ويدعم هذا العمل من جانب NHMRC برنامج منح # 568969 (PSS) وكلية الطب في جامعة نيو ساوث ويلز، الجذعية مبادرة الخليوي (KSS).

وتتم كافة الإجراءات أدناه، باستخدام تقنيات التعقيم داخل مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية. وترد الكواشف والمعدات المستخدمة في الجداول أدناه. 1. إعداد الجيني 1.1٪ (W / V) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.275 غرام من تنقية الجينات الصوديوم (نسبة عالية من حامض الغلوكورونيك ≥ 60٪، واللزوجة&gt; 200 ميغاباسكال ثانية، والذيفان الداخلي في الاتحاد الأوروبي ≤ 100 / غ) في أنبوب معقم 50 مل و 25 مل اضافة معقم حل الجيلاتين 0.1٪ أعدت في وقت سابق (0.5g gelatin/500 مل ملي س H 2 O وحلت عن طريق جهاز الأوتوكليف). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة الأنبوب لمدة 30 ثانية تقريبا إلى حل جزء من مسحوق الجينات ثم ضع أنبوب على خلاط المدار في 10 XG ليلة وضحاها (درجة حرارة الغرفة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2.778 مل من كلوريد الصوديوم العقيمة 9٪ (4.5 غرام من NaCl/50 مل ملي س O 2 H) إلى 25 مل من محلول الجينات. دوامة الأنبوب لمدة 30 ثانية تقريبا تلاه الطرد المركزي في 95 XG لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين حل الجينات في 4 درجات؛ مئوية لمدة قصيرة الأجل للتخزين (1-2 أشهر) أو عند -20 درجة مئوية لمدة طويلة الأجل تخزين (حوالي سنة). </li></ol> 2. إعداد حمام CaCl الأمطار 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 14،7 غرام من CaCl 2. 2H O 2 و 2،38 غرام من HEPES في 1 لتر من ملي س O. 2 H </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط مستوى الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم حل باستخدام فلتر ميكرون 0.22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تخزين حمام هطول الأمطار في درجة حرارة الغرفة (6-12 شهرا). </li></ol> 3. إعداد Decapsulating الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 500 مل من الفوسفات Dulbecco ومخزنة المالحة (D-PBS)، إضافة 50 مل من EDTA 0.5M و 5 مل من HEPES 1M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم باستخدام فلتر ميكرون أو 0.22 في الأوتوكلاف 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين حل decapsulating في درجة حرارة الغرفة (6-12 شهرا). </li></ol> 4. إعداد مصل متوسطة (ريال) مع تبديل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التغليف، وإعداد ريال المتوسطة مقدما كما ديscribed في جدول معين الكواشف والمعدات. </li></ol> 5. إعداد المانع روك (Y-27632) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع Y-27632 مسحوق 0.1٪ في الإنسان مصل (HSA) في مد برنامج تلفزيوني لتقديم حل 5 ملم. </li></ol> 6. إعداد hESC للتغليف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل علاج الخلايا مع وسائل الاعلام زراعة تستكمل مع 10 ميكرون من المانع روك (RI) لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية (حماية من الضوء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد العلاج RI، غسل الخلايا مع D-PBS مرتين وطرد الخلايا من لوحات ثقافة إنزيمي مع accutase لمدة 10 دقيقة في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشط بلطف الخلايا مع مكشطة ماصة أو خلية، وجمع في أنبوب 15 مل. تحييد accutase مع ريال المتوسطة في نسبة 1:1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد تعليق خلية واحدة، تصفية الخلايا تحييدها باستخدام فلتر ميكرون 40 وجمع في 50 مل أنبوب جديد للطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد الخلايا في حل باستخدام عدادة الكريات. </لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> منبذة تعليق خلية 95 XG لمدة 5 دقائق والتخلص بعناية وطاف بعد ذلك. غسل الخلايا مع مرحلة ما قبل حرارة كلوريد الصوديوم 0.9٪. منبذة 95 XG لمدة 5 دقائق والتخلص من طاف. </li></ol> 7. التغليف من خلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير حقنة 1 مل تعلق على أنابيب من البلاستيك اللين من 14G × 2 قسطرة الرابع &quot;. هذا وتستخدم لنضح تعليق الخلية إلى أن يتم تحميل إلى ضخ حقنة كما هو موضح في الشكل رقم 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا مع حل الجينات ما قبل حرارة في مناطق ذات كثافة 1.25 مليون خلية / مل الجينات. مزيج بلطف مع المحقنة وتجنب خلق الفقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مولد حبة، مضخة الحقن ومتر تدفق الهواء كما هو مبين في الشكل رقم 1. وترد المزيد من التفاصيل عن هذه الأجهزة في جدول معين الكواشف والمعدات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الخلايا يستنشق في المحاقن، وتجاهل أنابيب بلاستيكية للقسطرة الرابع وتعلق المحقنة إلى آلة التغليف. تأكد من أن هناك فجوة 10 سم يكون<html> توين نهاية آلة التغليف، وجمع نقطة كما هو مبين في الشكل رقم 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغلف الخلايا من خلال وضع مضخة الحقن في 20 مل / ساعة، ومعدل تدفق الهواء بنسبة 8 لتر / دقيقة، وضغط 100 كيلو باسكال (يمكن تغيير حجم من الكبسولات عن طريق تغيير معدل تدفق الهواء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا مغلفة في طبق بيتري (100 × 15 مم) مملوءة 20 مل من حمام هطول الأمطار ما قبل حرارة لمدة 7 دقائق لتحقيق الاستقرار في كبسولات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا مغلفة بواسطة طموح لطيف إلى 50 أنابيب الطرد المركزي مل مليئة 20 مل من 0.9٪ كلوريد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للكبسولات ليستقر في قاع الأنبوب ثم تجاهل بلطف وطاف. تكرار عملية غسيل مع كلوريد الصوديوم 0.9٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا مغلفة في المتوسط ​​زراعة ما قبل حرارة تستكمل مع ري (10 ميكرومتر)، ونقل إلى قارورة الثقافة وحضنت في درجة حرارة 37 م / 5٪ CO 2. </li></ol> 8. تمايز hESC مغلف إلى الخلايا العصبية DA ve_content &quot;&gt; وتعالج hESC مغلفة مع منظمة التأهيل الدولي لمدة 3 أيام قبل التمايز. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور خط الماوس الخلية اللحمية، PA6 خلايا في مناطق ذات كثافة من 1.0 X 10 4 لكل سم 2 في 0.1٪ الجيلاتين المغلفة T75 قارورة وحالة الخلايا PA6 في المتوسط ​​DA التمايز العصبية (مواد الجدول) قبل 24 ساعة من التمايز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الكبسولات إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل، وتمكينهم من الاستقرار في الجزء السفلي من أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف وresuspend الكبسولات في PA6 المتوسطة DA خلية مكيفة التمايز العصبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة hESC مغلفة مع أحادي الطبقة خلية PA6 (9 × 10 6 hESCs لكل 7.5 × 10 خلايا PA6 5) لمدة 28 يوما مع وجود تغيير وسائل الإعلام في يوم (4) ومرة كل يومين بعد ذلك (تغيير سوى نصف المتوسط ​​في كل مرة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 3 أسابيع في الثقافة مع PA6 الخلايا، واستكمال DA متوسطة التمايز العصبية مع 100 نانوغرام / مل SHH و 100 نانوغرام / مل FGF8a للاسبوع المتبقية. </لى&gt; </ol> 9. نزع المحفظة من hESC مغلف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الكبسولات في أنبوب الطرد المركزي 15 مل، والسماح لهم لتسوية في الجزء السفلي من الأنبوب. تجاهل ثم طاف بعناية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الكبسولات مع D-PBS مرتين. السماح للكبسولات تسوية في الجزء السفلي من الأنبوب ثم إزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل decapsulating حل للكبسولات. مزيج دقيق من خلال تعليق طموح قبل حضانة في درجة حرارة الغرفة لدقائق 4-5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منبذة الخلايا decapsulated في 95 XG لمدة 3 دقائق والتخلص من طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه الخلية مع D-PBS تليها الطرد المركزي في 95 XG لمدة 3 دقائق. كرر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن للخلايا decapsulated مزيد من مثقف باعتباره أحادي الطبقة أو استخدامها لتحليل اتجاه مجرى النهر. </li></ol> 10. ممثل النتائج القطر من كبسولات رقيقة جدا الجينات هي ميكرون 400-500. وكان عدد الخلايا داخل كبسولة estimatإد عن طريق حساب عدد الخلايا مقسوما على عدد من الكبسولات في المدى. ولذلك، قدر ما يقرب من 5.0 X 10 4 خلايا لكل كبسولة. من هذا، فإننا نفترض أن الحد الأقصى لعدد خلايا الكبسولة يمكن أن تحتوي على ما يقرب من 1.0 X 10 5. جدوى hESC مغلفة هو&gt; 80٪ (الشكل 2) على النحو الذي تحدده باستخدام باستخدام carboxyfluorescein ثنائي الأسيتات استر succinimidly (CFDA) / propidium يوديد (PI) فحص. وقد الأمثل نحن شروط التغليف hESC من خلال خفض تركيز الجينات من 2.2٪ الى 1.1٪ وذلك بتغيير حمام هطول الأمطار من كلوريد الباريوم إلى كلوريد الكالسيوم. من هذه الشروط، ونحن فقط اظهرت ان الخلايا التي كانت مغلفة مع الجينات الكالسيوم 1.1٪ ويمكن البقاء على قيد الحياة، تتكاثر وتشكل EBS في المختبر 1. زيادة الاستخدام الأمثل للحالة، وآثار وسائل الاعلام والتثقيف RI، وقد تم التحقيق Y-27632. البيانات كما وردت في الشكل رقم 2 و 3 تثبت أن prevente RIد التفكك التي يسببها موت الخلايا المبرمج والحفاظ على بقاء الخلية وتعزيز تشكيل كتلة 1،6 وعلاوة على ذلك، وكان بقاء hESC مغلفة مثقف في ري + HFF-CM أعلى بكثير من غيرها من الجماعات دون مكملات RI، ولكن هذا لم يكن مختلفا إلى حد كبير في hESC مغلفة مثقف في ري + ريال. وبالمثل، وزيادة انتشار الخلايا باستخدام BrdU فحص من 25٪ إلى 75٪ كما الخلايا واحدة وضعت في مجموعات (الشكل 3). وكشف فحص موت الخلايا المبرمج من قبل TUNEL أن الخلايا وحيدة في كبسولات رقيقة جدا مثقف في وسط ريال كانت أفكارك (البيانات لا تظهر) في حين أن المجموعات التي تم استردادها من CM-HFF كانت سلبية في معظمها لTUNEL. إلى حد ما، HFF-CM تستكمل مع bFGF روجت أيضا بقاء وانتشار hESCs مغلفة في غياب Y-27632. ومع ذلك، والعلاج مع Y-27632 قبل (2 ساعة) وبعد التغليف (للحصول على 4 أيام إضافية) تعزيز الجدوى بشكل ملحوظ، والانتشار، وتشكيل كتلة من hESC مغلفة1.1٪ في كبسولات ألجينات الكالسيوم. أظهرت سابقا نحن يمكن hESC مغلفة متباينة بنجاح إلى الأديم الباطن نهائي 1. هنا، درسنا تطبيق التغليف خلية كمنصة 3D للتمييز hESC مغلفة في الخلايا العصبية DA. وكانت hESC، التي شكلت هيئات مضغي الشكل (EB) في كبسولات مباشرة متباينة، وعلى نزع المحفظة وفقا للشروط المذكورة أظهرت التشكل التدريجي العصبية (الشكل 4) بعد 2-3 أيام من الثقافة مع بقاء أكثر من 90٪. وأظهر تحليل الجينات التعبير 1 أسفل تنظيم علامة المحفزة، بينما OCT4 علامة neuroprogenitor، PAX6 وDA علامة العصبية، TH كانت تصل للتنظيم بعد 7 أيام من التمييز (الشكل 5A). وكشفت تلطيخ مناعي أن hESC متباينة كانت PAX6 إيجابية (&gt; 80٪)، ولكن OCT4 السلبية في يوم واحد 7. وأظهرت hESC متباينة مزيد TH-إيجابية (&gt; 90٪) الخلايا العصبية بعد 21 يوما (الشكل 5B). الغربية لطخة تحليل وأظهرت أيضاما يصل التنظيم والتعبير TH من يوم 14 (الشكل 5C) في حين انخفض PAX6 التعبير، ينظم بعد 21 يوما. وبالمقارنة، فإن الخلايا المزروعة تحت بيئة ثنائية الأبعاد (2D) في ظل ظروف مماثلة (مثل ري ما قبل المعالجة لمدة 2 ساعة، ومنظمة الروتاري الدولية في مرحلة ما بعد العلاج لمدة 3 أيام قبل التمايز) حافظت على نسبة عالية من الخلايا PAX6 إيجابية (&gt; 80 ٪) خلال فترة التمايز ولم تكن فعالة كما هو الحال في التفريق إلى TH-إيجابية الخلايا (&lt;60٪) كما هو الحال في بيئة 3D التي تقدمها التغليف (الشكل 5A وجيم).

<ol>
	<li>Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+microcapsule+for+propagation+and+directed+differentiation+of+hESCs+to+definitive+endoderm.">Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm.</a> Biomaterials. 31, 505-514 (2010).</li><li>Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+encapsulated+embryonic+stem+cells+after+transplantation.">Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation.</a> Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).</li><li>Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+benefit+of+human+embryonic+stem+cell+encapsulation+for+prolonged+feeder-free+maintenance.">The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance.</a> Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).</li><li>Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+for+stem+cell+differentiation.">Biomaterials for stem cell differentiation.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).</li><li>Orive, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+encapsulation:+promise+and+progress.">Cell encapsulation: promise and progress.</a> Nat. Med. 9, 104-107 (2003).</li><li>Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li><li>Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled,+scalable+embryonic+stem+cell+differentiation+culture.">Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture.</a> Stem Cells. 22, 275-282 (2004).</li><li>Drukker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+expression+of+MHC+proteins+in+human+embryonic+stem+cells.">Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).</li><li>Calafiore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+Technical+Procedures+for+Microencapsulation+of+Human+Islets+for+Graft+into+Nonimmunosuppressed+Patients+With+Type+1+Diabetes+Mellitus.">Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus.</a> Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).</li><li>Cho, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).</li><li>Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+stromal-derived+inducing+activity+in+the+generation+of+dopaminergic+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).</li></ol>

ليس لدينا ما يكشف.

وقد أثبتت العديد من الدراسات التي تستخدم الخلايا الجذعية الجنينية وhESC فوائد نظام ثقافة 3D في المواد الحيوية وهندسة الأنسجة 2،3. كنا كبسولات ألجينات الكالسيوم ومنصة 3D مناسبة لدراسة انتشار hESC والتمايز مقارنة الجينات الباريوم منذ hESC أظهرت ارتفاع كبير جدوى عندما م?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> ملاحظات </td></tr><tr><td> الجينات (Pronova UP MVG) </td><td> NovoMatrix </td><td> 4200101 </td><td> نسبة عالية من حامض الغلوكورونيك ≥ 60٪، واللزوجة&gt; 200 ميغاباسكال ثانية، والذيفان الداخلي &lt;100 الاتحاد الاوروبي / ز </td></tr><tr><td> الجيلاتين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> G1890-100G </td><td></td></tr><tr><td> 0.9٪ كلوريد الصوديوم </td><td> باكستر للرعاية الصحية </td><td> AHF7123 </td><td></td></tr><tr><td> نوع J1 حبة مولد </td><td> Nisco الهندسية المحدودة </td><td> SPA-0447 </td><td></td></tr><tr><td> متعددة فيزر حقنة مضخة </td><td> عصر جديد مضخة نظم المؤتمر الوطني العراقي </td><td> نموذج NE-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Ezi تدفق مقياس الجريان الطبية </td><td> جاسكون أنظمة</td><td> G0149 </td><td></td></tr><tr><td> Y-27632 </td><td> ميرك </td><td> 688000 </td><td></td></tr><tr><td> مصل الإنسان الزلال </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A4327-1G </td><td></td></tr><tr><td> Accutase </td><td> ميليبور </td><td> SCR005 </td><td></td></tr><tr><td> 14G × 2 قسطرة الرابع &quot; </td><td> شركة Terumo </td><td> SR-OX1451C </td><td></td></tr><tr><td> خروج المغلوب، DMEM </td><td> إينفيتروجن </td><td> 10829-018 </td><td> لريال المتوسطة (القاعدية) </td></tr><tr><td> GlutaMAX-I </td><td> إينفيتروجن </td><td> 35050-061 </td><td> لريال المتوسطة (2 مم) </td></tr><tr><td> تبديل خروج المغلوب المصل </td><td> إينفيتروجن </td><td> 10828-028 </td><td> لريال المتوسطة (20٪) </td></tr><tr><td> البنسلين الستربتوميسين </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15070063 </td><td> لريال المتوسطة (2.5 يو / مل) </td&gt; </tr><tr><td> الانسولين ترانسفيرين، السيلينيوم (ITS) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 41400045 </td><td> لريال المتوسطة (1X) </td></tr><tr><td> β-المركابتويثانول </td><td> إينفيتروجن </td><td> 21985-023 </td><td> لريال المتوسط ​​(0.1 ملم) </td></tr><tr><td> MEM NEAA الحل </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11140-050 </td><td> لريال المتوسطة (5 ملم) </td></tr><tr><td> غلاسكو متوسطة الأساسية الدنيا </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11710035 </td><td> لDA متوسطة التمايز العصبي (القاعدية) </td></tr><tr><td> تبديل خروج المغلوب المصل </td><td> إينفيتروجن </td><td> 10828-028 </td><td> لDA متوسطة التمايز العصبية (10٪) </td></tr><tr><td> الصوديوم البيروفات </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11360070 </td><td> لDA متوسطة التمايز العصبي (1 ملم) </td></tr><tr><td> MEM NEAA الحل </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11140-050 </td><td> لدا نeural متوسطة التمايز (0.1 ملم) </td></tr><tr><td> β-المركابتويثانول </td><td> إينفيتروجن </td><td> 21985-023 </td><td> لDA متوسطة التمايز العصبية (0.1 ملم) </td></tr><tr><td> القنفذ الصوتي (SHH) </td><td> R &amp; D أنظمة </td><td> 1314-SH-025/CF </td><td> لDA التمايز العصبية (100 نانوغرام / مل) </td></tr><tr><td> نمو الخلايا الليفية 8A عامل (FGF8a) </td><td> R &amp; D أنظمة </td><td> 4745-F8-050 </td><td> لDA التمايز العصبية (100 نانوغرام / مل) </td></tr></tbody></table>

alginate microcapsule as a 3d platform for propagation and differentiation of human embryonic stem cells (hesc) to different lineages

الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) آخذة في الظهور كمصدر بديل جذاب لعلاج استبدال الخلية حيث يمكن التوسع فيها في الثقافة إلى أجل غير مسمى ومتباينة إلى أي نوع من أنواع الخلايا في الجسم. وتم أيضا أنواع مختلفة من المواد الحيوية المستخدمة في مزارع الخلايا الجذعية لتوفير المكروية محاكاة المتخصصة الخلايا الجذعية 1-3. وهذا الأخير هو هام لتعزيز الخلية الى خلية التفاعل، وتكاثر الخلايا، وتمايز في الأنساب محددة، فضلا عن تنظيم الأنسجة عن طريق توفير ثلاثي الأبعاد (3D) البيئة (4) مثل التغليف. مبدأ التغليف الخلية ينطوي انحباس الخلايا الحية داخل حدود شبه منفذ الأغشية في الثقافات 3D 2. هذه الأغشية تسمح لتبادل الاوكسجين والمغذيات والمحفزات عبر الأغشية، في حين يتم استبعاد الأجسام المضادة والخلايا المناعية من المضيف أن تكون أكبر من حجم المسام كبسولة 5. هنا، نحن مسبقاأرسلت نهجا للثقافة وتفرق hESC DA الخلايا العصبية في المكروية 3D باستخدام كبسولات الجينات. عدلت نحن شروط ثقافة 2 إلى تعزيز جدوى hESC مغلفة. أظهرنا سابقا أن إضافة ملفوف لفائف p160-رو المرتبطة المانع (روك) كيناز، Y-27632 والبشرية الجنين الليفية مكيفة المتوسطة استبدال المصل (HFF-CM) إلى منصة 3D تعزز إلى حد كبير جدوى hESC مغلفة الذي أعرب فيه خلايا نهائي الجينات علامة الأديم الباطن 1. وقد استخدمنا الآن هذه المنصة 3D لنشر التفرقة hESC وفعالة لالخلايا العصبية DA. تحليل التعبير الجيني البروتين وبعد المرحلة النهائية من تمايز الخلايا العصبية DA أظهرت تعبير زيادة هيدروكسيلاز التيروزين (TH)، وهي علامة للحصول على الخلايا العصبية DA،&gt; 100 طيات بعد 2 أسابيع. افترضنا أن لدينا منصة 3D باستخدام كبسولات الجينات قد تكون مفيدة لدراسة انتشار الأسلحة النووية والموجهة التمايزمن hESC إلى مختلف الأنساب. هذا نظام 3D كما يسمح الفصل بين الخلايا المغذية من hESC خلال عملية التمايز، وأيضا احتمالات العزلة المناعة خلال زرع في المستقبل.

Watch this Scientific Journal Video about Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages at JoVE.com

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

وقد الأمثل لدينا تقنية الكبسلة باعتبارها منصة 3D فعالة لنشر وتمايز الخلايا الجذعية الجنينية إلى الأديم الباطن والخلايا العصبية الدوبامين (DA). كما أنه يوفر فرصة للمناعة عزل الخلايا من المضيف خلال زرع. ويمكن تكييف هذه المنصة لأنواع الخلايا الأخرى.

Microcapsule الجينات كمنصة 3D لإكثار وتمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) إلى أنساب مختلفة

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

alginate-microcapsule-as-3d-platform-for-propagation-differentiation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

16.2K Views.  The University of New South Wales. وقد الأمثل لدينا تقنية الكبسلة باعتبارها منصة 3D فعالة لنشر وتمايز الخلايا الجذعية الجنينية إلى الأديم الباطن والخلايا العصبية الدوبامين (DA). كما أنه يوفر فرصة للمناعة عزل الخلايا من المضيف خلال زرع. ويمكن تكييف هذه المنصة لأنواع الخلايا الأخرى.

Video: Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

نظم الدورية الثقافة خلية خلية للثقافة الإنسان : خلايا الأرومة الغاذية الإنسان نموذجا

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

التنمية، والتوسع، و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; رصد خلايا NK الإنسان من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وافرة القوة والتي يسببها الخلايا الجذعية (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

الضغط خلية باعتبارها قوية، ميكروفلويديك بين الخلايا توصيل منصة

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

طلب خلايا واحدة والأجنة واحدة في 3D الحبس: جهاز جديد لفحص المحتوى العالي

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

الطبقات الجيني التركيبات: منصة لالمشارك ثقافة بالسكان خلية غير المتجانسة

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning وجمعية Microvessels 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

طريقة ثقافية للحفاظ على الخلايا الجذعية الدموية البشرية الكويسنت

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles has emerged as an effective method to transiently and locally increase the permeability of the BBB, facilitating para- and transcellular transport of drugs across the BBB. Imaging the vasculature during ultrasound-microbubble treatment will provide valuable and novel insights on the mechanisms and dynamics of ultrasound-microbubble treatments in the brain.
Here, we present an experimental procedure for intravital multiphoton microscopy using a cranial window aligned with a ring transducer and a 20x objective lens. This set-up enables high spatial and temporal resolution imaging of the brain during ultrasound-microbubble treatments. Optical access to the brain is obtained via an open-skull cranial window. Briefly, a 3-4 mm diameter piece of the skull is removed, and the exposed area of the brain is sealed with a glass coverslip. A 0.82 MHz ring transducer, which is attached to a second glass coverslip, is mounted on top. Agarose (1% w/v) is used between the coverslip of the transducer and the coverslip covering the cranial window to prevent air bubbles, which impede ultrasound propagation. When sterile surgery procedures and anti-inflammatory measures are taken, ultrasound-microbubble treatments and imaging sessions can be performed repeatedly over several weeks. Fluorescent dextran conjugates are injected intravenously to visualize the vasculature and quantify ultrasound-microbubble induced effects (e.g., leakage kinetics, vascular changes). This paper describes the cranial window placement, ring transducer placement, imaging procedure, common troubleshooting steps, as well as advantages and limitations of the method.

This protocol describes the surgical and technical procedures that enable real-time in vivo multiphoton fluorescence imaging of the rodent brain during focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability.

في الوقت الحقيقي داخل المجهرية متعددةفوتون لتصور الموجات فوق الصوتية المركزة والعلاجات Microbubble لزيادة نفاذية حاجز الدم في الدماغ

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. These include the limited number of cadaveric pancreas donors and the long-term use of immunosuppressants. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been considered to be a potential candidate as an alternative source of islet-like cell generation. Our previous reports have successfully illustrated the establishment of induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) to insulin-producing cells (IPCs). However, the induction efficiency varied greatly. In this paper, we demonstrate the comparison of hDPSCs pancreatic induction efficiency via integrative (microenvironmental and genetic manipulation) and non-integrative (microenvironmental manipulation) induction protocols for delivering hDPSC-derived IPCs (hDPSC-IPCs). The results suggest distinct induction efficiency for both the induction approaches in terms of 3-dimensional colony structure, yield, pancreatic mRNA markers, and functional property upon multi-dosage glucose challenge. These findings will support the future establishment of a clinically applicable IPCs and pancreatic lineage production platform.

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

This protocol presents a comparison between two different induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) toward pancreatic lineages in vitro: the integrative protocol and the non-integrative protocol. The integrative protocol generates more insulin producing cells (IPCs).

في المختبر تحريض الخلايا الجذعية لب الأسنان البشري نحو أنساب البنكرياس

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...