מחקר זה נתמך על ידי מענק קריירה NSF (MCB0954016) לבין מחקר Bioenergy DOE גרנט (DEFG0208ER64694).

<html> 1. Cell תרבות (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים בינוניים מינימלי עם יסודות קורט, מלחים, ויטמינים, מצעים פחמן שכותרתו במפורש כי הם הטובים ביותר לחקירה מסלול. השתמש באחת צלוחיות רועד או bioreactors עבור התרבות התא. מזון אורגני, כגון תמצית שמרים, עלולה להפריע למדידת תיוג חומצת אמינו ולכן לא יכול להיות נוכח המדיום לתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעקב צמיחת תאים על ידי צפיפות אופטית של התרבות באורך גל אופטימלי (למשל, OD 730 עבור Cyanothece 51,142) עם ספקטרופוטומטר UV / Vis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים יכולים להיות הראשון גדל בתווך הלא מסומן. באמצע-log השלב תאים הצמיחה הם העדיפו לשמש חיסון (3% (v / v) על ידי חיסון יחס נפח) של המדיום הנקרא. תרבות שכותרתו צריכה להיות תת תרבות (3% v / v יחס חיסון) במדיום שכותרתו אותו כדי למנוע את ההקדמה של פחמן שאינם שכותרתו מ inoculum הראשונית. </li></ol>class = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. חומצות אמינו מיצוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת בתרבית תאים קציר (10 מ&quot;ל) בשלב הביניים יומן הצמיחה על ידי צנטריפוגה (10 דק &#39;, 8000 × ז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 1.5mL של 6M HCl ולהעביר אותו בכוס ברור, פקק הברגה בקבוקון GC. שווי צלוחיות למקם אותם בתנור 100 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי hydrolyze ביומסה את החלבונים לחומצות אמינו. הידרוליזה של כדורי ביומסה יכול להניב 16 מתוך 20 חומצות אמינו נפוצה (איור 2) 5. ציסטאין טריפטופן מפורקים, ו גלוטמין ו asparagine מומרים גלוטמט aspartate, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הפתרון חומצת אמינו ב 20,000 × g עבור 5 דקות באמצעות 2 מ&quot;ל צינורות Eppendorf, ולהעביר את supernatants על צלוחיות חדש GC. צעד זה מסיר חלקיקים מוצקים בתמיסה הידרוליזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מכסי בקבוקון GC ויבש דגימות לחלוטין תחת זרם של אוויר באמצעות המדעית Thermo Reacti-VAP המאייד (הערה: מייבש להקפיא יכול לשמש גם לאo דגימות יבש). צעד זה יכול להיעשות בן לילה. </li></ol> 3. חומצת אמינו derivatization GC-MS התנאים אנליזה של חומצות אמינו או טעונה / מטבוליטים מאוד קוטבי באמצעות GC מחייב מטבוליטים אלה להיות derivatized, כך חומצות אמינו הם נדיפים יכולים להיות מופרדים על ידי גז כרומטוגרפיה 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את דגימות מיובשות עם μL 150 של tetrahydrofuran (THF) ו 150 μL של N-מגיב (טרט-butyldimethylsilyl) N-methyltrifluoroacetamide-derivatization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל דגימות בתנור או אמבט מים בין 65 לבין 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. וורטקס מדי פעם כדי לוודא מטבוליטים בקבוקון הם מומס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות 20,000 × g עבור 10 דקות, ולאחר מכן להעביר את supernatant על צלוחיות חדש GC. Supernatant צריך להיות פתרון ברור צהבהב. בשל הרוויה של גלאי, GC-MS דיוק המדידה יכולה להיות מושפעת conce הגבוההntration של חומצות אמינו TBDMS מוזרק derivatized (דגימות אלה לעתים קרובות מראה צבע חום כהה), ולכן, אנחנו צריכים לדלל דגימות אלה באמצעות THF לפני GC-MS מדידה 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח הדגימות על ידי GC-MS (או להשתמש 01:05 01:10 יחס מפוצל, נפח הזרקה = 1 μL, המוביל גז הליום = 1.2 mL / min). השתמש בתוכנית הבאה GC טמפרטורה: להחזיק ב 150 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, להגדיל ב 3 ° C לדקה עד 280 ° C, גידול ב 20 ° C לדקה עד 300 ° C, ולאחר מכן החזק במשך 5 דקות. עיכוב מרכך ניתן להגדיר כמו 5 דקות ~ (עבור עמודה GC 30 מטר). הטווח של המוני לחייב יחס (m / z) ב-MS יכול להיות מוגדר בין 60 ל 500. </li></ol> 4. GC-MS ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TBDMS חומצת אמינו derivatized המדידה יכולה להיות מושפעת גם על ידי אפליה איזוטופ בהפרדה GC. איזוטופים אור להזיז מעט מהר יותר מאשר תרומת איזוטופים בעמודה GC. כדי לצמצם את ההטיה המדידה פוטנציאל, אנו עשויים הממוצע הספקטרום המונית של כלחומצת אמינו שיא בטווח 6 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> GC ו-MS ספקטרום של מטבוליטים TBDMS derivatized דווחו לפני 7. השעה השמירה GC ואת ייחודי מ &#39;/ z פסגות עבור כל חומצת אמינו הן באיור 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Derivatization של חומצות אמינו או מטבוליטים מרכזי מציגה כמויות משמעותיות של איזוטופים טבעיים שכותרתו, כולל 13 C (1.13%), 18 O (0.20%), 29 Si (4.70%), ו - 30 Si (3.09%). הרעש מדידה של איזוטופים טבעיים הספקטרום המונית גלם isotopomer ניתן לתקן באמצעות תוכנת פרסם 5, 8. הנתונים האחרונים תיוג איזוטופי מדווחים כשברים מסה, למשל, מ 0, M 1, M 2, M 3 ו M 4 (המייצגים שברים המכיל אפס עד ארבע C 13 פחמנים שכותרתו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידה של חומצות אמינו יכול לספק מידע תיוג איזוטופי כשמונה מטבוליטים מבשר מכריע: 2-אוקסו-glutarאכל, 3-P-glycerate, אצטיל-CoA, erythrose-4-P, מוחדר, phosphoenolpyruvate, pyruvate, ריבוז ו-5-P. דפוסי תיוג של מטבוליטים אלה יכולים לשמש כדי לזהות מספר מסלולים מטבוליים המרכזי (איור 2) 9. התוצאה של הניסויים תיוג ניתן לאשר המשך שימוש בשיטות ביוכימיה אחרים (למשל, RT-PCR). </li></ol> 5. מסלול מסומן באמצעות ניתוח נתונים חומצת אמינו על ידי חוקרת רק חומצות אמינו כמה מפתח המופק מעוצב היטב 13 ניסויים C נותב, אנו עשויים לגלות מסלולים ייחודיים או פעילות אנזים ללא ביצוע מתוחכם 13 C-מטבולית ניתוח השטף של חילוף חומרים מרכזי כולו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Entner-Doudoroff מסלול: [1-13 C] גלוקוז יכול לשמש כמקור פחמן. אם מסלול פעיל, תיוג סרין יהיה נמוך משמעותית מאשר תיוג אלאנין ב 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזור TCA הקנים: [1-13 C]pyruvate יכול לשמש כמקור פחמן. אם מחזור TCA שבור, aspartate יכול להיות מתויג על ידי שני פחמנים, בעוד גלוטמט מתויג עם פחמן אחד בלבד 11, 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CO 2 קיבוע על ידי מחזור קלווין, בנסון, Bassham במטבוליזם mixotrophic: Non-CO 2 שכותרתו ומסומן מצעים פחמן הן לשמש מקורות פחמן. אם מחזור קלווין הוא פונקציונלי, סרין וסימון היסטידין יהיה מדולל באופן משמעותי, בהשוואה חומצות אמינו אחרות. שיטה כזו יכולה לקבוע את הקיבעון היחסי CO 2, כאשר מקורות פחמן אורגני נמצאים 13 בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חמצוני מסלול pentose פוספט: [1-13 C] גלוקוז יכול לשמש כמקור פחמן. אם מסלול פעיל, אלאנין שאינו שכותרתו תהיה&gt; 50% 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסלול Anaplerotic (למשל, PEP + CO 2 מוחדר א): 13 CO 2 ולא שכותרתו פחמן מצעים (למשל, גליצרול או pyruvate) יכול לשמש כמקור פחמן. אם מסלול פעיל, תיוג aspartate יהיה מועשר באופן משמעותי, בהשוואה אלאנין ו סרין 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-citrate synthase: [1-13 C] pyruvate יכול לשמש כמקור פחמן. אם האנזים פעיל, גלוטמט הוא מסומן β-carboxyl קבוצה 3, 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסלול Citramalate: [1-13 C] pyruvate, [2-13 C] גליצרול, או [1-13 C] אצטט יכול לשמש כמקור פחמן. אם מסלול פעיל, כמויות תיוג לאוצין ו isoleucine זהים 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרין-isocitrate lyase מחזור: [1-13 C] pyruvate או [1-13 C] לקטט יכול לשמש כמקור פחמן. אם מסלול פעיל, פחמן העמדה השלישית סרין ותסומן 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניצול של חומרי מזון (כלומר, חומצות אמינו אקסוגניים): בינוני תרבות עם מצעים פחמן מסומן באופן מלא ולא מסומן חומצות אמינוניתן להשתמש בו. אם התאים לנצל באופן סלקטיבי חומרים אלה שאינם שכותרתו שיושלם, נוכל לראות דילול משמעותי של תוויות אלו חומצות אמינו ביומסה. שיטה זו יכולה לשמש כדי לחקור תוספי תזונה אשר עדיפים על ידי התא 16. </li></ol> 6. נציג תוצאות מחקרים אחרונים Bioenergy החיו אינטרסים באמצעות מיקרואורגניזמים phototrophic רומן לייצור Bioenergy ו-CO 2 ללכוד. בשנים האחרונות, מעטים 13C-מטבוליזם ניתוחים, כולל 13C-מטבולית ניתוח מתקדמים שטף (13C-MFA), הוחלו על חילוף חומרים מרכזי לחקור חיידקים phototrophic, כי ידע ביוכימי של מסלולים מטבוליים המרכזי אינו מבוסס היטב אלה שאינם מודל אורגניזמים 10, 11, 17-20. כאן, אנו מציגים דוגמה לגילוי מסלול isoleucine חלופית Cyanothece 51,142 21. ציאןothece 51142 אינו מכיל את האנזים (EC 4.3.1.19, תראונין אמוניה lyase), אשר מזרז את ההמרה של תראונין ketobutyrate-2 ב מסלול isoleucine טיפוסי סינתזה. כדי לפתור את מסלול isoleucine, אנו גדלים Cyanothece 51,142 (20 מ&quot;ל) ב בינוני ASP2 22 עם 54 mM גליצרול (2-13C,&gt; 98%). Cyanothece 51142 מנצל 2 nd עמדה שכותרתו גליצרול כמקור פחמן הראשי. אנו צופים כי תראונין ו אלאנין אחד שכותרתו פחמן, בעוד isoleucine מתויג עם שלושה פחמנים. לכן, סינתזה ב Cyanothece 51142 לא ניתן להסיק תוואי תראונין המועסקים על ידי רוב האורגניזמים (איור 4). מצד שני, לאוצין ו isoleucine יש דפוסים זהים תיוג מבוסס על קטע (M-15) + ו שבר (M-159) +. לדוגמה, הנתונים isotopomer מ [M-15] + (המכיל חומצות אמינו unfragmented) להראות תיוג זהה לאוצין (M0 = .01, M1 = 0.03, 0.21 = M2, M3 = 00.69) ו isoleucine (M0 = .01, M1 = 0.03, 0.24 = M2, M3 = 0.67). לפיכך לאוצין ו isoleucine חייב להיות סינתזה של מבשרי אותו (כלומר, pyruvate ו אצטיל-CoA). הבחנה זו עולה בקנה אחד עם המעבר פחמן שכותרתו במסלול citramalate לסינתזה isoleucine. כדי לאשר את מסלול זה, אנו לחפש במאגר הגנום המשותפת במכון ולמצוא את נוכחותו של צ &#39;ימה synthase citramalate (cce_0248) ב Cyanothece. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. C-13 סייעו ניתוח צעדים מסלול. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig2.jpg" alt="איור 2"/> באיור 2. חומצות אמינו המשמשים לרכישת דפוס תיוג של מבשרי המטבולית שלהם. ACoA, אצטיל-CoA, AKG, α-Ketoglutarate; C5P, ריבוז 5 פוספט: CIT, ציטראט; E4P, erythrose 4-פוספט; G6P, גלוקוז 6 פוספט; OAA,<html> מוחדר;, PEP phosphoenolpyruvate, PGA, 3-phosphoglycerate; PYR, pyruvate. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig3.jpg" alt="איור 3"/> באיור 3. פסגות GC עבור 16 חומצות אמינו. חומצות אמינו TBDMS derivatized סדוקים ידי MS לשני קטעים: (M-57) +, המכיל את כל חומצות האמינו, ו (M-159) +, אשר חסר את הקבוצה carboxyl α של חומצה אמינית. עבור לאוצין ו isoleucine, + (M-57) היתה חפיפה על ידי פסגות המוני אחרים. אנו ממליצים להשתמש שבר (M-15) + לנתח את תיוג כל חומצת אמינו. הקבוצה (f302) + מזוהה חומצות אמינו ביותר, אשר מכיל רק את הראשון (α-carboxyl הקבוצה) ו פחמנים השני השדרה חומצת אמינו. כי זה שיא MS לעתים קרובות יש רעש גבוה ל-אות יחס, (f302) + לא מומלץ כמותי וניתוח והנתיבים מטבולית 7. igure 4 &quot;/&gt; איור 4. תיוג מעברים במסלולים isoleucine ב Cyanothece 51,142 (שונה מנייר הקודמת שלנו) 21.

<ol>
	<li>Zamboni, N., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+biological+insights+through+metabolomics+and+13C-flux+analysis.">Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+analysis+of+microbial+metabolic+fluxes+via+13C+isotopic+labeling.">Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling.</a> Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+carbon+metabolism+in+Dehalococcoides+ethenogenes+strain+195+via+isotopic+and+transcriptomic+analysisa.">Investigation of carbon metabolism in Dehalococcoides ethenogenes strain 195 via isotopic and transcriptomic analysisa.</a> J. Bacteriol. 191, 5224-5231 (2009).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+confirmation+and+flux+analysis+of+central+metabolic+pathways+in+Desulfovibrio+vulgaris+Hildenborough+using+GC-MS+and+FT-ICR+mass+spectrometry.">Pathway confirmation and flux analysis of central metabolic pathways in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough using GC-MS and FT-ICR mass spectrometry.</a> Journal of Bacteriology. 189, 940-949 (2007).</li><li>Dauner, M., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GC-MS+analysis+of+amino+acids+rapidly+provides+rich+information+for+isotopomer+balancing.">GC-MS analysis of amino acids rapidly provides rich information for isotopomer balancing.</a> Biotechnology Progress. 16, 642-649 (2000).</li><li>Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluxome+analysis+using+GC-MS.">Fluxome analysis using GC-MS.</a> Microbial Cell Factories. 6, 6-6 (2007).</li><li>Antoniewicz, M. R., Kelleher, J. K., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+assessment+of+amino+acid+mass+isotopomer+distributions+for+metabolic+flux+analysis.">Accurate assessment of amino acid mass isotopomer distributions for metabolic flux analysis.</a> Anal. Chem. 79, 7554-7559 (2007).</li><li>Wahl, S. A., Dauner, M., Wiechert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+mass+isotopomer+data+evaluation+in+13C+flux+analysis:+mass+isotope+correction,+data+consistency+checking,+and+precursor+relationships.">New tools for mass isotopomer data evaluation in 13C flux analysis: mass isotope correction, data consistency checking, and precursor relationships.</a> Biotechnology and Bioengineering. 85, 259-268 (2004).</li><li>Shaikh, A., Tang, Y. J., Mukhopadhyay, A., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotopomer+distributions+in+amino+acids+from+a+highly+expressed+protein+as+a+proxy+for+those+from+total+protein.">Isotopomer distributions in amino acids from a highly expressed protein as a proxy for those from total protein.</a> Analytical Chemistry. 80, 886-890 (2008).</li><li>Tang, K. -. H., Feng, X., Tang, Y. J., Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+metabolism+and+carbon+fixation+in+Roseobacter+denitrificans+OCh114.">Carbohydrate metabolism and carbon fixation in Roseobacter denitrificans OCh114.</a> PLoS One. 4, e7233-e7233 (2009).</li><li>Tang, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+flow+of+Heliobacterium+modesticaldum+is+more+related+to+Firmicutes+than+to+the+green+sulfur+bacteria.">Carbon flow of Heliobacterium modesticaldum is more related to Firmicutes than to the green sulfur bacteria.</a> J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).</li><li>Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Central+Metabolic+Pathways+in+Thermoanaerobacter+sp.+X514+via+Isotopomer-Assisted+Metabolite+Analysis.">Characterization of the Central Metabolic Pathways in Thermoanaerobacter sp. X514 via Isotopomer-Assisted Metabolite Analysis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 5001-5008 (2009).</li><li>Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixotrophic+and+photoheterotrophic+metabolisms+in+Cyanothece+sp.+ATCC+51142+under+continuous+light.">Mixotrophic and photoheterotrophic metabolisms in Cyanothece sp. ATCC 51142 under continuous light.</a> Microbiology. 156, 2566-2574 (2010).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flux+analysis+of+central+metabolic+pathways+in+Geobacter+metallireducens+during+reduction+of+soluble+Fe(III)-NTA.">Flux analysis of central metabolic pathways in Geobacter metallireducens during reduction of soluble Fe(III)-NTA.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 3859-3864 (2007).</li><li>Tang, Y. J., Meadows, A. L., Kirby, J., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+central+metabolic+pathways+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+reinterpreted+in+the+light+of+isotopic+metabolite+labeling.">Anaerobic central metabolic pathways in Shewanella oneidensis MR-1 reinterpreted in the light of isotopic metabolite labeling.</a> Journal of Bacteriology. 189, 894-901 (2007).</li><li>Zhuang, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+utilization+of+exogenous+amino+acids+by+Dehalococcoides+ethenogenes+strain+195+and+the+enhancement+resulted+to+dechloronation+activity.">Selective utilization of exogenous amino acids by Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and the enhancement resulted to dechloronation activity.</a> Appl. Environ. Microbiol. , (2011).</li><li>Feng, X., Tang, K. -. H., Blankenship, R. E., Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+flux+analysis+of+the+mixotrophic+metabolisms+in+the+green+sulfur+bacterium+Chlorobaculum+tepidum.">Metabolic flux analysis of the mixotrophic metabolisms in the green sulfur bacterium Chlorobaculum tepidum.</a> J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).</li><li>McKinlay, J. B., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+dioxide+fixation+as+a+central+redox+cofactor+recycling+mechanism+in+bacteria.">Carbon dioxide fixation as a central redox cofactor recycling mechanism in bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).</li><li>McKinlay, J. B., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calvin+cycle+flux,+pathway+constraints,+and+substrate+oxidation+state+together+determine+the+H2+biofuel+yield+in+photoheterotrophic+bacteria.">Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria.</a> MBio. 2, (2011).</li><li>Erb, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+C5-dicarboxylic+acids+from+C2-units+involving+crotonyl-CoA+carboxylase/reductase:+The+ethylmalonyl-CoA+pathway.">Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway.</a> PNAS. 104, 10631-10636 (2007).</li><li>Wu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoleucine+synthesis+pathway+in+cyanobacterial+species.">Alternative isoleucine synthesis pathway in cyanobacterial species.</a> Microbiology. 156, 596-602 (2010).</li><li>Reddy, K. J., Haskell, J. B., Sherman, D. M., Sherman, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unicellular,+aerobic+nitrogen-ï¬xing+cyanobacteria+of+the+genus+Cyanothece.">Unicellular, aerobic nitrogen-ï¬xing cyanobacteria of the genus Cyanothece.</a> J. Bacteriol. 175, 1284-1292 (1993).</li><li>Shastri, A. A., Morgan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+isotopic+labeling+methodology+for+13C+metabolic+flux+analysis+of+photoautotrophic+microorganisms.">A transient isotopic labeling methodology for 13C metabolic flux analysis of photoautotrophic microorganisms.</a> Phytochemistry. 68, 2302-2312 (2007).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariability+of+central+metabolic+flux+distribution+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+under+environmental+or+genetic+perturbations.">Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations.</a> Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).</li><li>Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C-based+metabolic+flux+analysis.">13C-based metabolic flux analysis.</a> Nature Protocols. 4, 878-892 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול זה כולל האכלה את התא עם המצע שכותרתו למדידת דפוסי כתוצאה תיוג איזוטופי של חומצות אמינו באמצעות GC-MS. מאז MS הנתונים (m / z יחסי) לתת בדיוק את הכמות הכוללת של תיוג של יונים MS, אנחנו צריכים להעריך את הפצות isotopomer של חומצות אמינו על ידי בחינת מ &#39;/ z יחס של שני unfragmented (M-57...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> TBDMS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 19915 </td><td> - </td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34865 </td><td> - </td></tr><tr><td> פחמן תווית המצע </td><td> קיימברידג&#39; איזוטופ מעבדות </td><td> לסמוך על הדרישה ניסיוני </td><td> אתר: <a href="http://www.isotope.com">http://www.isotope.com</a> </td></tr><tr><td> גז כרומטוגרף </td><td> Agilent Technologies </td><td> Hewlett-Packard, דגם 7890A </td><td> - </td></tr><tr><td> GC עמודות </td><td> J &amp; W מדעי, Folsom, CA </td><td> DB5 (30) </td><td> - </td></tr><tr><td> ספקטרומטר מסה </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5975C </td><td> - </td></tr><tr><td> Reacti-VAP Evaporator </td><td> Thermo Scientific </td><td> TS-18825 </td><td> עבור ייבוש דגימות חומצת אמינו </td></tr></tbody></table>

metabolic pathway confirmation and discovery through 13c-labeling of proteinogenic amino acids

חיידקים יש מסלולים מטבוליים מורכבים שניתן לחקור בשיטות הגנומיקה ביוכימיה תפקודית. אחת הטכניקות חשוב לבחון מטבוליזם התא המרכזי לגלות אנזימים חדשים היא 13 C-בסיוע ניתוח חילוף החומרים 1. טכניקה זו מבוססת על תיוג איזוטופי, לפיה חיידקים ניזונים עם 13 ג שכותרתו מצעים. על ידי התחקות את המעבר בין הנתיבים אטום מטבוליטים ברשת ביוכימיים, אנו יכולים לקבוע מסלולים פונקציונלי לגלות אנזימים חדשים. כפי שיטת משלים transcriptomics ו proteomics, גישות לניתוח isotopomer בסיוע של מסלולים מטבוליים מכילים שלושה שלבים עיקריים 2. ראשית, אנו לגדל תאים עם 13 ג שכותרתו מצעים. בשלב זה, את ההרכב של המדיום ואת הבחירה של מצעים שכותרתו הם שני גורמים מרכזיים. כדי למנוע רעשים מדידת פחמן הלא מסומן תוספי תזונה, מדיום מינימלי עם מקור הפחמן היחידי הנדרש. יתר על כן, הבחירה של מצע שכותרתו מבוססת על כמה יעיל זה יהיה להבהיר את מסלול להיות מנותח. בגלל האנזימים רומן לעתים קרובות כרוך stereochemistry תגובה אחרת או מוצרי ביניים, באופן כללי, מצעים פחמן שכותרתו ביחידים הם אינפורמטיבי יותר לאיתור מסלולים רומן מאלה שכותרתו אחיד לגילוי מסלולים הרומן 3, 4. שנית, אנו מנתחים את דפוסי חומצה אמינית תיוג באמצעות GC -MS. חומצות אמינו הן בשפע חלבון ולכן ניתן להשיג הידרוליזה ביומסה. חומצות אמינו ניתן derivatized על ידי N-(טרט-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) לפני ההפרדה GC. חומצות אמינו TBDMS derivatized יכול להיות מקוטעת על ידי MS והתוצאה במערכים שונים של שברים. בהתבסס על מסת יחס תשלום (m / z) של חומצות אמינו מקוטעת unfragmented, אנו יכולים להסיק את דפוסי שכותרתו אפשרית של מטבוליטים מרכזי, כי הםסימנים מקדימים של חומצות אמינו. שלישית, אנו מעברים עקבות הפחמן 13C את המסלולים המוצעים, בהתבסס על הנתונים isotopomer, לאשר מסלולים אלה הם 2 פעילים. מדידה של חומצות אמינו מספק מידע תיוג איזוטופי כשמונה מטבוליטים מבשר חיוני במטבוליזם המרכזי. אלה צמתים מרכזיים מטבולית יכול לשקף את הפונקציות של מסלולים מרכזיים הקשורים. 13 C-בסיוע ניתוח חילוף החומרים באמצעות חומצות אמינו proteinogenic יכול להיות בשימוש נרחב לאפיון פונקציונלי של חילוף החומרים של חיידקים גרוע מאופיינים 1. בפרוטוקול זה, נשתמש Cyanothece 51142 כמו מאמץ את המודל להדגים את השימוש מצעים פחמן שכותרתו לגילוי פונקציות האנזימטית חדש.

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids at JoVE.com

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

13 C-איזוטופ תיוג היא טכניקה יעילה לקביעת מטבוליזם התא מרכזי בסוגים שונים של מיקרואורגניזמים. אחרי תאים בתרבית כבר עם מצע שכותרתו ספציפיים, GC-MS המדידה יכול לחשוף מסלולים מטבוליים פונקציונלי המבוסס על דפוסי תיוג ייחודי חומצות אמינו proteinogenic.

מסלול אישור דיסקברי מטבולית ודרך 13 C-תיוג של חומצות אמינו Proteinogenic

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine ...

metabolic-pathway-confirmation-discovery-through-13c-labeling

Research

JoVE Journal

Biology

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

24.1K Views.  Washington University. 13 C-איזוטופ תיוג היא טכניקה יעילה לקביעת מטבוליזם התא מרכזי בסוגים שונים של מיקרואורגניזמים. אחרי תאים בתרבית כבר עם מצע שכותרתו ספציפיים, GC-MS המדידה יכול לחשוף מסלולים מטבוליים פונקציונלי המבוסס על דפוסי תיוג ייחודי חומצות אמינו proteinogenic.

Video: Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on tandem mass spectrometry and quantifies acylcarnitines as a screen for organic acidemias and also measures amino acids. All states also perform enzymatic testing for carbohydrate disorders such as galactosemia. Because the results can be non-specific, follow-up testing of positive results is required using a more definitive method. The present report describes the "urease" method of sample preparation for inborn error screening. Crystalline urease enzyme is used to remove urea from body fluids which permits most other water-soluble metabolites to be dehydrated and derivatized for gas chromatography in a single procedure. Dehydration by evaporation in a nitrogen stream is facilitated by adding acetonitrile and methylene chloride. Then, trimethylsilylation takes place in the presence of a unique catalyst, triethylammonium trifluoroacetate. Automated injection and chromatography is followed by macro-driven custom quantification of 192 metabolites and semi-quantification of every major component using specialized libraries of mass spectra of TMS derivatized biological compounds. The analysis may be performed on the widely-used Chemstation platform using the macros and libraries available from the author. In our laboratory, over 16,000 patient samples have been analyzed using the method with a diagnostic yield of about 17%--that is, 17% of the samples results reveal findings that should be acted upon by the ordering physician. Included in these are over 180 confirmed inborn errors, of which about 38% could not have been diagnosed using previous methods.

The urease method of sample preparation for GC/MS analysis of intermediary metabolites is presented by its inventor. The method allows one-step follow-up of newborn screening for inborn errors by tandem mass spectrometry by quantifying carbohydrates, organic and amino acids all in a single process.

צעד אחד metabolomics: פחמימות, חומצות אמינו אורגני לכמת בהליך יחיד

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

ניתוח פרופיל המטבולי של עוברי דג זברה

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

מדידה של קצב חילוף החומרים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; באמצעות Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by providing improved methodology for the identification of inhibitors for such binding sites and which represent the majority of potential drug targets. The main goal of this paper is to provide a methodological overview of the use and application of the REPLACE strategy which involves computational and synthetic chemistry approaches. REPLACE is exemplified through its application to the development of non-ATP competitive cyclin dependent kinases (CDK) inhibitors as anti-tumor therapeutics. CDKs are frequently deregulated in cancer and hence are considered as important targets for drug development. Inhibition of CDK2/cyclin A in S phase has been reported to promote selective apoptosis of cancer cells in a p53 independent manner through the E2F1 pathway. Targeting the protein-protein interaction at the cyclin binding groove (CBG) is an approach which will allow the specific inhibition of cell cycle over transcriptional CDKs. The CBG is recognized by a consensus sequence derived from CDK substrates and tumor suppressor proteins termed the cyclin binding motif (CBM). The CBM has previously been optimized to an octapeptide from p21Waf (HAKRRIF) and then further truncated to a pentapeptide retaining sufficient activity (RRLIF). Peptides in general are not cell permeable, are metabolically unstable and therefore the REPLACE (REplacement with Partial Ligand Alternatives through Computational Enrichment) strategy has been applied in order to generate more drug-like inhibitors. The strategy begins with the design of Fragment ligated inhibitory peptides (FLIPs) that selectively inhibit cell cycle CDK/cyclin complexes. FLIPs were generated by iteratively replacing residues of HAKRRLIF/RRLIF with fragment like small molecules (capping groups), starting from the N-terminus (Ncaps), followed by replacement on the C-terminus. These compounds are starting points for the generation of non-ATP competitive CDK inhibitors as anti-tumor therapeutics.

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

פיתוח של מעכבי חלבונים אינטראקציות דרך להחליף: בקשה לעיצוב ומעכבי CDK התחרותי הפיתוח ללא ATP

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes limitations on potential protein applications. The incorporation of noncanonical amino acids can enlarge this scope. There are two complementary approaches for the incorporation of noncanonical amino acids. For site-specific incorporation, in addition to the endogenous canonical translational machineries, an orthogonal aminoacyl-tRNA-synthetase-tRNA pair must be provided that does not interact with the canonical ones. Consequently, a codon that is not assigned to a canonical amino acid, usually a stop codon, is also required. This genetic code expansion enables the incorporation of a noncanonical amino acid at a single, given site within the protein. The here presented work describes residue-specific incorporation where the genetic code is reassigned within the endogenous translational system. The translation machinery accepts the noncanonical amino acid as a surrogate to incorporate it at canonically prescribed locations, i.e., all occurrences of a canonical amino acid in the protein are replaced by the noncanonical one. The incorporation of noncanonical amino acids can change the protein structure, causing considerably modified physical and chemical properties. Noncanonical amino acid analogs often act as cell growth inhibitors for expression hosts since they modify endogenous proteins, limiting in vivo protein production. In vivo incorporation of toxic noncanonical amino acids into proteins remains particularly challenging. Here, a cell-free approach for a complete replacement of L-arginine by the noncanonical amino acid L-canavanine is presented. It circumvents the inherent difficulties of in vivo expression. Additionally, a protocol to prepare target proteins for mass spectral analysis is included. It is shown that L-lysine can be replaced by L-hydroxy-lysine, albeit with lower efficiency. In principle, any noncanonical amino acid analog can be incorporated using the presented method as long as the endogenous in vitro translation system recognizes it.

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

שאריות ספציפיות התאגדות של חומצות אמינו Noncanonical לחלבוני דגם שימוש<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; חינם-Cell מערכת-תמלול תרגום

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.