تمكن هذه البروتوكولات من تحديد كمية دقة الخلية الواحدة ، والتعبير المشترك عن العلامات والتحليل الخاص باستخدام عينات الأنسجة المجمدة المثبتة بالفورمالين والبارافين والمجمدة الطازجة لتوضيح أدوار الخلايا المناعية في السرطان. هذه التقنية هي أداة قوية تسهل التوصيف المتزامن لعلامة 40 على قسم نسيج واحد ، وتحافظ على نطاق واسع على بنية الأنسجة في العينات. الخطوة الحاسمة هي تحسين الأجسام المضادة والتحقق من صحتها.
يمكن أن يؤدي الفشل في إكمال الخطوة إلى صور منخفضة الجودة قد تعرض للخطر الاحتفاظ ببيانات ونتائج قابلة للتكرار عالية الجودة. ابدأ بتدوير جميع الأنابيب التي تحتوي على الأجسام المضادة عند 10،000 × G لمدة خمس دقائق ، وأضف الأجسام المضادة الفردية إلى المخزن المؤقت المانع واخلطها جيدا. لا تزعج الجزء السفلي من أنبوب الأجسام المضادة عند سحبه.
قم بتصفية لوحة الأجسام المضادة عن طريق الترطيب المسبق لجهاز مرشح الطرد المركزي بسعة 0.1 ميكرومتر مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع. قم بتدوير الفلتر عند 10،000 × G لمدة دقيقتين وقم بإزالة تدفق المخزن المؤقت المانع باستخدام ماصة. ثم انقل لوحة الأجسام المضادة إلى عمود دوران وقم بتدوير المرشح عند 10،000 × G لمدة دقيقتين.
تخلص من عمود الدوران واستخدم التدفق كلوحة الأجسام المضادة التي تمت تصفيتها. بالنسبة لتلطيخ الأجسام المضادة، قم بإزالة المخزن المؤقت المانع من الشرائح عن طريق قلب كل شريحة على جانبها والنقر برفق على الحواف مقابل ممسحة المهام. ضع الشرائح في غرفة رطوبة وأضف 100 إلى 200 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الرئيسي إلى الأنسجة.
أضف شرائح تحكم إيجابية وسلبية إلى دفعة التلطيخ واحتضن الشرائح عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. لإعداد الأداة، قم بتسجيل الدخول إلى برنامج التحكم، وانقر على الاستيقاظ، إذا كان الجهاز في وضع السكون. انقر فوق نموذج Exchange لتحميل شريحة ثم انقر فوق متابعة لفتح الباب.
ضع الشريحة في فتحة التحميل مع عينة متجهة لأعلى والملصق على اليمين ، انقر فوق متابعة لإغلاق الباب. حدد المشروع ثم حدد اسم الشريحة للعينة التي تم تحميلها. تصور الصورة البانورامية على جزء الصورة البصرية الشريحية لمجال الرؤية أو تحديد FOV ، وانقر فوق قائمة الوضع وحدد كاشف الإلكترون الثانوي ، ثم انقر فوق قائمة وضع التصوير واختر QC 300 ميكرومتر.
انقر فوق Jog Stage للتحكم في موقع FOV ثم انقر فوق الأسهم للتنقل وتحديد موضع FOV. انقر فوق إضافة FOV ، وتعيين 400 ميكرومتر × 400 ميكرومتر كحجم الحقل وحدد Fine كوضع التصوير و 1 مللي ثانية من وقت الإقامة ، انقر فوق تأكيد. بعد إنشاء قائمة FOV ، انتقل إلى تركيز الصورة واضبط الوصمة عن طريق تحريك الشعاع إلى منطقة نسيج لن يتم تصويرها.
اضبط المعلمات حتى يتم الحصول على صورة مركزية واضحة ، انقر فوق Start Run. سيتم تحميل الصور التي تم الحصول عليها تلقائيا وتخزينها في تطبيق إدارة الصور المستند إلى الويب. تصف المصفوفة الموضحة هنا النسبة المئوية للحديث المتبادل المستمدة من نقاء المسبار وأكاسيده.
هنا تشير المربعات الزرقاء إلى أكبر من أو يساوي 0.5٪ من المحادثة المتقاطعة وتشير المربعات الواضحة إلى أقل من 0.5٪ من المحادثة المتقاطعة. بالنسبة لعلامات القداس ، يتم عرض التحقيقات التي ساهمت بنسبة 0.5٪ على الأقل في أي قنوات أو قناة أو قناتين أو أكثر من قناتين هنا. كما يتم عرض القنوات الجماعية التي تتلقى ما لا يقل عن 0.5٪ من المحادثات المتقاطعة من أي مجسات أو مسبارين أو أكثر من مسبارين.
يتم تصوير صور التلطيخ التمثيلية في أنسجة مختلفة مثل سرطان الرئة الغدي والكلى غير الورمية واللوزتين هنا. يتم عرض صورة لقسم أنسجة اللوزتين ملطخة باستخدام هذه التقنية وتصورها باستخدام برنامج تحليل الصور الرقمية التابع لجهة خارجية قبل التصفية والتصحيح هنا. تظهر هنا صورة القسم نفسه تحت نفس الشروط بعد خطوات التصفية والتصحيح.
تقوم هذه الطريقة بإنشاء صور يمكن تحميلها إلى برنامج تحليل الصور الرقمية التابع لجهة خارجية ، مما يسمح بإجراء تحليل شامل مثل تجزئة الأنسجة ، وتجزئة الخلايا ، والتعبير المشترك عن العلامة ، بالإضافة إلى تحليل الجيران والتحليل البعيد. تتوفر طرق التصوير متعددة الإرسال للغاية من خلال البحث. من خلال بناء لوحات مختلفة ، يمكن للباحثين التحقيق في عينات السرطان والطبيعية وشبه الأورام والالتهابات والمعدية.
