتج الأيض القطبية والدراسات الدهون، لكنه يتطلب compoun متقلبةس، وبالتالي غالبا ما اشتقاق من نواتج الأيض، الذي ينطوي في بعض الأحيان الكيمياء المعقدة التي يمكن أن يكون مضيعة للوقت ويدخل الضوضاء التجريبية. اللوني السائل (LC) بالإضافة إلى الثلاثي مطياف الكتلة رباعي يستخدم رباعي الأولى لاختيار الأيونات الأم سليمة، والتي يتم بعد ذلك مجزأة في رباعية الثانية، في حين يتم استخدام رباعي الثالث لتحديد شظايا مميزة أو الأيونات ابنة. هذا الأسلوب، الذي يسجل الانتقال من الأم إلى أيونات أيونات ابنة محددة، ويطلق متعددة رصد رد فعل (MRM). MRM هو طريقة حساسة جدا ومحددة، وقوية لكل من جزيء صغير من البروتين والكميات 12-15،21. ومع ذلك، MRM لديها حدودها. لتحقيق نوعية عالية يحتاج إلى أسلوب MRM سيتم بناؤها لكل المستقلب. يتكون هذا الأسلوب من تحديد جزء معين وما يقابلها من الطاقة الاصطدام الأمثل، الأمر الذي يتطلب قبل معرفة PROPErties من نواتج الأيض من الفائدة، مثل معلومات التركيب الكيميائي. لذلك، مع بعض الاستثناءات التي تنطوي على خسارة محايدة من شظايا مشتركة، فإنه ليس من الممكن تحديد مستقلبات غير معروفة مع هذا الأسلوب. في السنوات الأخيرة، وقد تم إطلاق سراح عالية الدقة قياس الطيف الكتلي (HRMS) والصكوك، مثل سلسلة LTQ-orbitrap وExactive، وQuanTof، وTripleTOF 5600 16-18،22. يمكن نظام إدارة الموارد البشرية توفير الشامل لتوجيه الاتهام نسبة (م / ض) من الأيونات سليمة داخل خطأ من عدد قليل من جزء في المليون. وبالتالي، أداة نظام إدارة الموارد البشرية تعمل عن طريق الكشف عن أيونات السلائف (أي وضع المسح الضوئي الكامل) يمكن الحصول على معلومات مباشرة من الهيكلية الشامل الدقيق والتركيب العنصري مما أدى لتحليلها، ويمكن استخدام هذه المعلومات لتحديد نواتج المحتملة. في الواقع، كل المعلومات عن مركب يمكن الحصول عليها مع الشامل الدقيق، وتصل إلى مستوى أيزومرات الهيكلي. أيضا، كاملطريقة مسح لا تتطلب معرفة سابقة من نواتج الأيض و لا يتطلب الأسلوب الأمثل. علاوة على ذلك، لأن جميع الأيونات مع م / ض الوقوع في تفحص نطاق يمكن تحليلها، نظام إدارة الموارد البشرية لديها قدرة غير محدودة تقريبا من حيث عدد الأيض التي يمكن قياسها كميا في شوط واحد مقارنة مع الطريقة MRM. نظام إدارة الموارد البشرية هي أيضا قابلة للمقارنة إلى MRM رباعي الثلاثي في ​​القدرات الكمي نظرا لدورة عمل قصيرة مما أدى إلى عدد مماثل من نقاط البيانات التي يمكن الحصول عليها في MS مسح كامل. وبالتالي، يوفر نظام إدارة الموارد البشرية نهجا بديلا لالايض الكمي. في الآونة الأخيرة، ووصف نسخة محسنة من نظام إدارة الموارد البشرية Q-Exactive مطياف الكتلة (QE-MS) يمكن تشغيلها تحت التبديل بين الأوضاع الإيجابية والسلبية مع دورة مرات سريع بما فيه الكفاية في أسلوب واحد، والذي يوسع نطاق الكشف عن 19. نحن هنا تصف استراتيجية الايض لدينا باستخدام QE-MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Positive calibration mix</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">#88323</td>
			<td style="width:207px;">It is light sensitive. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Negative calibration mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#88324</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Diazinon</td>
			<td style="width:117px;">Sant Cruz Biotechnology</td>
			<td>#C0413</td>
			<td style="width:207px;">It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">H-ESI needle insert</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#1303200</td>
			<td style="width:207px;">This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xbridge amide column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>#186004860</td>
			<td style="width:207px;">Guard column is recommend to increase column lifetime.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy for sensitive, large scale quantitative metabolomics

وكان التنميط المستقلب رصيدا قيما في دراسة التمثيل الغذائي في الصحة والمرض. ومع ذلك، والمنصات الحالية لديها العوامل التي تحد مختلفة، مثل عمالة كثيفة عينة الاستعدادات، وحدود الكشف منخفضة، وسرعات المسح الضوئي بطيئة أو أسلوب الأمثل مكثفة لكل الأيض، وعدم القدرة على قياس إيجابا وسلبا الأيونات المشحونة في التجارب احدة. وبالتالي، يمكن لبروتوكول الايض الرواية تقدم دراسات الايض. اللوني ماء مقرها أميد-تمكن من تحليل المستقلب القطبية دون أي اشتقاق الكيميائية. عالية الدقة باستخدام MS Q-Exactive (QE-MS) قد تحسنت البصريات أيون، زيادة سرعات المسح الضوئي (256 ميللي ثانية في قرار 70،000)، ولديه القدرة على تنفيذ الإيجابية / السلبية التبديل. يستخدم إستراتيجية استخراج الميثانول الباردة، واقتران عمود أميد مع QE-MS تمكن الكشف قوية من 168 الأيض وآلاف القطبية المستهدفة من الميزات الإضافية في وقت واحد. داتويتم تجهيز خارجا مع البرمجيات المتاحة تجاريا بطريقة ذات كفاءة عالية، وميزات غير معروف المستخرجة من أطياف الشامل يمكن الاستعلام في قواعد البيانات.

دقة البيانات الايض يعتمد بشكل كبير على أداء أداة LC-MS-التيسير الكمي. لتقييم ما إذا كانت أداة تعمل في حالة جيدة، وإذا كانت طريقة تطبيقها هو الصحيح، يتم استخراج عدة قمم LC المستقلب المعروف من مجموع اللوني ايون (TIC)، كما هو مبين في الشكل 1. مستقلبات القطبية، بما في ذ...

Watch this Scientific Journal Video about A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics at JoVE.com

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

وكان التنميط المستقلب رصيدا قيما في دراسة التمثيل الغذائي في الصحة والمرض. استخدام العادي على مراحل اللوني السائل إلى جانب عالية الدقة قياس الطيف الكتلي مع تبديل قطبية ودورة العمل السريع، ونحن تصف البروتوكول لتحليل تكوين الأيض القطبية من المواد البيولوجية مع حساسية عالية، ودقة، والقرار.

استراتيجية للحساسية، مقياس كبيرة الكمية الايض

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

a-strategy-for-sensitive-large-scale-quantitative-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biology

20.8K Views.  Cornell University.  وكان التنميط المستقلب رصيدا قيما في دراسة التمثيل الغذائي في الصحة والمرض. استخدام العادي على مراحل اللوني السائل إلى جانب عالية الدقة قياس الطيف الكتلي مع تبديل قطبية ودورة العمل السريع، ونحن تصف البروتوكول لتحليل تكوين الأيض القطبية من...

Video: A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

على نطاق واسع من شاشات مكتبات Metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

Immunostaining دفعي للكشف عن البروتين واسعة النطاق في الدماغ القرد الجامعة

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

العزلة وتوقعات بنمو كبير من الكبار الإنسان خلايا غشائي السلف تشكيل مستعمرة

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

اسماك الزرد نطاق واسع ، واستنادا في الجسم الحي شاشة جزيء صغير

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Infinium الفحص على نطاق واسع لتطبيقات SNP التنميط الجيني

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

أوديلاي: طريقة على نطاق واسع لالمعلمات المتعددة الكمي للنمو الخميرة

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific histone modifications, such as H3K27ac, to help identify cis-regulatory DNA elements. The manual process to complete a ChIP-Seq is labor intensive, technically challenging, and often requires large-cell numbers (&#62;100,000 cells). The method described here helps to overcome those challenges. A complete semiautomated, microscaled H3K27ac ChIP-Seq procedure including cell fixation, chromatin shearing, immunoprecipitation, and sequencing library preparation, for batch of 48 samples for cell number inputs less than 100,000 cells is described in detail. The semiautonomous platform reduces technical variability, improves signal-to-noise ratios, and drastically reduces labor. The system can thereby reduce costs by allowing for reduced reaction volumes, limiting the number of expensive reagents such as enzymes, magnetic beads, antibodies, and hands-on time required. These improvements to the ChIP-Seq method suit perfectly for large-scale epigenetic studies of clinical samples with limited cell numbers in a highly reproducible manner.

This paper describes a semiautomated, microscaled ChIP-Seq protocol of DNA regions associated with a specific histone modification (H3K27ac) using a ChIP liquid-handler platform, followed by library preparation using tagmentation. The procedure includes control assessment for quality and quantity purposes and can be adopted to other histone modifications or transcription factors.

إجراء سيميومتوميد ChIP-Seq للدراسات اللاجينية على نطاق واسع

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. Exosomes for clinical application require large-scale production. To this aim, human synovial fluid MSCs (hSF-MSCs) were grown on microcarrier beads, and then cultured in a dynamic three-dimension (3D) culture system. Through utilizing 3D dynamic culture, this protocol successfully obtained large-scale exosomes from SF-MSC culture supernatants. Exosomes were harvested by ultracentrifugation and verified by a transmission electron microscope, nanoparticle transmission assay, and western blotting. Also, the microbiological safety of exosomes was detected. Results of exosome detection suggest that this approach can produce a large number of good manufacturing practices (GMP)-grade exosomes. These exosomes could be utilized in exosome biology research and clinical osteoarthritis treatment.

Here, we present a protocol to produce a large number of GMP-grade exosomes from synovial fluid mesenchymal stem cells using a 3D bioreactor.

إعداد واسع النطاق للسائل الزليلي الوسيط الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة بواسطة ثقافة المفاعل الحيوي 3D

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale quantitative phenotypic measurements from cells. This approach has proved powerful for deepening our understanding of a wide range of both fundamental and applied events in cell biology. To date, the majority of applications for this technology have relied on the use of cells grown in monolayers, although it is increasingly realized that such models do not recapitulate many of the interactions and processes that occur in tissues. As such, there has been an emergence in the development and use of 3-dimensional (3D) cell assemblies, such as spheroids and organoids. Although these 3D models are particularly powerful in the context of cancer biology and drug delivery studies, their production and analysis in a reproducible manner suitable for HCS and HCA present a number of challenges. The protocol detailed here describes a method for the generation of multicellular tumor spheroids (MCTS), and demonstrates that it can be applied to three different cell lines in a manner that is compatible with HCS and HCA. The method facilitates the production of several hundred spheroids per well, providing the specific advantage that when used in a screening regime, data can be obtained from several hundred structures per well, all treated in an identical manner. Examples are also provided, which detail how to process the spheroids for high-resolution fluorescence imaging and how HCA can extract quantitative features at both the spheroid level as well as from individual cells within each spheroid. This protocol could easily be applied to answer a wide range of important questions in cell biology.

This protocol details a method for the production of three different types of spheroids in a manner that makes them suitable for large-scale high-content screening and analysis. In addition, examples are presented showing how they can be analyzed at spheroid and individual cell levels.