والمؤلف هو باركنسون زميل أبحاث في المملكة المتحدة (منحة F1002). وأيد هذا العمل في جزء من الدعوة ترست / MRC يلكوم المشتركة في الجائزة تنكس عصبي (WT089698) لكونسورتيوم مرض باركنسون في المملكة المتحدة (UKPDC) أعضاؤها من المعهد دوري أبطال أوروبا لعلم الأعصاب ، وجامعة شيفيلد والفسفرة البروتين MRC الوحدة في جامعة دندي.

سلامة البروتوكول هو موضح أدناه يستخدم ATP المسمى مع P 32 المشعة في γ موقف الفوسفات لمتابعة النشاط كيناز من LRRK2. لأنه يقوم على البروتوكولات القياسية المستخدمة في المختبر لدينا ، وذلك فيما يتعلق بالعديد من الخطوات في عملية تشغيل مثل المواد الهلامية ، وهلم جرا غرب النشاف ينبغي أن تؤخذ في المواد وشروط دقيقة كدليل على المعدات والبروتوكولات المستخدمة في هذه العمليات تختلف من مختبر لمختبر. المركبات التي تحتوي على النظائر المشعة التي تنبعث منها الإشعاعات المؤينة ويحتمل أن تكون ضارة على صحة الإنسان ومنح التراخيص واللوائح الصارمة في عنصر تحكم المستوى المؤسسي والوطني استخدامها. وأجريت التجارب في هذا البروتوكول في أعقاب التدريب على استخدام المصادر المفتوحة الاشعاع في جامعة لندن والمبادئ التوجيهية التالية مختبر الممارسة الجيدة التي توفرها خدمات السلامة في الكلية (المبادئ التوجيهية افاilable في <a href="http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf">http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf</a> ). يجب عدم استخدام الإشعاع مفتوحة المصدر يكون حاول قبل التدريب المناسب وموافقة الجهات التنظيمية. الهيئة التنظيمية المسؤولة عن الإشعاع المصدر المفتوح في البحوث المختبرية يختلف من بلد إلى آخر. ومن أمثلة هذه هي : في المملكة المتحدة ، واللجنة التنفيذية للصحة والسلامة ( <a href="http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm">http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm</a> ) ، في الولايات المتحدة واللجنة التنظيمية النووية ( <a href="http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html">http:// www.nrc.gov / المواد / miau / البندان - دلائل comm.html -</a> ) ، في كندا الكندية لجنة السلامة النووية ( <a href="http://nuclearsafety.gc.ca/eng/">http://nuclearsafety.gc.ca/eng/</a> ) ، وداس في ألمانيا Strahlenschutz FÜR الاتحادي لل( <a href="http://www.bfs.de/de/bfs">HTTP : / / www.bfs.de / دو / BFS</a> ). يجب على المستخدمين في بلدان أخرى تأكيد القواعد المحلية والأنظمة والسلطات الترخيص لها مع الإشعاع ضابط السلامة. ولوحظ وجود احتياطات السلامة ذات الصلة في هذا البروتوكول في النص ، وأبرزت مع رمز البرسيم المشعة ( <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="الرمز 1" /> ). 1. إعداد ردود الفعل كيناز <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="الرمز 1" /> جميع المخاليط رد فعل أعد في أنابيب العينات 1.5ml مع قبعات المسمار تحتوي على حلقة O لمنع انتشار المواد المشعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد على البروتين -- LRRK2 نوع البرية ، D1994A ، G2019S. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل ردود الفعل على الجليد -- 10nM LRRK2 ، 0.5μg/μl MBP ، 5ul العازلة من كيناز 10X ، تتكون ل50μl بالماء. </li></ol> 2. تشغيل مقايسة <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="الرمز 1" /> وينبغي الاستفادة من جميع الخطوات 32 ف ع اتخاذ ATPالدانتيل الإشعاع في المناطق المعينة. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="الرمز 1" /> وينبغي ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة -- تحت إجراءات التشغيل القياسية في مختبرنا وتشمل هذه معطف المختبر ، وقفازات ونظارات واقية مزدوجة. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="الرمز 1" /> وينبغي أن العينات التي تحتوي على 32 محمية ف ATP من المستخدمين عن طريق شاشات البرسبيكس 6mm ل تقليل التعرض. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="الرمز 1" /> حيث ينبغي أن تستخدم للتطبيق ، وأجهزة الرصد الشخصية -- ضمن دوري أبطال أوروبا ، يجب على أي شهادة الإشعاع مفتوحة المصدر مستخدم لها شارة الفيلم لرصد التعرض للإشعاع أثناء التجارب. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="الرمز 1" /> وينبغي تقييم كل الأسطح تجريبية لتلوث إشعاعي قبل وبعد الاستخدام باستخدام GEIGER العداد. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="الرمز 1" /> يجب التخلص من جميع المواد الاستهلاكية التي قد تكون ملوثة للفي الالتزام الصارم بالمبادئ التوجيهية المؤسسية للتخلص من النفايات المشعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء في الفحص ، تعيين كتل التدفئة إلى 30 درجة مئوية و 100 درجة مئوية على التوالي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 32 ف -20 ATP من الفريزر (لاحظ أن ظروف التخزين جيئة وذهابا 32 ف ATP قد تختلف اعتمادا على نوع المورد أو radionucleotides المستخدمة). <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="الرمز 1" /> فحص خارج الحاوية قبل استخدامها ، ذوبان الجليد وراء الشاشة البرسبيكس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع ردود الفعل على الجليد ، إضافة للاعبي التنس المحترفين 1μl ف 32 إلى كل جانب من بطولة 10μM الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج جيد مع ماصة. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="الرمز 1" /> نبض الطرد المركزي لجلب السائل إلى أسفل الأنبوب ، والتقليل من خطر التلوث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قسامة 15μl لنقطة الصفر مرة anد إنهاء رد فعل من قبل في قسامة إضافة 5μl 4X العازلة من عينة SDS وتمسخ عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="الرمز 1" /> نبض الطرد المركزي لجلب السائل إلى أسفل الأنبوب ، والتقليل من خطر التلوث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العينة المتبقية وضعت في كتلة التدفئة والمحتضنة في 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15μl إزالتها عند 60 نقطة زمنية دقيقة ، وردود الفعل من قبل إنهاء إضافة 5μl 4X العازلة من عينة SDS وتمسخ عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="الرمز 1" /> نبض الطرد المركزي لجلب السائل إلى أسفل الأنبوب ، والتقليل من خطر التلوث. </li></ol> 3. Immunoblotting العينات وتحليل النتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعمل على عينات SDS - PAGE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 ٪ هلام جيدا 12/04 polyacrilamide مكرر تريس أعدت لاجتماعات الأطراف الكهربائي باستخدام العازلة على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20μl من كل عينة تحميلها على هلام مع 7μl من الأدوات الحادةtain سلم البروتين القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هلام تشغيل في 160v لمدة 90 دقيقة ، أو حتى أمام الصبغة قد وصل إلى نهاية الجل. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="الرمز 1" /> وينبغي معاملة جميع السائل في اتصال مع النظائر المشعة والنفايات المشعة والتخلص من المبادئ التوجيهية المؤسسية في الحال. دوري أبطال أوروبا لوائح الدولة التي يجب التخلص من النفايات المشعة السائلة التي تنهمر المعينة بالوعات تصريف المياه المشعة مع غزير. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البروتين لطخة عبر الغشاء PVDF الغربية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العازلة نقل معدة ، 1X تريس جليكاين الميثانول زائد 20 ٪. قطع غشاء PVDF ورقة الترشيح لتصحيح حجم الجل وتفعيلها مع الميثانول الجليدية في حالة الغشاء أو ما قبل الرطب مع العازلة نقل في حالة ورقة الترشيح. ينبغي أن يكون الغشاء قبل المسمى مع أقلام الحبر السائل للسماح تحديد الاتجاه. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="الرمز 1" /> من هلام إزالة بلاستجيم غلاف الأكريلاميد الزائدة وإزالتها والتخلص منها كنفايات مشعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي تشكيل الهلام في شطيرة مع الغشاء ورقة الترشيح ، وضمان عدم وجود فقاعات بين الغشاء وهلام ، ورتبت بعد ذلك في جهاز وصمة عار الغربية مع الغشاء بين جل والأنود و. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قام بها في نقل 25V لمدة 16 ساعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد نقل البروتين لPVDF ، ينبغي أن يجفف الغشاء في درجة حرارة الغرفة. أخيرا ، يجب أن تكون معزولة الغشاء يجف بين صحائف خلات السليلوز وإما يتعرضون للشاشة فوسفورية او فيلم الأشعة السينية للسماح للكشف عن البروتين إشعاعيا. ويمكن تشغيلها من وقت التعرض لأكثر من عدة ساعات في الأسبوع اعتمادا على نشاط محدد من النظائر المشعة المستخدمة وحركية إنزيم من رد الفعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفحص Phosphoscreen / الفيلم معالجتها. اذا كنت تستخدم شاشة الفوسفور ، ينبغي حفظ الصورة في شكل TIFF عالية الدقة أو ملف صورة نقطية ، إذا به الفيلم ثم تران الناتجةوينبغي أن تفحص sparency باستخدام ماسح سطح المكتب وحفظها كملف TIFF عالية الدقة أو ملف صورة نقطية. ويمكن بعد ذلك تكون الصورة التي تم تحليلها في ImageJ ، وهو برنامج مجاني متاح في المعاهد الوطنية للصحة موقع ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ). </li></ol> 4. ممثل النتائج الشكل 1 يبين نتائج ممثلة لمقايسة نفذت باستخدام نوع البرية ، وG2019S LRRK2 D1994A مع بروتين المايلين الأساسية باعتبارها الركيزة الفوسفات متقبل عام. Autophosphorylation من LRRK2 مرئيا في ≈ 200kDa ، مع فرق متعددة تمثل MBP فسفرته مرئية من 40kDa - 20. لاحظ غياب autophosphorylation في حارة (كيناز قتيلا) D1994A ، وزيادة الفسفرة بسبب الطفرة G2019S. علما الفسفرة المتبقية أيضا MBP في حارة القتلى كيناز. هذا قد يكون راجعا إلى الاجتثاث ناقصة النشاط كيناز LRRK2 من قبل طافرة D1994A أو تعكس وجود سو تلويث تتبع تحركات في رد الفعل. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1.

<ol>
	<li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+ROCO+proteins+in+health+and+disease.">The function of ROCO proteins in health and disease.</a> Biol. Cell. 101, 183-191 (2009).</li><li>Paisan-Ruiz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson's+disease.">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44, 595-600 (2004).</li><li>Zimprich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology.">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44, 601-607 (2004).</li><li>West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease-associated+mutations+in+leucine-rich+repeat+kinase+2+augment+kinase+activity.">Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 16842-16847 (2005).</li><li>Gloeckner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson+disease+causing+LRRK2+mutation+I2020T+is+associated+with+increased+kinase+activity.">The Parkinson disease causing LRRK2 mutation I2020T is associated with increased kinase activity.</a> Hum. Mol. Genet. 15, 223-232 (2006).</li><li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R1441C+mutation+of+LRRK2+disrupts+GTP+hydrolysis.">The R1441C mutation of LRRK2 disrupts GTP hydrolysis.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 668-671 (2007).</li><li>Greggio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+activity+is+required+for+the+toxic+effects+of+mutant+LRRK2/dardarin.">Kinase activity is required for the toxic effects of mutant LRRK2/dardarin.</a> Neurobiol. Dis. 23, 329-341 (2006).</li><li>Smith, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+activity+of+mutant+LRRK2+mediates+neuronal+toxicity.">Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity.</a> Nat. Neurosci. 9, 1231-1233 (2006).</li><li>Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+selective+inhibitor+of+the+Parkinson's+disease+kinase+LRRK2.">Characterization of a selective inhibitor of the Parkinson's disease kinase LRRK2.</a> Nat. Chem. Biol. 7, 203-205 (2011).</li><li>Lee, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+leucine-rich+repeat+kinase-2+protect+against+models+of+Parkinson's+disease.">Inhibitors of leucine-rich repeat kinase-2 protect against models of Parkinson's disease.</a> Nat. Med. 16, 998-1000 (2010).</li><li>Nichols, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+inhibitors+of+LRRK2,+a+protein+kinase+mutated+in+Parkinson's+disease.">Substrate specificity and inhibitors of LRRK2, a protein kinase mutated in Parkinson's disease.</a> The Biochemical Journal. 424, 47-60 (2009).</li><li>Anand, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+leucine-rich+repeat+kinase+2:+enzymological+properties+and+novel+assays.">Investigation of leucine-rich repeat kinase 2: enzymological properties and novel assays.</a> FEBS. J. 276, 466-478 (2009).</li><li>Daniels, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+mode+of+action+of+the+LRRK2+Y1699C+pathogenic+mutant.">Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant.</a> Journal of Neurochemistry. 116, 304-315 (2011).</li><li>Jaleel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+phosphorylates+moesin+at+Thr558;+characterisation+of+how+Parkinson's+disease+mutants+affect+kinase+activity.">LRRK2 phosphorylates moesin at Thr558; characterisation of how Parkinson's disease mutants affect kinase activity.</a> Biochem. J. , (2007).</li><li>Qing, H., Wong, W., McGeer, E. G., McGeer, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lrrk2+phosphorylates+alpha+synuclein+at+serine+129:+Parkinson+disease+implications.">Lrrk2 phosphorylates alpha synuclein at serine 129: Parkinson disease implications.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 387, 149-152 (2009).</li><li>Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+4E-BP+by+LRRK2+affects+the+maintenance+of+dopaminergic+neurons+in+Drosophila.">Phosphorylation of 4E-BP by LRRK2 affects the maintenance of dopaminergic neurons in Drosophila.</a> Embo. J. 27, 2432-2443 (2008).</li><li>Greggio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson+disease-associated+leucine-rich+repeat+kinase+2+(LRRK2)+is+a+dimer+that+undergoes+intramolecular+autophosphorylation.">The Parkinson disease-associated leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) is a dimer that undergoes intramolecular autophosphorylation.</a> J. Biol. Chem. 283, 16906-16914 (2008).</li><li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+complement+of+the+human+genome.">The protein kinase complement of the human genome.</a> Science. 298, 1912-1934 (2002).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

توضح هذه الورقة الأساسية لبروتوكول يعاير النشاط كيناز من LRRK2 باستخدام النظام في المختبر. لمصلحة من الإيجاز ، فقد اقتصر هذا إلى قالب نقطة نهاية مدته ساعة واحدة باستخدام الركيزة عامة ، ولكن البروتوكول عامة تنطبق على مجموعة من ركائز المحتملة وقابلة للتحليلات أكثر تطورا دراسة حركية النشاط كيناز من LRRK2 . هذا يسلط الضوء على واحدة من المزايا الرئيسية لاستخدام النظام في المختبر لدراسة السلوك من بروتين كيناز مثل هذا : لأن هناك سيطرة كاملة على تركيز الانزيم والركيزة ، فمن الممكن لتوليد البيانات الحركية وحساب K م والخامس القيم القصوى للتفاعل. لتقييم حركية أكثر تفصيلا أو تقييم تأثير مثبطات المفترضين ، نظام أعلى إنتاجية (مثل تلك التي يوفرها استخدام الركيزة LRRKtide ، التي تتوفر من Invitrogen) هو alternati متفوقةلقد لنهج وصفها هنا. ومن المهم ، مع ذلك ، أن نعترف بأن النظام النموذجي الاختزالية التي قدمها في فحوصات المختبر كيناز ما هو إلا أداة واحدة لدراسة علم الأحياء لكيناز وعلاقاتها مع ركائز المحتملة. وينبغي استخدام البيانات من مثل هذه المقايسات بالاقتران مع المناهج الأخرى للحصول على صورة شاملة عن كيفية كيناز في المختبر ، ويتصرف في سياق الخليوي. على سبيل المثال ، يمكن تحليل ركيزة المفترضة فسفرته في المختبر عن طريق قياس الطيف الكتلي لتحديد phosphosites المحتملة التي يمكن أن تكون ثم يتلاعب بها الطفرات المستهدفة (على سبيل المثال. السيرين ثريونين أو تحويل مخلفات الفوسفات متقبل مقابل لا شيء ، مثل بقايا phosphorylatable ألانين) لدراسة وظيفية عواقب فيفو السابقين الفسفرة. وهناك اعتبار رئيسي في تفسير البيانات من نظام فحص في المختبر مثل هذا احتمال eitheص النوع الأول أو النوع الثاني (إيجابية أو سلبية كاذبة كاذبة) أخطاء. الطبيعة الاختزالية لهذا النظام يتصرف مع الأسف ، فهو على حد سواء -- لا يمكن في حالة من السابق ، بعد أن ركيزة المنقى المفترضة وتنقيته كيناز على مقربة بشكل مصطنع وعلى تركيز عال (بالمقارنة مع الوسط الخليوي) نتيجة الأحداث في الفسفرة artefactual. على العكس ، الكثير من تحركات وظيفة كجزء من مجمع في إطار الخلية ، وتتطلب التعاون من عوامل الفسفرة ركيزة تعطى للتحدث. ثم ينبغي على النحو المذكور أعلاه ، وهذه نتيجة إيجابية من الفسفرة من المفترض ركيزة باستخدام نظام مقايسة في المختبر يتم اختبارها في نظام الهاتف الخلوي للتحقق من صحة ذلك ، وينبغي أن تفسر نتيجة سلبية بحذر. في ضوء ذلك ، فمن الأهمية بمكان حيث من الممكن أن الضوابط الإيجابية والسلبية للسماح للدراسة المقارنة للنشاط كيناز اهتمامك. الاختيار الدقيق لكنترول إيجابيةل الذي يحتوي على البروتين نحو النشاط المعروف اهتمامك ، جنبا إلى جنب مع الرقابة السلبية التي من غير المرجح أن phosphorylate الركيزة الخاص المفترضة ، هي قيمة للغاية. عنصر تحكم واحد مرشح لLRRK2 هو التفاعل مستقبلات كيناز 3 ، والذي لديه صلة وثيقة تسلسل الأولية إلى المجال كيناز من LRRK2 ولكن لديها مختلفة تماما بنية المجال العام 18. هذا هو متاح في المؤتلف من البروتين Invitrogen ويستخدم كعنصر تحكم قياسية في مختبرنا. وينبغي أيضا أن يلاحظ أن النموذج متاح تجاريا LRRK2 يفتقر إلى N - محطة من البروتين ، والموسومة ب اكسيداز - S - ترانسفيراز وينبغي أن يؤخذ ذلك في الاعتبار كعامل الخلط المحتملة عند تنفيذ المقايسات كيناز مع هذا البروتين ، كما ليس من المعروف ما هو الدور الذي يمكن للمحطة من N - LRRK2 يلعب في وظيفة طبيعية من هذا البروتين. إذا ، على سبيل المثال ، جزء من محطة N - LRRK2 أن تغيب في البروتين المستخدم في هذا البروتوكولهو أمر حاسم لتجنيد ركيزة معينة إلى المجال كيناز من LRRK2 فهذا سيكون له تأثير كبير على الفسفرة وحظ من قال الركيزة في المختبر في النظام الموصوف أعلاه. حتى مع هذه المحاذير ، ولكن ، على الأهمية التي توليها لبيولوجيا LRRK2 في البحوث باركنسون يسلط الضوء على فائدة هذا البروتوكول بمثابة أداة قيمة للتحقيق في سلوك هذا البروتين في الإعداد في المختبر.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليق </td></tr><tr><td> LRRK2 النوع البري </td><td> Invitrogen </td><td> PV4873 </td><td></td></tr><tr><td> G2019S LRRK2 </td><td> Invitrogen </td><td> PV4881 </td><td></td></tr><tr><td> LRRK2 D1994A </td><td> Invitrogen </td><td> PV6051 </td><td></td></tr><tr><td> كيناز العازلة </td><td> خلية تشوير </td><td> 9802S </td><td></td></tr><tr><td> MBP </td><td> سيغما </td><td> M1891 </td><td></td></tr><tr><td> 32P ز ATP </td><td> بيركن إلمر </td><td> BLU002X500UC </td><td> 500μCi ، 30Ci / mMole </td></tr><tr><td> 4X العازلة LDS عينة </td><td> Invitrogen </td><td> NP0007 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - المركابتويثانول </td><td> سيغما </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> البروتين المعايير </td><td> Invitrogen </td><td> LC5800 </td><td></td></tr><tr><td> اجتماعات الأطراف تشغيل العازلة </td><td> Invitrogen </td><td> NP0001 </td><td></td></tr><tr><td> مكرر تريس هلام الأكريلاميد </td><td> Invitrogen </td><td> NP0321 </td><td> 4-12 ٪ 1MM 10well </td></tr><tr><td> PVDF الغشاء </td><td> ميليبور </td><td> IPVH00010 </td><td></td></tr><tr><td> نقل العازلة </td><td> Invitrogen </td><td> NP0006 </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 1. الكواشف وقد استخدم الماء المقطر وغير المتأينة لجميع الخطوات التخفيف <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> نوع المعدات </td><td> شركة </td><td> تعليق </td></tr><tr><td> عداد غايجر أداة </td><td> آلات صغيرة </td><td></td></tr><tr><td> SDS PAGE دبابات </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> نقل دبابات </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> كتل الحرارة (2) </td><td> إيبندورف </td><td></td></tr><tr><td> الفوسفور الشاشة </td><td> جنرال الكتريك </td><td> يمكن أن تكون بديلا للأشعة السينية الفيلم </td></tr><tr><td> الفوسفور طماجر </td><td> جنرال الكتريك </td><td></td></tr><tr><td> التعرض الكاسيت </td><td> جنرال الكتريك </td><td></td></tr><tr><td> الطرد المركزي </td><td> إيبندورف </td><td></td></tr><tr><td> البرسبيكس التدريع </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1.5ml أنابيب </td><td> VWR </td><td> رأس المسمار مع عصابة O </td></tr></tbody></table> الجدول 2. معدات

assaying the kinase activity of lrrk2 in vitro

يسين كيناز كرر ريتش 2 (LRRK2) هو 2527 عضو من الأحماض الأمينية للأسرة روكو من البروتينات ، والتي تمتلك بنية معقدة متعددة المجالات ، بما في ذلك المجال GTPase (وهو ما يسمى ROC ، على رأس مجمع للبروتينات) والمجال كيناز 1. أدى هذا الاكتشاف في عام 2004 طفرات في LRRK2 التي تسبب مرض باركنسون (PD) في LRRK2 يجري التركيز على الكم الهائل من البحوث في وظيفتها الطبيعية ، وكيف ينتقل هذا البروتين منحرف في حالة المرض 2،3 وركزت التحقيقات الأولية في وظيفة LRRK2 عن أنشطته الأنزيمية 4-6. على الرغم من أن صورة واضحة لم يخرج من التغيير المستمر في هذه بسبب الطفرات ، وقد أبرزت البيانات من عدد من المجموعات على أهمية النشاط كيناز من LRRK2 في موت الخلية مرتبطة 7،8 الطفرات. وذكرت المنشورات الحديثة مثبطات استهداف النشاط كيناز من LRRK2 ، وتوفير أداة رئيسية التجريبية 9-11. في ضوء هذه المعطيات ، فإنهومن المرجح أن خصائص الأنزيمية من LRRK2 تحمل لنا نافذة هامة في البيولوجيا من هذا البروتين ، على الرغم من ما إذا كانت الأهداف المحتملة للدواء باركنسون هو مفتوح للنقاش. وقد تم استخدام عدد من الأساليب المختلفة لفحص النشاط كيناز من LRRK2. في البداية ، وأجريت فحوصات خارج باستخدام بروتين حاتمة الموسومة overexpressed في خطوط خلايا الثدييات وimmunoprecipitated ، مع المقايسات نفذت باستخدام هذا البروتين على أداء وظائفها الخرز agarose 4،5،7. لاحقا ، منقى من شظايا المؤتلف LRRK2 في حل وقد تم أيضا استخدام ، على سبيل المثال جزء من ضريبة السلع والخدمات الموسومة تنقية الخلايا التي تحتوي على مخلفات الحشرات 970-2527 من LRRK2 12. في الآونة الأخيرة ، وآخرون دانيلز وأفادت عزلة LRRK2 طول كامل في حل من خلايا الكلى البشرية الجنينية ، بيد أن هذا البروتين لا يتوفر على نطاق واسع 13. في المقابل ، فإن الانصهار اقتطاع ضريبة السلع والخدمات هو شكل من أشكال LRRK2 المتوفره تجارياه (من Invitrogen ، انظر الجدول رقم 1 للحصول على التفاصيل) ، ويوفر أداة مناسبة ليدل على مقايسة للنشاط كيناز LRRK2. تم الإبلاغ عن نواتج مختلفة للنشاط كيناز LRRK2. Autophosphorylation من LRRK2 نفسها ، الفسفرة من البروتين الأساسي المايلين (MBP) باعتبارها الركيزة كيناز العامة والفسفرة من الركيزة الاصطناعية -- LRRKtide يطلق ، على أساس من الفسفرة ثريونين 558 في Moesin -- وقد استخدمت جميع ، وكذلك سلسلة من ركائز الفسيولوجية المفترضة بما في ذلك α - synuclein ، وMoesin 4 - EBP 14-17. حالة من هذه البروتينات بمثابة ركائز لLRRK2 يزال من غير الواضح ، وعلى هذا النحو المبين أدناه البروتوكول سوف تركز على استخدام MBP باعتبارها الركيزة عامة ، مشيرا الى ان فائدة هذا النظام لفحص النشاط كيناز LRRK2 موجه ضد مجموعة من ركائز المحتملة

Watch this Scientific Journal Video about Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro at JoVE.com

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

يسين كيناز كرر ريتش 2 هو كيناز متعددة المجالات الكبيرة ، والطفرات التي هي السبب الأكثر شيوعا الجينية لمرض الشلل الرعاش. وقد أثبت تحليل للنشاط هذا البروتين كيناز ليكون أداة حاسمة في فهم البيولوجيا واختلال وظيفي في هذا البروتين. في هذه الورقة ،<em&gt; في المختبر</em&gt; معايرة النشاط كيناز من LRRK2 وصفها مجموعة من المسوخ والخمسين ، وتوفير نظام تجريبي لدراسة الفسفرة من ركائز المفترضة وضعف إمكانات LRRK2 في المرض.

يعاير النشاط كيناز من LRRK2 في المختبر</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

assaying-the-kinase-activity-of-lrrk2-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

22.4K Views.  UCL Institute of Neurology. يسين كيناز كرر ريتش 2 هو كيناز متعددة المجالات الكبيرة ، والطفرات التي هي السبب الأكثر شيوعا الجينية لمرض الشلل الرعاش. وقد أثبت تحليل للنشاط هذا البروتين كيناز ليكون أداة حاسمة في فهم البيولوجيا واختلال وظيفي في هذا البروتين. في هذه الورقة ، في المختبر ?...

Video: Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals. Here, we describe an in vitro assay, "the reorientation assay", that has been used extensively to study the effect of extrinsic and intrinsic signals on the orientation of commissural axons2. This assay was developed by numerous people in the laboratories of Jane Dodd, Thomas Jessell and Andrew Lumsden (see acknowledgements for more details) and versions of this assay were used to demonstrate the reorientation activities of key axon guidance molecules, including the BMP chemorepellent in the roof plate3,4 and the chemoattractive activities of Netrin15 and Sonic Hedgehog (Shh)6 in the floor plate in the spinal cord.
Explants comprising 2-3 segments of the dorsal two-thirds of spinal cord are dissected from embryonic day (E) 11 rats and cultured in three dimensional collagen gels7. E11 dorsal spinal explants contain newly born commissural neurons, which can be identified by their axonal expression of the glycoprotein, Tag18. Over the course of 30-40 hours in culture, the commissural axon trajectory is recapitulated in these dorsal explants with a time course similar to that seen in vivo. This axonal trajectory can be challenged by placing either test tissues or a COS cell aggregate expressing a candidate signaling molecule in contact with one of the lateral edges of the dorsal explant. Commissural axons extending in the vicinity of the appended tissue will grow under the influence of both the endogenous roof plate and signals from the ectopic lateral tissue. The degree to which commissural axons are reoriented under these circumstances can be quantified. Using this assay, it is possible both to examine the sufficiency of a particular signal to reorient commissural axons3,4 as well the necessity for this signal to direct the commissural trajectory9.

This assay assesses the ability of a signaling molecule, here Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP7), to reorient commissural axons. An explant of embryonic dorsal spinal cord is cultured adjacent to an aggregate of COS cells secreting the candidate growth factors. Reoriented commissural axons growing within the explant are visualized by immunohistochemistry.

يعاير قدرة إنتشاري جزيئات إشارة إلى إعادة توجيه الجنينية محاور عصبية صواري العمود الفقري

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

رصد كيناز والفوسفاتيز الأنشطة من خلال دورة الخلية التي Ratiometric الحنق

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

الكشف عن مباشرة النشاط خلات تشكيل لأنزيم كيناز خلات

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

يعاير Proteasomal تدهور في نظام خالية من الخلايا في النباتات

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

إعادة إعماره الوظيفية وآخر قناة قياسات تنقية Wildtype والمسخ CFTR البروتين

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

قياس اليرقات آخر في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مراقبة النشاط

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

تحديد أزواج كيناز الركيزة عن طريق فحص إنتاجية عالية


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.