ويدعم هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح GM - 26738 (لجات).

1. Pak2 التنشيط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المناسبة قبل اختبار كمية caspase 3-20 ميكرولتر من Pak2 ملغ / مل في 12 ألف والعازلة (50 ملي ملي تريس DTT - حمض الهيدروكلوريك وكلوريد الصوديوم 150 ملم ، و 2 في درجة الحموضة 7.5) في احتضان لمدة 30 دقيقة 34 درجة مئوية ليلتصق تماما وPak2 تنشيط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل المنتجات التي تشطر SDS - PAGE (10 ٪) ، وتلطيخ Coommassie زرقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى تفعيل Pak2 المشقوق العازلة ب (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك وكلوريد الصوديوم 150 ملم ، 15 ملم MgCl 2 و 10 ملي ATP) عند pH 7.5 ، في 20 ميكروليتر إلى التركيز النهائي للPak2 ملغ / مل 10 و 34 في احتضان درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتنشيط تماما Pak2 بواسطة autophosphorylation في 8 مواقع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد الانقسام الكامل Pak2 من جراء الهجرة من شظايا p34 P27 وعلى النحو الذي يحدده SDS - PAGE 10. يتم التحقق من الشروط المناسبة autophosphorylation عبر تصوير الإشعاع الذاتي في تجربة منفصلة باستخدام (32 ف) للاعبي التنس المحترفين أو قياس الطيف الكتلي لكشف phosphopeptides. </li></ol> 2. تحديدمن البيبسين - إستفتاء Pak2 شظايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من حمض Trifluroacetic 0.1 ٪ (TFA) في درجة الحموضة 2.5 لغسل حبات agarose مرتين قبل استخدامها. ثم الطرد المركزي العينات لمدة 15 ثانية في 2000 لإزالة XG الخرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة Pak2 (20 ميكروغرام في 2 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم 150 مم ، 50 ملي ملي تريس DTT - 2 في حمض الهيدروكلوريك ودرجة الحموضة 7.5) إلى 100 ميكرولتر من TFA 0.1 ٪ ، واحتضان العينة لمدة 5 دقائق مع 30 ميكرولتر من الخرز agarose البيبسين ، مترافق . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوازن عكس العمود هبلك المرحلة C18 مع النظام الأساسي للمذيب TFA 0.1 ٪ عند pH 2.5. الخلاصة هي eluted البيبسين (50 ميكرولتر) باستخدام خطي 100 دقيقة من الانحدار 0-80 ٪ أسيتونتريل تحتوي TFA 0.1 ٪ في معدل التدفق من 0.2 مل / دقيقة. يتم جمع الكسور كل دقيقة 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف الكسور HPLC مع بطالة السرعة (3 ح) و resuspend العينات في حل أسيتونتريل (5 ميكرولتر) وTFA 0.1 ٪ (5 ميكرولتر) عند pH 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في البداية ، يتم فحص كل جزء لالببتيدات باستخدام - TOF MALDI PerSeptive النظم البيولوجية STR DE فويجر (PE بيosystems ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التي يتعرض لها الكسور التي تحتوي على 16 الببتيدات لمطياف الكتلة جنبا إلى جنب باستخدام مطياف الكتلة Q - TOF وXL QSTAR oMALDI MS / MS لتحديد الأجزاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم التحقق من تسلسل من كل من أيونات الببتيد المنتجات التي تم إنشاؤها بواسطة مطياف الكتلة جنبا إلى جنب مع نسب م / ض النظرية القائمة على التسلسل الرئيسي للPak2 باستخدام بروتين موقع المنقب ( <a href="http://prospector.ucsf.edu/">http://prospector.ucsf.edu/</a> ) 11. </li></ol> 3. قياس صرف H / D الأميد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعقد كل الحلول والكواشف اللازمة لH / D الصرف عند 25 درجة مئوية في حمام مائي. يذوب في الماء ATP ، ويتم تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 قبل الاستخدام. الإضافية 4mM ATP في المنطقة العازلة D O 2 هو لمنع فصلها عن ATP Pak2 بعد التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء H / D تبادل باضافة 18 ميكرولتر من مخزنة O 2 D (50 درجة الحموضة 6.98 ملي اجتماعات الأطراف ، 125 ملي مول كلوريد الصوديوم) إلى 2 ميكروليتر (20 ميكروغرام) من Pak2 في العازلة التي تحتوي على كلوريد الصوديوم 150 ملم ، 50 ملم DTT ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة) و 2 ، مما أدى إلى مستوى Pak2 من 10 ملغ / مل ، ودرجة الحموضة من 7.0 في 0 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات في ثلاث نسخ في تبادل H / D ل0.5 ، 0 ، 1 ، 3 ، 5 و 10 دقيقة ، أو 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخماد عملية التبادل H / D بإضافة 180 ميكروليتر من الجليد الباردة TFA 0.1 ٪ عند pH 2.2 ، مما يجعل الرقم الهيدروجيني إلى 2.5 في الحجم النهائي من 200 ميكروليتر. للعينات التي تحتوي على ATP ، 180 ميكروليتر من الجليد الباردة TFA 0.11 ٪ عند pH 2.2 يستخدم للحفاظ على درجة الحموضة عند 2.5 في حالة مروي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قسامة (100 ميكرولتر) لكل عينة من مروي إلى 30 ميكرولتر من الخرز تنشيط agarose البيبسين ، مترافق. ولا يسمح للهضم الببسين والمضي قدما على الجليد لمدة خمس دقائق وvortexed العينات كل 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنهاء عملية الهضم بواسطة الطرد المركزي للعينة لمدة 15 ثانية في 5000 XG عند 4 درجة مئوية لإزالة البيبسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد بسرعة في عينات السائل N 2 وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 2قبل MALDI - TOF تحليل أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مصفوفة لMALDI هو 5 ملغ / مل من α - cyano - 4 - hydroxycinnamic حمض (CHCA) الذائب في محلول (01:01:01) من الإيثانول ، وأسيتونتريل TFA 0.1 ٪ عند pH 2.5 والذي عقد في 0 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحسن جزئيا كل عينة بسرعة ومزيج 1 ميكرولتر من كل عينة مع 1 ميكرولتر من المصفوفة والبقعة على 4 درجات مئوية لوحة الهدف MALDI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق فراغ معتدلة الى لوحة لتجفيف بقع في 30 ثانية قبل MALDI - TOF التحليل. الوقت بين ذوبان العينة واسترجاع الطيف حوالي 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اكتساب - TOF MALDI أطياف الشامل مع النظم البيولوجية STR PerSeptive DE فوياجر. الحصول على البيانات بمعدل أخذ العينات 2 غيغاهيرتز في قنوات البيانات 100000 ، مع الجهد 20000 - V المتسارع ، والجهد الشبكة 65 ٪ باستخدام تأخر استخراج مع تأخير النبض 180 نانوثانية. وبلغ متوسط ​​مائة بمسح في 2 دقيقة. لا يقتصر هذا الصك MALDI - TOF إلى أي علامة تجارية أو أي برنامج معين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الكمبيوتر البيانات إكسبلورر 4.0 برنامج لcalculتناولوا معالجة بالديوتريوم كل جزء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتساب الصرف مرة أخرى على أساس نسبة من العدد الفعلي دوتيرون أدرجت في 24 ساعة من H / D تبادل مقسوما على جميع المواقع المحتملة للتبديل ، والتي هي العمود الفقري الأميدات باستثناء أميد N - محطة (الشكل 1). </li></ol> 4. ممثل النتائج : يتم التحقق من الانقسام وcaspase autophosphorylation بواسطة تلطيخ Commassie SDS - PAGE. Pak2 الخاملة هي فرقة واحدة من 58 كيلو دالتون. Caspase تشطر من Pak2 كاملة ، وينتج اثنين الشظايا ، p34 P27 والتي تهاجر بشكل منفصل. هجرة يبين P27 وp34 autophosphorylated تداخل على هلام بسبب الهجرة من المتخلفين جزء فسفرته P27 بالكامل (الشكل 2). وتنفذ H / D تبادل التجارب خارج عدة مرات بين 0 و 10 دقيقة (الشكل 3). كمثال على ذلك ، فإن دوام التأسيس الديوتيريوم في م / ZPوتتألف من eak 1697.85 Pak2 نشط من النظائر قمم متعددة كما هو مبين في التحول من المغلف الشامل مع مرور الوقت. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig1.jpg" /> الشكل 1. المعادلات لحساب معالجة بالديوتريوم. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig2.jpg" /> الشكل 2. Autophosphorylation والانقسام caspase من Pak2. وقد تم تحليل كاسباس المشقوق Pak2 (حارة اليسار) ، Pak2 نشط سليمة (وسط حارة) وكاسباس المشقوق Pak2 autophosphorylated (حارة اليمين) بواسطة SDS - PAGE وCoommassie تلطيخ زرقاء. مقتبس من هسو ، وآخرون YH 2. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig3.jpg" /> الشكل 3. الطيف كتلة من دورة الوقت التأسيس لالديوتيريوم Pak2 الخاملة. تعرض Pak2 الخاملة إلى H / D exchaنجى ل00-10 دقيقة وتحليلها بواسطة MALDI - TOF. ويرد مثال على توزيع النظائر الموسع - TOF MALDI ذروة م / ض 1697.85 خلال وقت H / D الصرف. الخط الأحمر المنقط يشير متوسط ​​المغلف الشامل والتحول من المغلف الشامل يبين معالجة بالديوتريوم من الببتيد.

<ol>
	<li>Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amide+H/2H+exchange+reveals+communication+between+the+cAMP+and+catalytic+subunit-binding+sites+in+the+R(I)alpha+subunit+of+protein+kinase.">Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase.</a> A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).</li><li>Hsu, Y. H., Johnson, D. A., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+conformational+changes+during+activation+of+protein+kinase+Pak2+by+amide+hydrogen/deuterium+exchange.">Analysis of conformational changes during activation of protein kinase Pak2 by amide hydrogen/deuterium exchange.</a> J. Biol. Chem. 283, 36397-36405 (2008).</li><li>Englander, S. W., Kallenbach, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+exchange+and+structural+dynamics+of+proteins+and+nucleic+acids.">Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids.</a> Q. Rev. Biophys. 16, 521-655 (1983).</li><li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry.">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass. Spectrom. 5, 214-217 (1991).</li><li>Dennis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localizing+the+membrane+binding+region+of+Group+VIA+Ca2+-independent+phospholipase+A2+using+peptide+amide+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Localizing the membrane binding region of Group VIA Ca2+-independent phospholipase A2 using peptide amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 284, 23652-23661 (2009).</li><li>Hsu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+rigidifies+the+C2+domain+and+the+intradomain+interaction+of+GIVA+phospholipase+A2+as+revealed+by+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).</li><li>Lee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+hPAK65+by+caspase+cleavage+induces+some+of+the+morphological+and+biochemical+changes+of+apoptosis.">Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).</li><li>Rudel, T., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+and+morphological+changes+in+apoptotic+cells+regulated+by+caspase-mediated+activation+of+PAK2.">Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2.</a> Science. 276, 1571-1574 (1997).</li><li>Roig, J., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytostatic+p21+G+protein-activated+protein+kinase+gamma-PAK.">Cytostatic p21 G protein-activated protein kinase gamma-PAK.</a> Vitam. Horm. 62, 167-198 (2001).</li><li>Walter, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+and+activation+of+p21-activated+protein+kinase+gamma-PAK+by+CPP32+(caspase+3).+Effects+of+autophosphorylation+on+activity.">Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity.</a> J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).</li><li>Clauser, K. R., Baker, P., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+accurate+mass+measurement+(+/-+10+ppm)+in+protein+identification+strategies+employing+MS+or+MS/MS+and+database+searching.">Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching.</a> Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

التعرف على أجزاء البيبسين - إستفتاء هو خطوة حاسمة لتبادل التجربة H / D. ويمكن تحديد صحيح لالببتيد تؤدي إلى استنتاج خاطئ. هو eluted Pak2 البيبسين هضم من خلال عمود المرحلة HPLC عكس C18 للحصول على خلفية نظيفة. في تجاربنا ، تم جمع ما مجموعه 40 وتعرض لكسور MALDI - TOF. ويمكن تحديد الببتيد متعددة في كل من الكسور. تعرضت الببتيدات إلى جنب الطيف الكتلي (Q - TOF MS / MS وoMALDI MS / MS) لتحديد تسلسل الخاصة بهم. ينبغي للأطياف MS / MS من الببتيد والأيونات المنتج لا يقل عن ثلاثة لتأكيد هوية من الببتيد. بيانات الكمبيوتر 4.0 مستكشف البرنامج (النظم البيولوجية التطبيقية) بتنفيذ تصحيح الأساس الأولي وترشيح الضوضاء. ويجب معايرة كل الطيف استنادا الى اثنين من قمم متتالية. نحن لدينا من قبل طيف ومعايرة الكتلة النظري للundeuterated م / ض والتي هي 923.45 1697.84. Tيستطيع دقة الشامل بعد معايرة تصل الى 10 جزءا في المليون. عند معالجة بالديوتريوم ، قد أحادي النظائر التحول إلى أعلى الشامل. حققت زيادات خطوة وحدوية لهذه النسب م / ض الجماهير تعزيز المرتبطة معالجة بالديوتريوم. فإن شدة ذروة المغلف الشامل لا تؤثر على مستوى معالجة بالديوتريوم. ومع ذلك ، فإن شدة ذروة الذرى النظائر في ظرف معين كتلة حرجة لحساب كتلة المتوسط. الخطوة الأولى من حساب دوتيرون أدرجت هو طرح كتلة الببتيد من العينة غير deuterated من العينة deuterated. وهناك ثلاثة عوامل أخرى ، في تخفيف D O 2 ، deuterons المتبقية في السلاسل الجانبية وتبادل الظهر ، الحاجة إلى مزيد من النظر في حساب (الشكل 1). التخفيف D O 2 هو عامل إضعاف D 2 O بعد خلط العينة وD O 2 العازلة للشروع في تبادل H / D. ودوتيرون المتبقية (4.5 ٪) في سلاسل جانب البيبسين هضمالببتيدات إد يجب أن يكون مطروح. الجزء الخلفي لتبادل هو خسارة حتمية لمعالجة بالديوتريوم في جميع الببتيدات deuterated وهضم الببسين في كتلة عملية القياس. ومعظم المذيبات الببتيد الوصول (م / ض = 1105.60) بعد ساعة من H - 24 / D تبادل يمثل معالجة بالديوتريوم المنطقة بالكامل. عدد دوتيرون أدرجت لكل من الببتيدات هو الفرق بين النقطه الوسطى من الببتيدات Pak2 deuterated الهضمية وغير deuterated. تم اختيار معظم الببتيد deuterated جدا م / ض 1105 لتمثيل معالجة بالديوتريوم كامل عندما كان في Pak2 24 ساعة من H / D الصرف. تم احتساب نسبة صرف عودة من العدد الفعلي دوتيرون أدرجت في 24 ساعة من H / D تبادل مقسوما على جميع المواقع المحتملة للصرف في الببتيد م / ض 1105.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليق (اختياري) </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> الدريتش </td><td> 7789-20-0 </td><td></td></tr><tr><td> α - cyano - 4 - hydroxycinnamic حمض </td><td> سيغما </td><td> 28166-41-8 </td><td></td></tr><tr><td> MALDI - TOF </td><td> PE النظم البيولوجية </td><td> يسترسل DE STR </td><td></td></tr><tr><td> Q - TOF مطياف الكتلة </td><td> Q - TOF ألتيما ، العالمي </td><td></td><td></td></tr><tr><td> QSTAR XL oMALDI MS / MS </td><td> تطبيق النظم البيولوجية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> بيانات الكمبيوتر إكسبلورر 4.0 البرنامج </td><td> تطبيق النظم البيولوجية </td><td></td><td></td></tص&gt; </tbody></table>

amide hydrogen/deuterium exchange &amp; maldi-tof mass spectrometry analysis of pak2 activation

وقد أميد الهيدروجين / تبادل الديوتيريوم (H / تبادل D) مقرونا المستخدمة على نطاق واسع الطيف الكتلي لتحليل واجهة من البروتين البروتين التفاعلات والتغيرات متعلق بتكوين البروتين ، وديناميات البروتين وتفاعلات البروتين يجند. وقد استخدمت H / D على تبادل المناصب أميد العمود الفقري لقياس معدلات معالجة بالديوتريوم من المناطق الصغيرة في بروتين بواسطة الطيف الكتلي 1،2،3. حل هذا الأسلوب يعتمد على الهضم من البروتين البيبسين deuterated الفائدة في الببتيدات التي تتراوح عادة 3-20 المخلفات. على الرغم من أن القرار من H / D تبادل يقاس الطيف الكتلي هو أقل من واحد بقايا القرار تقاس Heteronuclear الكم طريقة واحدة (HSQC) تماسك الرنين المغناطيسي ، وقياس الطيف الكتلي في H / D الصرف ليس مقيدا حجم 4 البروتين. ويتم H / D الصرف في محلول مائي التي تحافظ على التشكل من البروتين. نحن نقدم طريقة التي UTILizes في MALDI - TOF للكشف 2 ، بدلا من نظام MS - HPLC / ESI (التأين electrospray) 5،6. و- TOF MALDI توفر بيانات دقيقة عن كثافة الشامل للالببتيدات من البروتين المهضوم ، في هذه الحالة بروتين كيناز Pak2 (وتسمى أيضا γ باك). ويتم التحلل البروتيني من باك 2 من أصل في هضم الببسين حاليا. هذه الطريقة البديلة ، وعندما يقوم المستخدم ليس الوصول إلى عمود HPLC والبيبسين متصلة مطياف الكتلة ، أو عندما يكون العمود البيبسين على HPLC لا ينتج مخطط الهضم الأمثل ، وعلى سبيل المثال ، بشدة ثاني كبريتيد العبودي يفرز فسفوليباز A 2 (الجيش الشعبي 2). باستخدام هذا الأسلوب ، ونحن بنجاح رصد التغيرات في مستوى معالجة بالديوتريوم خلال تفعيل Pak2 التي تشطر 3 caspase وautophosphorylation 7،8،9.

Watch this Scientific Journal Video about Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation at JoVE.com

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

وقد استخدمت بنجاح MALDI - TOF الطيف الكتلي لرصد الهيدروجين أميد / الديوتيريوم الصرف في بروتين كيناز Pak2 التنشيط.

أميد الهيدروجينية / الديتريوم الطيف الكتلي تبادل و- TOF MALDI تحليل Pak2 التنشيط

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

amide-hydrogendeuterium-exchange-maldi-tof-mass-spectrometry-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

17.7K Views.  Tunghai University. وقد استخدمت بنجاح MALDI - TOF الطيف الكتلي لرصد الهيدروجين أميد / الديوتيريوم الصرف في بروتين كيناز Pak2 التنشيط.

Video: Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI تحضير العينة : الترا أسلوب طبقة رقيقة

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

تحليل البروتين المجمعات الكبيرة التي الطيف الكتلي الإنشائية

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

تي موجة ايون التنقل الكتلة الطيفي : الإجراءات التجريبية الأساسية لتحليل البروتين مجمع

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

التحليل المباشر للخلايا واحدة بواسطة الطيف الكتلي في الضغط الجوي

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

التنميط بروتيوم الأكسدة والاختزال ثيول استخدام الطيف النظائر كتلة توصيف

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA)

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, strain levels. Commercially available and open source software tools have been developed to facilitate identification; however, no universal/standardized data analysis pipeline has been described in the literature. Here, we provide a comprehensive and detailed demonstration of bacterial identification procedures using a MALDI-TOF mass spectrometer. Mass spectra were collected from 15 diverse bacteria isolated from Kartchner Caverns, AZ, USA, and identified by 16S rDNA sequencing. Databases were constructed in BioNumerics 7.1. Follow-up analyses of mass spectra were performed, including cluster analyses, peak matching, and statistical analyses. Identification was performed using blind-coded samples randomly selected from these 15 bacteria. Two identification methods are presented: similarity coefficient-based and biomarker-based methods. Results show that both identification methods can identify the bacteria to the species level.

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment Kartchner Caverns, AZ, USA

This work details procedures for rapid identification of bacteria using MALDI-TOF MS. The identification procedures include spectrum acquisition, database construction, and follow up analyses. Two identification methods, similarity coefficient-based and biomarker-based methods, are presented.

استخدام MALDI-TOF الطيف الكتلي وقاعدة بيانات مخصصة لتوصيف البكتيريا الأصلية إلى فريد كهف البيئة (Kartchner الكهوف، AZ، ​​الولايات المتحدة الأمريكية)

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

رد الفعل المحدد رصد الطيف الكتلي لالمطلق البروتين الكمي

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

إثراء خارج الخلية مصفوفة البروتينات من الأنسجة والهضم في الببتيدات لتحليل الطيف الكتلي

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

تطبيقات أحادية التحقيق: وسائل التصوير الطيفي والتحليل خلية واحدة في ظل الظروف المحيطة

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

سير العمل كاملا لتحليل هيستون التعديلات بعد متعدية عن طريق أسفل إلى أعلى الطيف الكتلي: من هيستون استخراج لتحليل البيانات

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...