يسمح هذا البروتوكول للباحثين بثقافة مستعمرات الخلايا الجذعية على الهيدروجيل مع السيطرة الكاملة على كل من صلابة الهيدروجيل وهندسة المستعمرات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للباحثين بثقافة مستعمرات الخلايا الجذعية في ظروف تحاكي البيئة الفسيولوجية بشكل أفضل من البلاستيك ثقافة الأنسجة. عند تنفيذ هذا البروتوكول للمرة الأولى، تأكد من توليد عدد قليل من المواد الإضافية واستخدام ليغاند الفلورسنت بحيث يمكنك استكشاف الأخطاء وإصلاحها وتحسينها في كل خطوة.
تتضمن هذه التقنية خطوات متعددة تتضمن تحديد المواقع الدقيقة للمواد المختلفة. من الأسهل بكثير فهم التعليمات المكتوبة لهذا البروتوكول بمجرد رؤيتها يتم تنفيذه. لبدء هذا الإجراء، مزيج قاعدة PDMS مع عامل علاج PDMS في نسبة 10 إلى واحد حسب الوزن ومزيج شامل.
Degas هذا الخليط في مجفف لمدة 30 إلى 60 دقيقة أو حتى تتم إزالة كل من فقاعات الهواء. ببطء وبتعادل صب خليط PDMS على سطح رقاقة أعدت. اضغط على الطبق على سطح العمل لإطلاق سراح أي فقاعات الهواء من سطح الرقاقة.
خبز PDMS في 70 درجة مئوية لمدة ساعتين والسماح لها لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. ثم قطع PDMS إلى ما يقرب من 10 في 10 ملليمتر المربعات ، كل تحتوي على ميزات لحالة تجريبية واحدة. وسوف يشار إلى هذه الطوابع كأختام لبقية البروتوكول.
بعد ذلك، قم بخلط قاعدة PDMS مع عامل علاج PDMS بنسبة ثمانية إلى واحد حسب الوزن، واخلطي جيداً. Degas الخليط في مجفف لمدة 30 إلى 60 دقيقة أو حتى تتم إزالة كل من فقاعات الهواء. المقبل، ببطء وبتعادل صب PDMS في طبق نظيفة 100 ملليمتر.
اضغط على الطبق على سطح العمل للافراج عن أي فقاعات الهواء. خبز PDMS في 70 درجة مئوية لمدة ساعتين والسماح لها لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. لكل طابع تم إنشاؤه سابقًا، قطع 15 في 15 ملليمتر مربع من PDMS.
وسوف يشار إلى هذه الألواح المسطحة لبقية البروتوكول. عكس كل طابع ولدت على لوح مسطح من PDMS بحيث الميزات على حامل في اتصال مع لوح مسطح من PDMS. اضغط بلطف على الجزء العلوي من الطابع مع ملقط لضمان حتى الاتصال.
المقبل، ووضع قطرة صغيرة من البوليمر UV-curable في واجهة أعلى من كل ختم وزوج لوح. سوف يكون البوليمر شريراً بين الاثنين بسبب التوتر السطحي الذي تساعده الجاذبية. ضع قطرة صغيرة من البوليمر UV-curable حول حواف واجهة الطابع وبلاطة.
هذا يخلق الحدود التي سوف تعقد الحل يغاند. ثم ضع بعناية الطوابع وصفعة أزواج في مربع تعقيم الأشعة فوق البنفسجية. استخدم إعداد طاقة STR العقيمة وفضح لمدة 10 دقائق.
بعد ذلك، إزالة أزواج من مربع التعقيم الأشعة فوق البنفسجية واستخدام اثنين من أزواج من ملقط لإزالة بلطف الطابع في حين عقد أسفل لوح مسطح والاستنسل التي شكلت من البوليمر UV-curable. باستخدام ملقط، وإزالة بعناية الاستنسل وعكس ذلك بحيث السطح الذي هو في اتصال مع لوح مسطح من PDMS تواجه لأعلى. ضع الاستنسل المقلوب مرة أخرى في صندوق تعقيم الأشعة فوق البنفسجية.
استخدام إعداد السلطة STR العقيمة وفضح لمدة ثلاث دقائق. باستخدام ملقط، وضعت بعناية كل جانب الاستنسل شقة أسفل على غطاء حمض غسلها مع التأكد من أن تتركز الميزات على زلة الغطاء. ضع قطعة صغيرة من فيلم المختبر على رأس كل استنسل.
اضغط بقوة وبشكل ثابت لأسفل على الاستنسل لإنشاء اتصال قوي بين الاستنسل وأغطية. ضع زلات الغلاف مع الاستنسل في طبق. ضع هذا الطبق في منظف البلازما وتطبيق البلازما عالية الطاقة لمدة 30 ثانية.
ثم، ماصة الحل ligand على سطح كل استنسل. بالنسبة للستينيل المصنوعة من 10 في 10 ملليمتر الطوابع مربعة، وتطبيق 100 ميكروليتر في الاستنسل. بعد ذلك، لف الطبق الذي يحتوي على زلات الغلاف في فيلم المختبر واحتضان في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
أولاً، اغسل غطاء الأغطية باستنسل باستخدام ملقط لغمره لفترة وجيزة في طبق يحتوي على PBS معقمة. غمر الغطاء مع الاستنسل في مرحلة ثانية من برنامج تلفزيوني لغسله مرة أخرى. إزالة الاستنسل من سطح غطاء مع الحرص على عدم كسر غطاء.
بعد ذلك ، غمر الأغطية لفترة وجيزة في طبق يحتوي على مياه فائقة الخطورة لإزالة الأملاح من يغسل PBS. لمس حافة غطاء إلى مهمة حساسة مسح لإستباء المياه الزائدة بعيدا. جفف زلة الغطاء تحت غاز خامل مثل النيتروجين.
ثم، إعداد حل بولياكريلاميد للحصول على مرونة هيدروجيل المطلوب. لكل غطاء منقوشة، وإعداد glutaraldehyde تنشيط أسفل يغطي الشفة مع مفتاح وضعت على القمة. ما بين 75 و 150 ميكرولترات من محلول البولي أكريلاميد إلى مركز كل الجلاتارالديهيد تنشيط الأغطية.
باستخدام ملقط، ووضع نمط زلة لتغطية على كل الجلوتارالديهيد زلة الأغطية المنشطة مع polyacrylamide و spacer بحيث يواجه الليغاند منقوشة حل polyacrylamide. ضع بعناية كل شطيرة بولي أكريلاميد في حامل غطاء مع خيوط متوافقة مع أنابيب قاعية مخروطية 15 ملليلتر. المسمار أنبوب أسفل مخروطي 15 ملليلتر في كل حامل الغطاء لعقد السندويشات polyacrylamide في مكان.
أجهزة الطرد المركزي إلى سندويشات polyacrylamide في الأنابيب في دلاء سوينغ في 200 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة الأنابيب من جهاز الطرد المركزي ووضعها في رفوف أنبوب للحفاظ على التوجيه لمدة 50 دقيقة إضافية لضمان البلمرة الكاملة. ثم، إزالة السندويشات من الأنابيب وغمرها في برنامج تلفزيوني.
لف الطبق في فيلم المختبر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات أو في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. بعد ذلك، استخدم مشرط وملاطة لإزالة بعناية نمط لتغطية زلات وفواصل من شطيرة polyacrylamide في حين أنها لا تزال مغمورة في برنامج تلفزيوني. ضع كل غطاء مع بوليكريلاميد منقوشة في حامل الغطاء.
مكان طوقا على رأس زلة الغطاء وحول polyacrylamide حيث كان موجودا في الفضاء. المسمار منشار قبالة أنبوب القاع المخروطية 15 ملليمتر في حامل الغطاء، وتشكيل بئر مع بوليكريلاميد منقوشة في الجزء السفلي. هذه التجميعات تندرج في آبار لوحة 12 جيدا القياسية لسهولة التعامل معها.
عند تنفيذ هذه التقنية، استخدم رابطة فلورية لضمان إنشاء النمط المطلوب على سطح زلة الغطاء الزجاجي، ونقلها بنجاح إلى سطح هيدروجيل البولي أكريلاميد أثناء البلمرة. المقياس النهائي للنجاح لهذا الأسلوب هو القدرة على ثقافة hESCs في هندستها المطلوبة على الهيدروجيلات المنقوشة. عندما مثقف كما هو موضح في بروتوكول النص، تتكاثر hESCs عادة لإكمال الأشكال الهندسية منقوشة من 48 إلى 72 ساعة بمجرد إزالة Y27632 تماما من وسائل الإعلام.
زراعة مستعمرات hESC في هندستها الضيقة على hydrogels polyacrylamide يسمح قياس قوى الجر التي تولدها الخلايا باستخدام المجهر قوة الجر. يتم إجراء هذه القياسات عن طريق تضمين مجهر الفلورس في الهيدروجيل وتصوير مواضع هذه الخرز قبل وبعد البذر hESCs. ويمكن استخدام صور مواضع الخرزة لتوليد خرائط لإزاحات الخرز التي يمكن استخدامها فيما بعد لحساب ضغوط الجر الأساسية.
في المستعمرات الدائرية من hESCs ، تم العثور على أكبر ضغوط الجر بالقرب من الحافة الطرفية للمستعمرات ، في حين أن مركز المستعمرات يعرض ضغوطًا منخفضة بشكل موحد. على الرغم من التوزيعات غير موحدة لوحظ من ضغوط الجر، hESCs مثقف كدوائر منقوشة في ظروف الصيانة، عرض تعبير موحد من علامة متعددة الأطراف أكتوبر 3/4 وخلية التصاق جزيء E-cadherin. وستتيح هذه التقنية للباحثين أن يُحسنوا نمذجة الأجنة البشرية باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مما يؤدي في نهاية المطاف إلى رؤى مهمة حول كيفية تطور البشر.
يمكن تكييف هذا الإجراء لأي تطبيق يهدف فيه الباحث إلى زراعة الخلايا في هندسات محددة على الهيدروجيلات الناعمة. هذا الإجراء متوافق مع معظم الأحماض الكيميائية الحيوية، مما يسمح للباحثين بالإجابة على أسئلة حول كيفية تأثير أشياء مثل هندسة الأنسجة والقوى المولدة للخلايا على التعبير عن البروتين وإشارات الخلايا. ويستخدم العديد من الباحثين الآن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لنموذج التنمية البشرية المبكرة.
هذه التقنية سوف تسمح للباحثين للإجابة على هذه الأسئلة الهامة في الظروف التي تحاكي أفضل بيئة فسيولوجية.
