وأيد هذا البحث من خلال منحة R01NS062842 من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية والمعاهد الوطنية للصحة (الليبرالي) ، ومنح R21 NS064403 من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية والمعاهد الوطنية للصحة من خلال الأذربيجانية (الليبرالي) و R21 EB006301 المعهد الوطني للتصوير الطبية الحيوية والهندسة الحيوية والمعاهد الوطنية للصحة (الليبرالي).

وينبغي أن تكون على استعداد للكشف عن أجزاء الجهاز المستندة الجزيئية أولا لأن إعدادها وقتا أكثر من تجميع الجهاز الجزيئي. وبناء يعمل بشكل جيد مع 5 أبواب 6μm سميكة من قطع بارافورمالدهيد الثابتة ، وكتل البارافين جزءا لا يتجزأ من النسيج. استخدام العلامات التجارية الشريحة التي تحتفظ المقاطع أيضا ، مثل الشرائح ProbeOn زائد واتهم precleaned (فيشر العلمي) أو ما شابه ذلك. نوصي به لأول مرة في الأنسجة مع نمط معروف من الحمض النووي من التلف الذي يحتوي على كل الدناز I - II الدناز وفواصل من نوع ، مثل ديكساميثازون الفئران المعالجة أفكارك التوتة 13،14. 1. إعداد الأبواب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المقاطع في رف الشريحة وdewax في الزيلين لمدة 15 دقيقة ، ونقل إلى حمام الزيلين الطازجة لمدة 5 دقائق إضافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترطيب بعبورها تركيزات الإيثانول متدرج : 96 ٪ الايثانول 2x5min ؛ الايثانول 80 ٪ -- 5min ، والمياه -- 2x5 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هضم المقطع مع Proteinasه ك استخدم 100μL حل 50μg/mL في القسم. احتضان 15 &#39;في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية) في غرفة ترطيب. قد تحتاج إلى وقت للتكيف وفقا لنوع الأنسجة. قد تتطلب الأنسجة الصلبة تعد عملية الهضم. وعادة ما تستخدم أوقات 15-25 دقيقة. قد يؤدي إلى عدم كفاية الهضم الأضعف إشارة. Overdigestion على نتائج ناحية أخرى في اختفاء الإشارات وتعطل القسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف في الماء المقطر ل2x10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق القسم 100 ميكروليتر في المائة من 2 ٪ لجيش صرب البوسنة preblocking. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية). خلال هذا الوقت تجميع الجهاز الجزيئي. </li></ol> 2. آلات التجمع الجزيئي يتم تحجيم كل الكواشف لحجم إجمالي 25 ميكرولتر ، وهو ما يكفي للكشف عن واحد في المقطع حجم الأنسجة المتوسط ​​(10x10mm). ويمكن تحجيمها ورفع الصوت حسب الحاجة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع في أنبوب بلاستيكي صغير في هذا النظام : </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody> &lt;TR&gt; <td><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Bidistilled المياه ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 ٪ البولي ايثيلين جلايكول - 8000 ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل من 66 ملم تريس حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.5 ، 5 مم MgCl 2 ، 0.1 ملم dithioerythritol ، 1 ملم اعبي التنس المحترفين ، (أي الحمض النووي العادية يغاز T4 العازلة) ؛ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70 pmoles من قليل النوكليوتيد 1 ، </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 215 pmoles (1،76-7،1 ميكروغرام) VACC TOPO </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 وحدات الحمض النووي يغاز T4 (500 U / مل) </li></ol></td></tr></tbody></table><ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المزيج بلطف pipetting. الجزيئي بناء على الفور تقريبا الذاتي تجمع في هذا الحل ، ويمكن استخدامها على الفور في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية). زيادة درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية يمنع T4 يغاز الحمض النووي القائم على العناصر المكونة لوضع العلامات. </li></ol> 3. باستخدام الآلات الجزيئية في أقسام الأنسجة ل5&#39;OH التسمية المزدوجة وفواصل الحمض النووي 5&#39;PO4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الحل preblocking 25μL وتطبيق مزيج من التفاعل الكامل تحتوي على 70 من pmoles قليل النوكليوتيد 1 ، 53-215 pmoles (1،76-7،1 ميكروغرام) VACCTOPO وحدات الحمض النووي يغاز 10 T4 (500 U / مل) في محلول من حمض الهيدروكلوريك 66 ملم تريس ، ودرجة الحموضة 7.5 ، MgCl 5mM 2 ، 0.1 ملم dithioerythritol ، 1 ملم اعبي التنس المحترفين ، والبولي ايثيلين جلايكول 15 ٪ - 8000. وقليل النوكليوتيد نفس تسلسل تحمل تسمية واحدة FITC ، قليل النوكليوتيد 2 ، يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك للكشف عن نوع واحد من فواصل الحمض النووي. في مثل هذه الحالة يغاز حذفت من ردود فعل التوسيم. أيضا في هذه الحالة يمكن إيجاد حل ل50mM تريس - HCL ، ودرجة الحموضة 7.4 ، يمكن استخدام 15 ٪ PEG - 8000 بدلا من الحمض النووي T4 يغاز العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 1 ساعة على درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية) في غرفة ترطيب مع ساترة البلاستيك. بعيدا عن الضوء. خفض درجة الحرارة إلى 16 درجة مئوية يقلل إشارة يغاز مقرها ، وارتفاع درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية يزيل تماما الإشارة يغاز مقرا لها. وتثبيط جزئي ليغاز يحدث أحيانا في مزيج التفاعل ، وربما بسبب الملوثات المقدمة مع الاستعدادات topoisomerase. لذا ، قد يكون مطلوبا حضانة أطول (2-4 ساعات) خصوصا عندما قأرقام ignificant من يغاز المسمى فواصل موجودة. على الرغم من أن يمكن ملاحظة كلا يغاز وإشارات توبو في هذه المرحلة ، في كثير من الحالات يمكن الإشارة يغاز يتعزز من خلال تطبيق إعادة المزيج من دون رد فعل TOPO VACC وصفت قليل النوكليوتيد المزدوجة ، ولكن يحتوي على قليل النوكليوتيد شكل دبوس (قليل النوكليوتيد 3) (35 ملغ / مل) و T4 يغاز الحمض النووي (250 U / مل). لتعزيز إشارة المضي قدما إلى الخطوة 3 ، لمعرفة رد الفعل من دون تعزيز انتقل إلى الخطوة 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة coverslips بغمر بلطف الشرائح عموديا في وعاء يحتوي على الماء Coplin في درجة حرارة الغرفة. نضح المياه الزائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعزيز إشارة يغاز من خلال تطبيق 25 ميكرولتر من دون رد فعل مزيج TOPO VACC وقليل النوكليوتيد 1 ، ولكن تحتوي على قليل النوكليوتيد 3 : 66 ملم تريس حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.5 ، 5 مم MgCl 2 ، 0.1 ملم dithioerythritol ، 1 ملم اعبي التنس المحترفين ، و- غليكول البولي ايثيلين بنسبة 15 ٪ 8000 ، 5 وحدات الحمض النووي يغاز T4 ، و 35 ملغ / مل قليل النوكليوتيد 3 (كليلة القاسي انتهى). الحجم الكلي للوسم حل كاليفورنيايمكن تحجيمها ن يصل إلى استيعاب أكبر أقسام. احتضان لمدة 18 ساعة (بين عشية وضحاها) في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية) في غرفة ترطيب مع ساترة البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة coverslips بغمر بلطف الشرائح عموديا في جرة Coplin تحتوي على الماء في درجة حرارة الغرفة. دقيقة ثم يغسل القسم 3x10 في الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التشطيف مع العازلة بيكربونات الصوديوم. محلول قلوي شطف يعزز FITC مضان ، وهي حساسة ويتم تخفيض درجة الحموضة أقل بكثير من درجة الحموضة 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الجزء بمحلول antifading (Vectashield مع دابي) ، ساترة وتحليل الإشارات باستخدام المجهر الفلورسنت. سوف فواصل الحمض النووي المزدوج حبلا 5&#39;OH يتألق مع الأخضر ، فواصل 5&#39;PO 4 -- سوف يتألق باللون الأحمر (الشكل 2). </li></ol> 4. ممثل النتائج <img alt="الشكل 2." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig2.jpg" /> الشكل 1. شبه آلة جزيئية اصطناعية يكشف نوعين منالحمض النووي من التلف في الموقع. الجهاز الفلورسنت الذاتي عندما تجمع VACC TOPO بربط القاسي مزدوجة - 32 - سورمير. يبدأ تشغيل الجهاز عن طريق تقسيم نفسها إلى وحدات للكشف عن يومين عبر topoisomerase صنع قطع في نهاية 3 &#39;من تسلسل الاعتراف. هذه النتائج في عملية دورية حيث وحدة FITC المسمى يفصل باستمرار وreligates العودة إلى الوحدة ، رودامين المسمى. استمر ذلك حتى يتم كسر اجه الحمض النووي للكشف. عندما يكون هذا متقبل البديلة (DNA 5&#39;OH نهاية حادة كسر) موجود في قسم الأنسجة ، فإن الجزء FITC ligate إليه. والجزء المتبقي رودامين نعلق على 5 &#39;فواصل الحمض النووي ص 4 نهاية صريحة مع مساعدة من الحمض النووي يغاز T4. وبالتالي ، يتم الكشف في وقت واحد كلا النوعين من فواصل الحمض النووي. <img alt="الشكل 1." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig1.jpg" /> الشكل 2. تسميات آلة الجزيئية المزدوجة نوعين من فواصل الحمض النوويفي مقطع من أنسجة الغدة الصعترية ديكساميثازون المعاملة. فواصل الحمض النووي كليلة العضوية للالدناز يتم الكشف عن الدناز I - II - واكتب في المناطق القشرية التوتة تمر موت الخلايا المبرمج. مضان هيولي خضراء (DNA 5&#39;OH فواصل) علامات الضامة القشرية هضم المواد النووية من thymocytes أفكارك. ويتم إنتاج هذه الإشارة التي TOPO VACC ، ويموضع لphagolysosomes مع الحمض النووي يحتوي على 5&#39;OH مزدوج الجديلة 11،12. مضان أحمر (4 5&#39;PO فواصل) تسميات نوى thymocytes أفكارك لا اجتاحت بواسطة الضامة. أعداد هائلة من الخلايا في وقت واحد thymocytes الخضوع يرافقه جيل من 4 فواصل المزدوج حبلا 5&#39;PO ، التي تصور يغاز المستندة إلى وضع العلامات. وتقع هذه الانقطاعات على هامش النووية ، وتشكيل عصابة على شكل أنماط. جميع النوى الخلوية هي التي تصور counterstaining مع دابي (الأزرق مضان).

<ol>
	<li>Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).</li><li>Schuldt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Pol+expeditions.">Dynamic Pol expeditions.</a> Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+machines:+how+motion+and+other+functions+of+living+organisms+can+result+from+reversible+chemical+changes.">Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).</li><li>Schneider, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+molecular+machines+I.+Channel+capacity+of+molecular+machines.">Theory of molecular machines I. Channel capacity of molecular machines.</a> J. Theor. Biol. 148, 83-123 (1991).</li><li>McClare, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+machines,+Maxwell's+demon+and+living+organisms.">Chemical machines, Maxwell's demon and living organisms.</a> J. Theor. Biol. 30, 1-34 (1971).</li><li>Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+as+a+molecular+machine.">Ribosome as a molecular machine.</a> FEBS Lett. 514, 2-10 (2002).</li><li>Fabbrizzi, L., Foti, F., Licchelli, M., Maccarini, P. M., Sacchi, D., Zema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+molecular+machines:+pH-induced+intramolecular+motions+in+a+fluorescent+nickel(II)+scorpionate+complex.">Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex.</a> Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).</li><li>Drexler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation. , (1992).</li><li>Freitas, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanomedicine: basic capabilities. , (1999).</li><li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+probes+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET):+designs+and+applications.">DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications.</a> BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).</li><li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis:+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA.">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16, 4599-4614 (2011).</li><li>Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-artificial+fluorescent+molecular+machine+for+DNA+damage+detection.">Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection.</a> Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).</li><li>Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+double-strand+breaks+with+single-base+3'+overhangs+in+cells+undergoing+apoptosis+but+not+necrosis.">Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis.</a> J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).</li><li>Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin-labeled+hairpin+oligonucleotides.+Probes+to+detect+double-strand+breaks+in+DNA+in+apoptotic+cells.">Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells.</a> Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).</li><li>Jones, R. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft Machines: Nanotechnology and life. , (2007).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في هذا الفيديو ، ونحن لشرح كيفية تجميع واستخدام الحمض النووي الوسم المزدوج استشعار الضرر. المجس هو آلة جزيئية مدفوعا الحيوية الجزيئية المحرك ، وهو فيروس ترميز TOPO VACC البروتين المرتبط مع مكونات اصطناعية. وقدم مثالا على تطوير نهج الحيوي الذي مكن دعاة تكييف الهياكل البي...

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الزيلين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإيثانول 80 و 96 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 ٪ من محلول الزلال المصل البقري (BSA) في الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قليل النوكليوتيد 1 : دبوس الشعر المزدوج ، المزدوج المسمى مع فلوريسئين وtetramethylrhodamine : </li></ol> 5&#39; - GC AAG GGA CCT F GCA GGT CCC ACG TTA CAT R في فريق التنسيق العالمي TT - 3 &#39;؛ F -- FITC - DT ؛ R -- Tetramethylrhodamine - DT. ويمكن استخدام غيرها الحمراء تحولت fluorophores مثل TR BODIPY ، رودامين أو طمره بدلا من tetramethylrhodamine كما R. بدلا من ذلك يمكنك استخدام قليل النوكليوتيد 2 -- واحد مزدوج مع دبوس الشعر المسمى فلوريسئين (للكشف عن نوع واحد من فواصل الحمض النووي (الدناز II - نوع فقط) التحقيق المفرد fluorophore الحاملة هو أقل كلفة بكثير ومريحة كلما واحد نوع من الحمض النووي هو كسر ليكون المسمى : 5&#39; - GC AAG GGA CCT F GCA GGT TTA CCC ACG CAT ATG CGT T - 3 &#39;؛ F -- FITC - DT </p&gt; <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قليل النوكليوتيد 3. كليلة العضوية رودامين المسمى القاسي لتعزيز الموقع في إشارة ربط مع الحمض النووي ليغاز T4 : فريق التنسيق العالمي 5&#39; - C R CTA GAC G GTC TAG CGC - 3 &#39;؛ R -- Tetramethylrhodamine - DT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوقس الحمض النووي ل topoisomerase (VACC TOPO) -- 3000 U / ميكروليتر (تكنولوجيا حية). في التجارب الأولية استخدمنا pmoles 215 (7.1 ميكروغرام) من TOPO VACC في كل ميكرولتر 25 من خليط التفاعل. ومع ذلك ، يمكن تركيز topoisomerase انخفاض كبير دون فقدان الحساسية. كنا في وقت لاحق على كمية أقل من أربع مرات TOPO VACC في المقطع (1.76 ميكروغرام في 25 ميكرولتر من مزيج التفاعل في القسم) مع نتائج مماثلة. تخفيض كمية انتاج الانزيم لنانوغرام 880 (في 25 ميكرولتر من مزيج التفاعل) أدى إلى ضعف و 8.8 نانوغرام إشارة من TOPO VACC أي إشارة يمكن كشفها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> T4 DNA يغاز 5 U / ميكروليتر (روش). هذا التحضير يغاز مركزة للغاية ويعطي إشارة أفضل في ظروفنا التجريبية. </lط&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 x لتحديد رد فعل العازلة يغاز DNA T4 : 660 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، و 50 ملي MgCl 2 و 10 ملي dithioerythritol ، 10 ملي للاعبي التنس المحترفين ، ودرجة الحموضة 7.5 (20 درجة مئوية) (روش). يتم إتلاف بسهولة في بطولة العازلة رد فعل في دورات متكررة من تجميد لاذابة. قسامة المخزن المؤقت في أجزاء صغيرة ميكرولتر وتخزينها في 15-20 -- 20 درجة مئوية استخدام مرة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30 ٪ (W / V) حل PEG - 8000 (سيغما) في الماء bidistilled. 15 ٪ PEG - 8000 في مزيج يحفز رد فعل قويا في الكشف ، وزيادة فعالية تركيزات مكوناته من جراء الاستبعاد وحدة التخزين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بروتين K (روش) 20 محلول المخزون ملغ / مل في الماء المقطر. المحل في -- 20 درجة مئوية وفي رد فعل الحل استخدام 50mg/mL في برنامج تلفزيوني ، أعدت من المخزون. لا إعادة استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vectashield مع دابي (ناقلات مختبرات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيكربونات الصوديوم العازلة : 50M NaHCO M 3 ، M 15M كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 8.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 22x22mm أو 22x40mm الزجاج أو البلاستيك coverslips. coverslips البلاستيكية هي الأفضل خلال رد فعل ، كما قامواإعادة لإزالة أسهل من هذا الباب. </li></ol>

in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage

طبيعيا الحيوية الجزيئية آلات العمل في كل خلية حية وعرض مجموعة متنوعة من تصاميم 1-6. بعد تطوير مراكز صناعية آلات جزيئية على أجهزة قادرة على الحركة الاتجاه ، أي المحركات الجزيئية ، وعلى أجزاء مصغرة من الميكانيكية (العجلات ، الخ axels المعلقات ، و) 7-9. هذا يقلد آلات الكلي ، على الرغم من أن الخصائص الفيزيائية الأساسية لهذه الأجهزة ، مثل الجمود والحفاظ على الزخم ، ليست صالحة للاستعمال في البيئات nanoworld 10. ويمكن لتصاميم بديلة ، والتي لا تتبع مخططات macromachines الميكانيكية واستخدام الآليات المتقدمة في تطور الجزيئات البيولوجية ، والاستفادة من الشروط المحددة للnanoworld. الى جانب ذلك ، التكيف مع الجزيئات البيولوجية الفعلية لأغراض تصميم نانو يقلل المخاطر المحتملة لمنتجات تكنولوجيا النانو قد تشكل. نحن هنا لشرح التجمع وتطبيق واحد بناء الحيوية مكن من هذا القبيل ، كماEMI - الجزيئية الاصطناعية الجهاز الذي يجمع بين جهاز طبيعيا مع مكونات جزيئية اصطناعية. من وجهة نظر علم الإنزيمات ، وبناء لدينا هو مصمم الفلورسنت انزيم الركيزة المعقدة وضعت معا لأداء وظيفة محددة مفيدة. هذا التجمع هو تعريف الجهاز الجزيئي ، كما يحتوي على واحد 12. حتى الآن ، والتكامل مع الجزء هندسيا -- دبوس الشعر المزدوج فلوري -- إعادة توجهها إلى مهمة جديدة من الحمض النووي من التلف العلامات 12. بناء تجمع لدينا من أصل 32 - DNA مير وtopoisomerase الوقس أنا انزيم (VACC TOPO). الجهاز ثم يستخدم المواد الخاصة بها الى افتعال حدتين كاشف fluorescently المسمى (الشكل 1). واحدة من وحدات (مخضر) يحمل VACC TOPO المرفقة تساهميا ل3&#39;end وحدة أخرى (أحمر مضان) هو منعطف حاد الحرة مع 3&#39;OH المحطة. وحدات قصيرة الأجل ويحشدوا بسرعة مرة أخرى إلى بناء الأصلي ، الذي recleaves في وقت لاحق.في غياب الحمض النووي فواصل هاتين الوحدتين منفصلة religate باستمرار وبطريقة دورية. في أقسام الأنسجة مع الحمض النووي من التلف ، وحدة للكشف عن topoisomerase الحاملة تعلق الحمض النووي بشكل انتقائي للفواصل حادة مع 5&#39;OH العضوية (من النوع الثاني الدناز فواصل) 11،12 ، ووضع العلامات fluorescently لهم. الثانية ، انزيم خالية القاسي تشكلت بعد قليل النوكليوتيد الانقسام ، وسوف ligate لكسر 5&#39;PO كليلة العضوية 4 (I - الدناز نوع فواصل) 11،12 ، إذا T4 يغاز الحمض النووي موجود في حل 13،14. عند إضافة T4 يغاز الحمض النووي لقسم الأنسجة أو محلول يحتوي على الحمض النووي مع فواصل حادة العضوية 5&#39;PO 4 ، يغاز يتفاعل مع الحمض النووي تنتهي 5&#39;PO 4 ، وتشكيل شبه مستقرة انزيم الدنا المجمعات. سوف دبابيس الشعر كليلة العضوية تتفاعل مع هذه المجمعات الافراج يغاز دبابيس الشعر ، وربط تساهميا إلى الحمض النووي ، وبالتالي وضع العلامات 5&#39;PO 4 فواصل الحمض النووي كليلة العضوية. هذا التطور تجسد نهجا جديدا لعملية ال(ه) من تصميم الآلات الجزيئية ويوفر جهاز استشعار مفيدة للكشف عن الخلايا والحمض النووي الضرر في الخلايا والأنسجة الثابتة.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage at JoVE.com

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

نبدي التجمع وتطبيق جهاز الجزيئية النطاق مدعوم من البروتين topoisomerase. وبناء عبارة عن مستشعر الحيوية الجزيئية التي تصف نوعان رئيسيان من فواصل الحمض النووي في أقسام الأنسجة عن طريق ربط two fluorophores مختلفة لتحقيق غاياتهم.

الجمعية في المختبر من نصف اصطناعية آلة الجزيئية واستخدامها للكشف عن الحمض النووي من التلف

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

in-vitro-assembly-semi-artificial-molecular-machine-its-use-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

11.5K Views.  Baylor College of Medicine. نبدي التجمع وتطبيق جهاز الجزيئية النطاق مدعوم من البروتين topoisomerase. وبناء عبارة عن مستشعر الحيوية الجزيئية التي تصف نوعان رئيسيان من فواصل الحمض النووي في أقسام الأنسجة عن طريق ربط two fluorophores مختلفة لتحقيق غاياتهم.

Video: In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

تصنيع أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية الدنا للكشف Reagentless من الأحماض النووية والبروتينات والجزيئات الصغيرة

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: إنتاجية عالية منصة 96-حسنا لقياس الحمض النووي من التلف في خلايا الإنسان Microarrayed

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning وجمعية Microvessels 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

الآلي الجمعية معالجة السائل الروبوتية أجهزة وحدات الحمض النووي

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

توليف Cationized Magnetoferritin للمغنطة فائقة السرعة من الخلايا

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) has been demonstrated to increase MSC osteogenic differentiation in vitro and promote bone healing in clinical settings. Here we describe the construction of an EStim cell culture chamber and its use in treating rat bone-marrow-derived MSC to enhance osteogenic differentiation. We found that treating MSCs with EStim for 7 days results in a significant increase in the osteogenic differentiation, and importantly, this pro-osteogenic effect persists long after (7 days) EStim is discontinued. This approach of pretreating MSCs with EStim to enhance osteogenic differentiation could be used to optimize bone tissue engineering treatment outcomes and, thus, help them to achieve their full therapeutic potential. In addition to this application, this EStim cell culture chamber and protocol can also be used to investigate other EStim-sensitive cell behaviors, such as migration, proliferation, apoptosis, and scaffold attachment.

Here we present a protocol for the construction of a cell culture chamber designed to expose cells to various types of electrical stimulation, and its use in treating mesenchymal stem cells to enhance osteogenic differentiation.

بناء واستخدام دائرة التحفيز الكهربائي لتعزيز Osteogenic التمايز في الخلايا الجذعية الوسيطة/اللحمية في المختبر

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically been studied in vivo in animal models showing characteristic patterns of cell migration. However, in vivo models have several limitations, including intercellular mediators that are difficult to access and analyze, as well as the inability to directly analyze human neutrophils. Because of these limitations, there is a need for an in vitro platform that studies swarming with human neutrophils and provides easy access to the molecular signals generated during swarming. Here, a multistep microstamping process is used to generate a bioparticle microarray that stimulates swarming by mimicking an in vivo infection. The bioparticle microarray induces neutrophils to swarm in a controlled and stable manner. On the microarray, neutrophils increase in speed and form stable swarms around bioparticle clusters. Additionally, supernatant generated by the neutrophils was analyzed and 16 proteins were discovered to have been differentially expressed over the course of swarming. This in vitro swarming platform facilitates direct analysis of neutrophil migration and protein release in a reproducible, spatially controlled manner.

This protocol generates bioparticle microarrays that provide spatially controlled neutrophil swarming. It provides easy access to the mediators that neutrophils release during migration and allows for quantitative imaging analysis.

الجسيمات الحيوية Microarrays للتحليل الكيميائي والجزيئي للالعدلة البشرية يحتشدون في المختبر

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

نماذج متقدمة الكبد 3D لاختبار السمية الجينية في المختبر بعد التعرض للمواد النانوية على المدى الطويل

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. Ultrasound-mediated sonoporation is an emerging technique for rapid intracellular delivery of biomolecules. Sonoporation occurs when cavitation of gas-filled microbubbles forms transient pores in nearby cell membranes, which enables rapid uptake of biomolecules from the surrounding fluid. Current techniques for in vitro sonoporation of cells in suspension are limited by slow throughput, variability in the ultrasound exposure conditions for each cell, and high cost. To address these limitations, a low-cost acoustofluidic device has been developed which integrates an ultrasound transducer in a PDMS-based fluidic device to induce consistent sonoporation of cells as they flow through the channels in combination with ultrasound contrast agents. The device is fabricated using standard photolithography techniques to produce the PDMS-based fluidic chip. An ultrasound piezo disk transducer is attached to the device and driven by a microcontroller. The assembly can be integrated inside a 3D-printed case for added protection. Cells and microbubbles are pushed through the device using a syringe pump or a peristaltic pump connected to PVC tubing. Enhanced delivery of biomolecules to human T cells and lung cancer cells is demonstrated with this acoustofluidic system. Compared to bulk treatment approaches, this acoustofluidic system increases throughput and reduces variability, which can improve cell processing methods for biomedical research applications and manufacturing of cell-based therapeutics.

This protocol describes the assembly and operation of a low-cost acoustofluidic device for rapid molecular delivery to cells via sonoporation induced by ultrasound contrast agents.