وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة كنوت واليس والنبرغ. واعترف كامل من الموظفين في المراكز البروتين أطلس الإنسان في أوبسالا واستوكهولم والهند لما بذلوه من جهود لإنشاء أطلس البروتين البشري. الكتاب أود أن أشكر خصوصا فرانك الحمار وغوستافسون صوفي للحصول على المساعدة مع الصور وKarlberg Elené للحصول على المساعدة في إنتاج TMA عند تصوير.

<ol>
	<li>Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multitumor+(sausage)+tissue+block:+novel+method+for+immunohistochemical+antibody+testing.">The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing.</a> Lab Invest. 55, 244-244 (1986).</li><li>Kononen, J., Bubendorf, L., Kallioniemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens.">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat. Med. 4, 844-844 (1998).</li><li>Berglund, L., Bjorling, E., Oksvold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genecentric+Human+Protein+Atlas+for+expression+profiles+based+on+antibodies.">A genecentric Human Protein Atlas for expression profiles based on antibodies.</a> Mol. Cell Proteomics. 7, 2019 (2008).</li><li>Uhlen, M., Bjorling, E., Agaton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+protein+atlas+for+normal+and+cancer+tissues+based+on+antibody+proteomics.">A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics.</a> Mol. Cell Proteomics. 4, 1920 (2005).</li><li>Paavilainen, L., Edvinsson, A., Asplund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+tissue+fixatives+on+morphology+and+antibody-based+protein+profiling+in+tissues+and+cells.">The impact of tissue fixatives on morphology and antibody-based protein profiling in tissues and cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 58, 237-237 (2010).</li><li>Paavilainen, L., Wernerus, H., Nilsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+monospecific+antibodies:+a+comparison+study+with+commercial+analogs+using+immunohistochemistry+on+tissue+microarrays.">Evaluation of monospecific antibodies: a comparison study with commercial analogs using immunohistochemistry on tissue microarrays.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 16, 493-493 (2008).</li><li>Kampf, C., Andersson, A. C., Wester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+tissue+profiling+as+a+tool+for+clinical+proteomics.">Antibody-based tissue profiling as a tool for clinical proteomics.</a> Clinical Proteomics. 1, 285-285 (2004).</li><li>Ponten, F., Jirstrom, K., Uhlen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Protein+Atlas+-+a+tool+for+pathology.">The Human Protein Atlas - a tool for pathology.</a> J. Pathol. 216, 387-387 (2008).</li><li>Andersson, A. C., Stromberg, S., Backvall, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+expression+in+cell+microarrays:+a+tool+for+antibody-based+proteomics.">Analysis of protein expression in cell microarrays: a tool for antibody-based proteomics.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 1413-14 (2006).</li><li>Stromberg, S., Bjorklund, M. G., Asplund, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+for+protein+profiling+in+cell+microarrays+using+automated+image+analysis.">A high-throughput strategy for protein profiling in cell microarrays using automated image analysis.</a> Proteomics. 7, 2142 (2007).</li><li>Jogi, A., Brennan, D. J., Ryden, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+expression+of+the+RNA-binding+protein+RBM3+is+associated+with+an+improved+clinical+outcome+in+breast+cancer.">Nuclear expression of the RNA-binding protein RBM3 is associated with an improved clinical outcome in breast cancer.</a> Mod. Pathol. 22, 1564 (2009).</li><li>Magnusson, K., De Wit, M., Brennan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SATB2+in+combination+with+cytokeratin+20+identifies+over+95%+of+all+colorectal+carcinomas.">SATB2 in combination with cytokeratin 20 identifies over 95% of all colorectal carcinomas.</a> Am. J. Surg. Pathol. 35, 937 (2011).</li><li>Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+(TMAs)+for+high-throughput+molecular+pathology+research.">Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research.</a> Int. J. Cancer. 94, 1 (2001).</li><li>Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray:+a+new+technology+for+amplification+of+tissue+resources.">Tissue microarray: a new technology for amplification of tissue resources.</a> Cancer J. 7, 24 (2001).</li><li>Catchpoole, D., Mackie, N., McIver, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape+transfer+sectioning+of+tissue+microarrays+introduces+nonspecific+immunohistochemical+staining+artifacts.">Tape transfer sectioning of tissue microarrays introduces nonspecific immunohistochemical staining artifacts.</a> Biotech. Histochem. , (2010).</li><li>UniProt. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic acids research. 39, D214 (2011).</li><li>Uhlen, M., Oksvold, P., Fagerberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+knowledge-based+Human+Protein+Atlas.">Towards a knowledge-based Human Protein Atlas.</a> Nature Biotechnol. 28, 1248 (2010).</li><li>Leong, A. S., Leong, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+in+immunohistology.">Standardization in immunohistology.</a> Method Mol. Cell Biol. 724, 37 (2011).</li></ol>

ليس لدينا ما يكشف.

المناعية هي حتى الآن تطبيق الأكثر شيوعا عن الواجبات الشهرية. ويمكن استخدام مزيج من IHC والواجبات الشهرية في عدة أماكن مختلفة، مثل الإنتاجية العالية لفحص من أنماط التعبير البروتين في أنسجة 7 8 9 10 والخلايا، والدراسات اكتشاف العلامات البيولوجية على أساس عينات الأنسجة من الأفواج المريض كبير 11 12 وأكثر من ذلك بيولوجية الورم الأساسية دراسات، بما في ذلك مختلف الظواهر / المورثات، مراحل التمايز، تقدم والانبثاث 13. واحد الاستفادة من استخدام الواجبات الشهرية هي التي يمكن تحليلها مواد من أفواج كبيرة في وقت واحد، على حد سواء التجارب توفير المواد البيولوجية ذات قيمة، وضمان أكثر استنساخه. وعلاوة على ذلك، واستخدام تكنولوجيا TMA يوفر في تكاليف كاشف والوقت اللازم لتجهيز مختبر. ك TMA يحتوي فقط على كمية محدودة من الأنسجة، وعدم تجانس الأنسجة هي قضية. اعتمادا على نوع من الأنسجة، والمسائل التي ينبغي معالجتها، قد تكون هناك حاجة إلى عدة عينات من نفس specimeن. لأنسجة الورم، وينصح باستخدام 2-4 النوى من كل عينة كما فقد تبين أن يؤدي إلى درجة عالية من الدقة في تمثيل قطاعات النسيج كله 13 14. واعتمادا على تكوين أنسجة تعديلها القطر من اللكمات (التي تتراوح بين 0.6 ملم إلى 2 ملم). أنسجة معقدة وتتكون من كل من أنواع مختلفة من الخلايا عدة والهياكل والمصفوفة خارج الخلوي. تركيبة كل نوع من أنواع الأنسجة المختلفة التي تحتوي على كميات متفاوتة من الدهون، والأوعية الدموية والنسيج الضام، الغضروف وغيرها، تؤثر على الضغط اللازم لاللكم وجمع النوى منفصلة. ولذلك فإنه من الأهمية لممارسة جميع الخطوات في هذا الإجراء على المواد التي ليست له أي قيمة، وذلك قبل إصدار TMA مع الأنسجة المحددة للتجارب المقصود. عندما باجتزاء مجموعة متنوعة من الأنسجة المختلفة داخل كتلة TMA يمكن للمرء أن تكوين كتلة التأثير على القدرة على الحصول على أجزاء ذات جودة عالية. ميتم قطع الأنسجة rtain، والجلد على سبيل المثال، ونخاع العظام، الدهون، والدماغ والثدي، وتقديم باجتزاء من كتلة TMA صعبا بسبب تأثير الخلافات في نسيج إحداث أقسام كيف نمد في حمام الماء، وكيف صلابة مختلفة من شفرة الخ. ولذلك يوصى للأنسجة مجموعة مع ميزات مشابهة مثل الأنسجة الدهنية الغنية في واحدة TMA، عند الاقتضاء. غالبية أنسجة السرطان هي في هذا المعنى متجانسة، مما يسهل باجتزاء من الواجبات الشهرية السرطان. ويمكن استخدام طريقة بديلة باجتزاء لتحقيق الاستقرار في الصميم عندما ميكروأري التعامل مع الجمعية التونسية للأمهات مع أنواع غير متجانسة من الأنسجة. ويمكن استخدام لاصق يكون من المفيد لتجنب وقوع خسائر من النوى وسقوط خارج في TMA مقطوع. وينبغي استخدام واستخدام شريط لاصق مع الحذر، لأن الشريط يمكن أن تؤثر في سماكة من النوى مقطوع، وأيضا في وقت لاحق نتائج تلطيخ IHC 15. في الأطلس البروتين البشري انشاء قالب TMA من 9x8 (باستثناء علامات) النوى ARاستخدام البريد. فإنه من الأهمية القصوى للحصول على عدد من الأقسام ومنع جميع الأنسجة ممثلة في جميع أنحاء كتلة. لتوفير الكواشف ووقت المسح الضوئي، ويتم وضعها 2 أقسام على شريحة زجاجية 1 السماح لقالب الحد الأقصى ل9x8. مستودع كبير للحصول على معلومات من البروتين، 16 العالمي من الموارد البروتين ويشمل ما يقرب من 20،300 استعرض مقالات البروتين البشري، منها سوى ما يقرب من 66٪ لديهم أدلة على مستوى البروتين. أيضا للحصول على غالبية الجينات التي توجد أدلة على وجود على مستوى البروتين، وهناك ندرة أو أي معلومات عن وظيفة البروتين وتوزيع التعبير. يشكل تحديا هاما للمستقبل هو تحليل نمط التوزيع، والوفرة النسبية من هذه البروتينات غير معروف في أنواع مختلفة من الأنسجة البشرية. ويمكن استخدام المعلومات من قواعد البيانات مثل Uniprot، ENSEMBL، البيانات المنشورة من مجلات كدليل لتحديد ما اذا أنماط تلطيخ المناعية باستخدام أجسام مضادة لأجنحة البروتينات غير معروف تمثل ملامح البروتين الفعلي للبروتين الهدف المقصود. وبالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة إلى التحقق من صحة عدة استراتيجيات أخرى لضمان وظائف الجسم المضاد، حصول على وظائف الجسم المضاد سبيل المثال في صفائف البروتين، لطخة غربية، المناعي، المناعية هطول الأمطار، وهدم-التجارب. ولعل أهم أداة من أجل التحقق من وظائف الجسم المضاد هو استخدام الأجسام المضادة المقترنة، أي 2 الأجسام المضادة المختلفة التي أثيرت ضد منفصلة الحواتم غير متداخلة، على البروتين الهدف نفسه، لمقارنة الفحص محددة نتيجة 17. استنادا إلى المعلومات التي تم جمعها، ويتم اختبار الأجسام المضادة ومعاير وفقا للمعايير IHC وتجربة من تجارب والتحقق من صحتها أكثر من 35،000 الأجسام المضادة في المشروع البروتين أطلس الإنسان. لأكثر من 20٪ من جميع الجينات مع لمحات من البروتين، وقد استخدمت بيانات من الأجسام المضادة المقترنة (2 أو أكثر الأجسام المضادة نحو غير متداخلة الحواتم على البروتين نفسه) لتحديد أفضل استيلم نمط البروتين التعبير المطابق. الأجسام المضادة المقترنة توفير استراتيجية في نهاية المطاف للتحقق من صحة محدد بروتين تعبير المناعية المستندة إلى أنماط. هذه الاستراتيجية هي قيمة لأن العديد من الأنسجة المختلفة المدرجة في الفرز الأساسية يزيد من المخاطر بالنسبة للتفاعل المتبادل. وينبغي أن يلاحظ أيضا أن بعض الأنسجة وبشكل عام أكثر عرضة لإظهار خلفية تلطيخ الضامة مثل العضلات الملساء، الأنابيب البعيدة في الكلى والكبد في الكبد. إضافية للنظر في قضايا تشمل اختلافات في تقنيات معالجة الأنسجة مع مرور الوقت للأنسجة مأخوذة من المواد الأرشيفية، والتي يمكن أن تؤدي إلى سلبية أو إيجابية كاذبة غير مناسب أنماط تلطيخ IHC. تم مصادفة أيضا في تحليل هذه الظاهرة قسم كبير. ضوابط السلبية والإيجابية على حد سواء تعتبر حيوية ويجب استخدامها كلما كان ذلك ممكنا. لتعميق الدراسات بما في ذلك تحليلات وظيفية، وخطوط الخلية مع التعبير القسري وهدم محددة-TR من المناظرةويمكن استخدام anscripts (تكنولوجيا سيرنا) لإنشاء الضوابط. لأفضل النتائج في IHC، من المهم لاختبار واستخدام نظم استرجاع مستضد، منذ التثبيت الفورمالين يدفع التعديلات الكيميائية المختلفة على سبيل المثال عبر ربط، التحلل من قواعد شيف اخفاء مستضد 18. في الختام، الجسم المضاد القائم على البروتيوميات TMA توظيف التكنولوجيا وIHC هي استراتيجية قوية لتوليد البيانات بروتين تعبير على نطاق واسع. تم تعيين الإنسان مشروع أطلس البروتين تصل إلى وضع خريطة للتعبير البروتين البشري في الأنسجة البشرية الطبيعية والسرطان. والهدف من هذا المشروع هو تقديم أول مشروع لأطلس البروتين البشري شامل بحلول عام 2015. بالإضافة إلى تقديم ملامح بروتين طبيعي في الأجهزة والأنسجة، وهذا الجهد كما يوفر نقطة انطلاق لمشاريع البحوث الطبية الحيوية، بما في ذلك جهود السريرية اكتشاف العلامات البيولوجية. والهدف النهائي هو لإضافة طبقة من المعلومات التالية على رأس تسلسل الجينوم البشري أن وايسوف تكون حاسمة لفهم أعمق لعلم الأحياء وراء الحالات المرضية المختلفة، وتوفر أساسا لتطوير أدوات جديدة في التشخيص والعلاج.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> غسل العازلة </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> TA-999-TT </td></tr><tr><td> سيترات العازلة pH6 </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> TA-250-Pm1X </td></tr><tr><td> الأجسام المضادة مخفف </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> TA-125-UD </td></tr><tr><td> UltraVision ليرة لبنانية HRP البوليمر </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> TL-125-HL </td></tr><tr><td> DAB نظام زائد الركيزة </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> TA-125-HDX </td></tr><tr><td> V فائقة بلوك </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> TA-125-UB </td></tr><tr><td> الابتدائية جسم محسن </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> TL-125-PB </td></tr><tr><td> Mayers الهيماتوكسيلين </td><td> HistolAB </td><td> 01820 </td></tr><tr><td> PERTEX </td><td> Histolab </td><td> 00871.0500 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> اسم المعدات </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> دليل الأنسجة الدقيقة arrayer </td><td> Estigen، بيتشير الصك </td><td> MTA-1 </td></tr><tr><td> شلال مشراح </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> Microm HM 355S </td></tr><tr><td> صورة الماسح الآلي </td><td> Aperio تقنيات </td><td> XT </td></tr><tr><td> النظام الآلي الشريحة تلطيخ </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> Autostainer 480S-2D </td></tr><tr><td> النظام الآلي لتلطيخ الشريحة deparafinization والجفاف </td><td> لايكا النظم البيولوجية </td><td> Autostainer XL </td></tr><tr><td> الآلي زجاج coverslipper </td><td> لايكا السيريالي ystems </td><td> CV5030 </td></tr><tr><td> Decloaking غرفة </td><td> بيوكير الطبية </td><td> DC2008INTEL </td></tr></tbody></table>

production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas

نسيج [ميكروأري (TMA) تكنولوجيا يوفر وسيلة لعالية الإنتاجية تحليل للأنسجة وخلايا متعددة. وتستخدم هذه التقنية في إطار مشروع أطلس البروتين الإنسان لتحليل عالمي من أنماط التعبير بروتين طبيعي في الأنسجة البشرية، والسرطان، وخطوط الخلية. هنا نقدم للجمعية من النوى 1 مم، التي تم استردادها من الأنسجة اختيار ممثل مجهريا، في كتلة واحدة المتلقي TMA. يمكن أن تختلف في عدد وحجم النوى في كتلة TMA من ما يقرب من 40 ملم إلى 2 النوى مئات النوى 0.6 مم. وميزة استخدام TMA التكنولوجيا يمكن بسرعة أن كمية كبيرة من البيانات يمكن الحصول عليها باستخدام بروتوكول المناعية واحد لتجنب التقلبات التجريبية. الأهم من ذلك، هناك حاجة إلى كمية محدودة فقط من الأنسجة النادرة، والتي تسمح لتحليل الأفواج المريض كبير 1 2. ويمكن خفض ما يقرب من 250 المقاطع على التوالي (4 ميكرون سميكة) من كتلة والجمعية التونسية للأمهات وتستخدم لstaini المناعىنانوغرام لتحديد أنماط التعبير بروتين معين مقابل 250 الأضداد المختلفة. في المشروع البروتين أطلس الإنسان، تتولد أجسام مضادة تجاه جميع البروتينات البشرية واستخدامها للحصول على البروتين ملامح المناظرة في كل من أنسجة بشرية عادية من 144 أفراد والأنسجة السرطانية من 216 مريضا آخر، وهو ما يمثل 20 الأشكال الأكثر شيوعا من سرطان الإنسان. يتم فحص الملون Immunohistochemically أقسام TMA على شرائح زجاجية لخلق صور عالية الدقة من الذي علم الأمراض يمكن تفسير والتعليق على نتائج المناعية. تصنع الصور جنبا إلى جنب مع البيانات المناظرة الشرح علم الأمراض على أساس المتاحة علنا للمجتمع البحث من خلال بوابة البروتين أطلس الإنسان ( <a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a> ) (الشكل 1) 3 4. أطلس البروتين البشري يوفر خريطة تبين توزيع والوفرة النسبية من البروتينات في الجسم البشري. في النسخة الحاليةسيون يحتوي على أكثر من 11 مليون صورة مع البيانات بروتين تعبير عن 12.238 بروتينات فريدة من نوعها، بما يعادل أكثر من 61٪ من جميع البروتينات المشفرة بواسطة الجينوم البشري.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas at JoVE.com

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

ميكروأرس الأنسجة يتيح وسيلة فعالة للحصول على معلومات المتزامنة من عدد وافر من الأنسجة. ويتم تجميع أجزاء من الأنسجة إلى ممثل كتلة البارافين واحد. وتستخدم أجزاء من كتلة لالمناعية وتحليل أنماط التعبير بروتين. المسح الرقمي يولد الصور المقابلة لتوزيع البيانات.

إنتاج نسيج [ميكروأرس]، وتلطيخ المناعية والتكنولوجيا الرقمية وضمن أطلس البروتين البشري

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

production-tissue-microarrays-immunohistochemistry-staining

Research

JoVE Journal

Biology

55.7K Views.  Uppsala University. ميكروأرس الأنسجة يتيح وسيلة فعالة للحصول على معلومات المتزامنة من عدد وافر من الأنسجة. ويتم تجميع أجزاء من الأنسجة إلى ممثل كتلة البارافين واحد. وتستخدم أجزاء من كتلة لالمناعية وتحليل أنماط التعبير بروتين. المسح الرقمي يولد الصور المقابلة لتوزيع البيانات.

Video: Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

أكتين المشارك الترسيب الفحص ، وبالنسبة للتحليل البروتين ملزمة لF - أكتين

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

على البروتين MultiBac مجمع منصة الإنتاج في EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

التحقيق عالية الكثافة ميكروأرس البروتين وظيفية لكشف البروتين البروتين التفاعلات

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

تصور لهيكل ثلاثي الأبعاد من الأنسجة الدهنية البيضاء باستخدام تلطيخ كل جبل

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

طريقة CryoAPEX لتحليل المجهر الإلكتروني لتوطين بروتين الغشاء داخل الخلايا المحفوظة فائقة الهيكلية

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.

Y-27632 يثري العائد من الخلايا الصباغية البشرية من أنسجة الجلد الكبار

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

الأبقار المبيض القشرة الأنسجة الثقافة

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic bacteria of special relevance for a wide number of hosts. P. syringae enters the plant from the leaf surface and multiplies rapidly within the apoplast, forming microcolonies that occupy the intercellular space. The constitutive expression of fluorescent proteins by the bacteria allows for visualization of the microcolonies and monitoring of the development of the infection at the microscopic level. Recent advances in single-cell analysis have revealed the large complexity reached by clonal isogenic bacterial populations. This complexity, referred to as phenotypic heterogeneity, is the consequence of cell-to-cell differences in gene expression (not linked to genetic differences) among the bacterial community. To analyze the expression of individual loci at the single-cell level, transcriptional fusions to fluorescent proteins have been widely used. Under stress conditions, such as those occurring during colonization of the plant apoplast, P. syringae differentiates into distinct subpopulations based on the heterogeneous expression of key virulence genes (i.e., the Hrp type III secretion system). However, single-cell analysis of any given P. syringae population recovered from plant tissue is challenging due to the cellular debris released during the mechanical disruption intrinsic to the inoculation and bacterial extraction processes. The present report details a method developed to monitor the expression of P. syringae genes of interest at the single-cell level during the colonization of Arabidopsis and bean plants. The preparation of the plants and the bacterial suspensions used for inoculation using a vacuum chamber are described. The recovery of endophytic bacteria from infected leaves by apoplastic fluid extraction is also explained here. Both the bacterial inoculation and bacterial extraction methods are empirically optimized to minimize plant and bacterial cell damage, resulting in bacterial preparations optimal for microscopy and flow cytometry analysis.

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

The present protocol describes a method that allows single-cell gene expression analysis on Pseudomonas syringae populations grown within the plant apoplast.

تحليل الخلية الواحدة للتعبير عن جينات حقنة الزائفة داخل الأنسجة النباتية

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...