עבודה זו נתמכת בחלק מן המכונים הלאומיים לבריאות גרנט GM-26738 (אל ג&#39;ת).

1. Pak2 Activation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הסכום המתאים מראש נבדק של caspase 3 עד 20 μl של Pak2 12 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במאגר (50 mM טריס-HCl, 150 mM NaCl, ו 2 DTT mM ב-pH 7.5) ו לדגור על 34 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באופן מלא לדבוק ולהפעיל Pak2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את המוצרים המחשוף על ידי SDS-PAGE (10%) ו מכתים Coommassie כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את Pak2 ביקע למאגר הפעלת B (50 מ&quot;מ טריס-HCl, 150 mM NaCl, 15 מ&quot;מ MgCl 2, 10 mM ATP) ב-pH 7.5, ב 20 μl לריכוז סופי של Pak2 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל, ו - דגירה על 34 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להפעיל באופן מלא על ידי Pak2 autophosphorylation ב -8 אתרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר מחשוף מלא Pak2 על ידי הגירה של p34 ו - p27 שברי כפי שנקבע על ידי SDS-PAGE 10. אימות נאות של תנאי autophosphorylation נעשית באמצעות autoradiography בניסוי נפרד באמצעות (32 P) ה-ATP או ספקטרומטריית מסה לזהות phosphopeptides. </li></ol> 2. הזדהותשל פפסין-מתעכל Pak2 שברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של חומצה Trifluroacetic 0.1% (TFA) ב-pH 2.5 לשטוף את חרוזי agarose פעמיים לפני השימוש. ואז, צנטריפוגה דגימות עבור 15 שניות ב XG 2000 כדי להסיר את החרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף Pak2 (20 מיקרוגרם ב 2 μl של 150 mM NaCl, 50 מ&quot;מ טריס-HCl ו - 2 mM DTT ב-pH 7.5) עד 100 μl של TFA 0.1%, ו דגירה המדגם עבור 5 דקות עם 30 μl של פפסין, מצומדות חרוזים agarose . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן בשלב הפוכה HPLC טור C18 עם מערכת ממס העיקרי של TFA 0.1% ב-pH 2.5. לעכל עכלן (50 μl) הוא eluted באמצעות שיפוע ליניארי 100 דקות של 0-80% אצטוניטריל המכיל TFA 0.1% בקצב זרימה של 0.2 ml / min. שברים נאספים כל 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את השברים HPLC עם מהירות-VAC (3 שעות) ו resuspend דגימות בתמיסה של אצטוניטריל (5 μl) ו TFA 0.1% (5 μl) ב-pH 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתחילה, כל שבריר לגילוי פפטידים באמצעות MALDI-TOF PerSeptive Biosystems וויאג&#39;ר STR DE (PE Biosystems, פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה&quot;ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 16 שברים המכיל פפטידים כפופים ספקטרומטריית מסה טנדם באמצעות ספקטרומטר Q-TOF המוני XL QSTAR oMALDI MS / MS לזהות את שברי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף של פפטיד זה מאומת על ידי יונים מוצר שנוצר על ידי ספקטרומטריית מסה בד בבד עם / m z יחסי התיאורטי מבוסס על הרצף הראשוני של Pak2 השימוש באתר חלבון מחפש הזהב ( <a href="http://prospector.ucsf.edu/">http://prospector.ucsf.edu/</a> ) 11. </li></ol> 3. מדידה של Exchange אמיד H / D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את כל הפתרונות הדרושים ריאגנטים H / D החליפין של 25 מעלות בתוך אמבט מים. ה-ATP הוא מומס במים ואת ה-pH מותאם 7.0 לפני השימוש. נוסף 4mm ATP ב 2 D O חיץ היא למנוע ה-ATP ניתק מן Pak2 לאחר דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום H / D החליפין על ידי תוספת של 18 μl של בופר D 2 O (50 mM מגבים pH 6.98, 125 mM NaCl) כדי μl 2 (20 מיקרוגרם) של Pak2 במאגר המכיל 150 mM NaCl, 50 מ&quot;מ טריס-HCl (pH 7.5) ו 2 DTT מ&quot;מ, וכתוצאה מכך רמת Pak2 של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו - pH של 7.0 ב 0 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות בשלושה עותקים בחילופי H / D עבור 0, 0.5, 1, 3, 5, ו - 10 דקות, או 24 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את תהליך H / D החליפין על ידי הוספת 180 μl של TFA קר כקרח 0.1% ב-pH 2.2, אשר מביאה את ה-pH עד 2.5 בנפח סופי של 200 μl. עבור דגימות המכילות ATP, 180 μl של TFA קר כקרח 0.11% ב-pH 2.2 משמש כדי לשמור על pH ב 2.5 במצב הרווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף aliquot (100 μl) של המדגם כל הרווה ל μl 30 של הפעיל פפסין-מצומדות חרוזים agarose. העיכול פפסין מותר להמשיך על קרח דק חמש דוגמאות vortexed כל 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את מערכת העיכול על ידי צנטריפוגה של המדגם עבור 15 שניות XG ב 5000 ב 4 ° C כדי להסיר את פפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות ההקפאה דגימות נוזלי N 2 ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 2לפני ניתוח MALDI-TOF ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטריצה ​​עבור MALDI הוא 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של α-cyano-4-hydroxycinnamic חומצה (CHCA) המומסים בתמיסה (1:01:01) של אתנול אצטוניטריל, TFA ו 0.1% ב-pH 2.5 והחזיק ב 0 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקית להפשיר כל מדגם במהירות לערבב 1 μl של כל דגימה עם μl 1 של מטריקס במקום על צלחת 4 ° C MALDI היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת ואקום בינוני עד הצלחת לייבש את נקודות ב 30 שניות לפני ניתוח MALDI-TOF. הזמן בין הפשרת המדגם ואחזור הספקטרום הוא כ 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת MALDI-TOF המוני ספקטרום עם STR PerSeptive Biosystems DE וויאג&#39;ר. רכישת נתונים בקצב של 2 GHz דגימה ב 100.000 ערוצי נתונים, עם מתח 20000-V מואצת, וכן מתח רשת 65% באמצעות מיצוי מתעכב עם עיכוב של 180 ns דופק. מאה סריקות הם בממוצע תוך 2 דקות. המכשיר MALDI-TOF אינו מוגבל כל מותג או כל תוכנה מיוחדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Data Explorer 4.0 תוכנית מחשב calculאכלו את deuteration של כל קטע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב החליפין בחזרה מבוסס על היחס בין מספר deuteron בפועל שולבו ב 24 שעות של H / D חילופי מחולק כל האתרים חליפי אפשרי, שהם עמוד השדרה למעט ואימידים אמיד N-הטרמינל (איור 1). </li></ol> 4. נציג תוצאות: מחשוף caspase ו autophosphorylation מאומתים על ידי מכתים Commassie SDS-PAGE. Pak2 פעילה היא להקה אחת של 58 kDa. המחשוף של caspase Pak2 תושלם, מייצרת שני שברים, p27 ו - p34 אשר נודדים בנפרד. ההגירה של p27 ו - p34 מראה autophosphorylated חפיפה על הג&#39;ל עקב הגירה של מפגר בקטע p27 phosphorylated במלואו (איור 2). H / D ניסויים החליפין מתבצעות מספר פעמים בין 0 ל 10 דק &#39;(איור 3). כדוגמה, את מהלך הזמן ההתאגדות דאוטריום לתוך m / ZPeak של 1,697.85 Pak2 פעיל מורכב פסגות איזוטופי מרובים כפי שמוצג על ידי שינוי של המעטפה המונית לאורך זמן. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig1.jpg" /> באיור 1. משוואה לחישוב deuteration. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig2.jpg" /> באיור 2. Autophosphorylation ו מחשוף caspase של Pak2. Caspase-ביקע Pak2 (הנתיב השמאלי), Pak2 פעיל שלם (באמצע הנתיב) ו caspase-ביקע Pak2 autophosphorylated (נתיב ימין) נותחו על ידי SDS-PAGE ו מכתים Coommassie כחול. מעובד מתוך הסו, י.ח. ואח&#39; 2. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig3.jpg" /> באיור 3. הספקטרום המוניים כמובן זמן ההתאגדות דאוטריום עבור Pak2 פעיל. Pak2 פעילה היה נתון H / D exchange דקות 0-10 ונותחו על ידי MALDI-TOF. דוגמה של חלוקת איזוטופי מורחבת של MALDI-TOF של שיא m / z 1,697.85 במהלך תקופה של H / D חילופי מוצג. קו מקווקו אדום מציין את הממוצע של המעטפה המונית במשמרת של המעטפה מציגה את ההמונים deuteration של פפטיד.

<ol>
	<li>Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amide+H/2H+exchange+reveals+communication+between+the+cAMP+and+catalytic+subunit-binding+sites+in+the+R(I)alpha+subunit+of+protein+kinase.">Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase.</a> A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).</li><li>Hsu, Y. H., Johnson, D. A., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+conformational+changes+during+activation+of+protein+kinase+Pak2+by+amide+hydrogen/deuterium+exchange.">Analysis of conformational changes during activation of protein kinase Pak2 by amide hydrogen/deuterium exchange.</a> J. Biol. Chem. 283, 36397-36405 (2008).</li><li>Englander, S. W., Kallenbach, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+exchange+and+structural+dynamics+of+proteins+and+nucleic+acids.">Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids.</a> Q. Rev. Biophys. 16, 521-655 (1983).</li><li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry.">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass. Spectrom. 5, 214-217 (1991).</li><li>Dennis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localizing+the+membrane+binding+region+of+Group+VIA+Ca2+-independent+phospholipase+A2+using+peptide+amide+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Localizing the membrane binding region of Group VIA Ca2+-independent phospholipase A2 using peptide amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 284, 23652-23661 (2009).</li><li>Hsu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+binding+rigidifies+the+C2+domain+and+the+intradomain+interaction+of+GIVA+phospholipase+A2+as+revealed+by+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).</li><li>Lee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+hPAK65+by+caspase+cleavage+induces+some+of+the+morphological+and+biochemical+changes+of+apoptosis.">Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).</li><li>Rudel, T., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+and+morphological+changes+in+apoptotic+cells+regulated+by+caspase-mediated+activation+of+PAK2.">Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2.</a> Science. 276, 1571-1574 (1997).</li><li>Roig, J., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytostatic+p21+G+protein-activated+protein+kinase+gamma-PAK.">Cytostatic p21 G protein-activated protein kinase gamma-PAK.</a> Vitam. Horm. 62, 167-198 (2001).</li><li>Walter, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+and+activation+of+p21-activated+protein+kinase+gamma-PAK+by+CPP32+(caspase+3).+Effects+of+autophosphorylation+on+activity.">Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity.</a> J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).</li><li>Clauser, K. R., Baker, P., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+accurate+mass+measurement+(+/-+10+ppm)+in+protein+identification+strategies+employing+MS+or+MS/MS+and+database+searching.">Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching.</a> Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

זיהוי פפסין-מתעכל שברי הוא שלב קריטי של הניסוי חילופי H / D. זיהוי שגוי של הפפטיד יכול להוביל למסקנה שגויה. Pak2 פפסין, הוא מתעכל eluted דרך טור הפוך שלב HPLC C18 כדי לקבל רקע נקי. בניסויים שלנו, סך של 40 שברים נאספו נתונים MALDI-TOF. פפטידים מרובות ניתן לזהות בכל אחד החלקים. פפטידים היו נתונים טנדם ספקטרומטריית מסה (Q-TOF MS / MS ו oMALDI MS / MS) כדי לזהות רצפים שלהם. ספקטרום MS / MS של פפטיד צריך לפחות שלוש יונים מוצר כדי לאשר את הזיהוי של הפפטיד. סייר נתוני התוכנית 4.0 המחשב (Applied Biosystems) מבצעת את תיקון הבסיס הראשוני סינון רעש. כל הספקטרום צריך להיות מכויל מבוסס על שתי פסגות רצף. אנו לכייל ספקטרום שלנו על ידי המסה התיאורטית של מ undeuterated / z שהם 923.45 ו - 1697.84. Tהוא דיוק המוני אחרי כיול יכול להגיע 10 עמודים לדקה. עם deuteration, מונו איזוטופ עשוי לעבור מסה גבוהה יותר. מגביר צעד לפירוק היחסים הללו כדי m / z הניב את ההמונים משופרת הקשורים deuteration. עוצמות השיא של המעטפה המונית לא ישפיע על רמת deuteration. עם זאת, עוצמות השיא של פסגות איזוטופי במעטפה מסה מסוימת הם קריטיים לחישוב מסת הממוצע. הצעד הראשון של החישוב של deuteron שולבו היא הפחתת מסת פפטיד של המדגם הלא deuterated מן המדגם deuterated. שלושה גורמים אחרים, דילול D 2 O, deuterons שיורית רשתות לוואי החליפין לאחור, יהיה צורך לשקול נוספת בחישוב (איור 1). דילול 2 O D הוא גורם לדילול של D 2 O לאחר ערבוב המדגם ו-D 2 O חיץ ליזום את H / D החליפין. Deuteron שיורי (4.5%) ב שרשראות צד של עכלן לעיכולפפטידים עורך צריך להיות מופחתים. בחזרה לבורסה הוא אובדן בלתי נמנעת של deuteration בכל פפטידים deuterated ו-עכלן מתעכל בתהליך מדידה המונית. הפפטיד נגיש ממס ביותר (m / z = 1105.60) אחרי שעה של H-24 / D חילופי מייצג אזור deuteration מלא. מספר deuteron משולבים עבור כל אחד פפטידים ההבדל בין centroid של פפטידים deuterated ולא deuterated פפטי Pak2. הפפטיד ביותר deuterated ביותר מ / z 1105 נבחרה לייצג deuteration מלא כאשר Pak2 היה 24 שעות של H / D החליפין. יחס חליפין חזרה חושבה לפי מספר deuteron בפועל שולבו ב 24 שעות של H / D חילופי מחולק כל האתרים חליפי אפשרי פפטיד m / z 1105.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> אלדריץ&#39; </td><td> 7789-20-0 </td><td></td></tr><tr><td> α-cyano-4-hydroxycinnamic חומצה </td><td> סיגמא </td><td> 28166-41-8 </td><td></td></tr><tr><td> MALDI-TOF </td><td> PE Biosystems </td><td> וויאג&#39;ר STR DE </td><td></td></tr><tr><td> Q-TOF המוני ספקטרומטר </td><td> Q-TOF Ultima-Global </td><td></td><td></td></tr><tr><td> QSTAR XL oMALDI MS / MS </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Data Explorer 4.0 תוכנת מחשב </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td></td></tr&gt; </tbody></table>

amide hydrogen/deuterium exchange &amp; maldi-tof mass spectrometry analysis of pak2 activation

חילופי אמיד מימן / דאוטריום (H / D החליפין) יחד עם ספקטרומטריית מסה כבר בשימוש נרחב על מנת לנתח את הממשק של אינטראקציות בין חלבונים, שינויי קונפורמציה בחלבון, הדינמיקה חלבון וחלבון-אינטראקציות ליגנד. H / D החליפין על עמדות אמיד עמוד השדרה נוצל כדי למדוד את שיעורי deuteration של מיקרו אזורים בחלבון על ידי ספקטרומטריית מסה 1,2,3. הרזולוציה של שיטה זו תלויה העיכול פפסין של החלבון deuterated עניין לתוך פפטידים, כי בדרך כלל בטווח 3-20 שאריות. למרות ההחלטה של ​​H / D חילופי נמדד על ידי ספקטרומטריית מסה נמוכה יותר ברזולוציה שאריות אחד נמדד לפי שיטת Heteronuclear יחיד קוונטית (HSQC) קוהרנטיות של התמ&quot;ג, המדידה ספקטרומטריית מסה ב-H / D החליפין אינו מוגבל על ידי גודל של חלבון 4. H / D החליפין מתבצע בתמיסה מימית אשר שומרת קונפורמציה בחלבון. אנו מספקים שיטה utilizes MALDI-TOF לגילוי 2, במקום HPLC / ESI (יינון electrospray)-MS מערכת 5,6. MALDI-TOF מספק נתונים מדויקים עוצמת המסה של פפטידים של חלבון מתעכל, בכל מקרה זה חלבון קינאז Pak2 (המכונה גם γ-Pak). Proteolysis של 2 פאק מתבצע העיכול פפסין מקוון. זו שיטה חלופית, כאשר המשתמש אין גישה לעמודה HPLC ו עכלן המחובר ספקטרומטריית מסה, או כאשר העמודה עכלן על HPLC אינו תוצאה של המפה לעיכול אופטימלי, למשל, בכבדות דיסולפיד-מלוכדות מופרש phospholipase 2 (SPLA 2). ניצול שיטה זו, אנו מצליחים לעקוב שינויים ברמת deuteration במהלך ההפעלה של Pak2 ידי מחשוף 3 caspase ו autophosphorylation 7,8,9.

Watch this Scientific Journal Video about Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation at JoVE.com

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה נוצל בהצלחה כדי לפקח על חילופי אמיד מימן / דאוטריום בהפעלת חלבון kinase Pak2.

אמיד מימן / דאוטריום Exchange &amp; MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית ניתוח של הפעלת Pak2

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

amide-hydrogendeuterium-exchange-maldi-tof-mass-spectrometry-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

17.7K Views.  Tunghai University. MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה נוצל בהצלחה כדי לפקח על חילופי אמיד מימן / דאוטריום בהפעלת חלבון kinase Pak2.

Video: Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

ניתוח מערכות חלבון גדול על ידי ספקטרומטריית מסה מבנית

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

גל T-Ion Mobility-ספקטרומטריית מסה: הפרוצדורות בסיסי לניתוח חלבונים מורכבים

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

ניתוח ישיר של תאים בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה בלחץ אטמוספרי

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

פרופיל Proteome חיזור תיאול באמצעות תיוג איזוטופ ספקטרומטריית מסה

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA)

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, strain levels. Commercially available and open source software tools have been developed to facilitate identification; however, no universal/standardized data analysis pipeline has been described in the literature. Here, we provide a comprehensive and detailed demonstration of bacterial identification procedures using a MALDI-TOF mass spectrometer. Mass spectra were collected from 15 diverse bacteria isolated from Kartchner Caverns, AZ, USA, and identified by 16S rDNA sequencing. Databases were constructed in BioNumerics 7.1. Follow-up analyses of mass spectra were performed, including cluster analyses, peak matching, and statistical analyses. Identification was performed using blind-coded samples randomly selected from these 15 bacteria. Two identification methods are presented: similarity coefficient-based and biomarker-based methods. Results show that both identification methods can identify the bacteria to the species level.

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment Kartchner Caverns, AZ, USA

This work details procedures for rapid identification of bacteria using MALDI-TOF MS. The identification procedures include spectrum acquisition, database construction, and follow up analyses. Two identification methods, similarity coefficient-based and biomarker-based methods, are presented.

השימוש בMALDI-TOF המוני ספקטרומטריית ומסד נתונים מותאמים אישית לאפיון חיידקים ילידים למערת סביבה ייחודית (Kartchner מערות, AZ, ארה&quot;ב)

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

תגובה נבחרת ניטור ספקטרומטריית מסה לכימות חלבון מוחלט

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

העשרה תאית מטריקס חלבונים מרקמות ועיכול לפפטידים לניתוח ספקטרומטריית המסה

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

יישומים של-הבדיקה הבודדה: הדמיה ספקטרומטריית מסה וניתוח תא יחיד בתנאי הסביבה

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

Workflow השלם עבור ניתוח שלאחר translational שינויים היסטון שימוש מלמטה למעלה ספקטרומטריית מסה: מתוך הפקת היסטון כדי ניתוח נתונים

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...