מחקר זה מומן על ידי מענק R01NS062842 מן המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ, המכונים הלאומיים לבריאות (VVD) וכן על ידי מענקים R21 NS064403 מן המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ, המכונים הלאומיים לבריאות באמצעות ערה (VVD) ו R21 EB006301 המכון הלאומי ביו הדמיה Bioengineering, המכונים הלאומיים לבריאות (VVD).

סעיפים לאיתור מכונת מבוססי מולקולרית צריכים להיות מוכנים הראשון, כי ההכנה שלהם לוקח זמן רב יותר מאשר ההרכבה של המכשיר מולקולרית. לבנות עובד גם עם 5-6μm בעובי לחתוך קטעים מתוך paraformaldehyde-קבוע, פרפין, משובצים אבני רקמות. השתמש המותגים שקופיות אשר שומרים על החלקים היטב, כגון ProbeOn פלוס שקופיות טעונה precleaned (פישר סיינטיפיק) או דומה. אנו ממליצים תחילה באמצעות רקמות עם דפוס מוכר של נזק לדנ&quot;א אשר מכיל גם I-II ו DNase DNase מסוג הפסקות, כמו עכברוש dexamethasone שטופלו אפופטוטיים התימוס 13,14. 1. הכנת חלקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הסעיפים במעמד שקופיות dewax ב קסילן במשך 15 דקות, להעביר אמבטיה קסילן טרי 5 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם על ידי עובר דרך ריכוזי אתנול ציון: 96% אתנול, 2x5min; אתנול 80% - 5min: מים - 2x5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקציר קטע עם Proteinasה ק השתמש 100μL פתרון 50μg/mL לכל סעיף. דגירה 15 &quot;בטמפרטורת החדר (23 ° C) בתא humidified. השעה ייתכן שיהיה צורך הסתגלות בהתאם לסוג רקמה. רקמות קשיח עשוי לדרוש יותר לעיכול. טיימס של 15-25 דקות משמשים בדרך כלל. מערכת העיכול לא מספקת עלולה לגרום האות החלש. Overdigestion על תוצאות יד אחרים היעלמות אותות שיבוש סעיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו במים מזוקקים דקות 2x10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת סעיף 100 μL לכל BSA של 2% עבור preblocking. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (23 ° C). במהלך תקופה זו להרכיב את המכונה המולקולרית. </li></ol> 2. הרכבה מכונות מולקולריות ריאגנטים כל מדורגים עבור נפח 25 סך μL, אשר מספקת לגילוי יחיד קטע רקמה בגודל ממוצע (10x10mm). הכרך וניתן לשנותם עד לפי הצורך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בתוך שפופרת פלסטיק קטנה לפי הסדר הבא: </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody> &lt;tr&gt; <td><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Bidistilled מים; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוליאתילן גליקול 8000, 15%; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון של 66 מ&quot;מ טריס HCl, pH 7.5, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 0.1 מ&quot;מ dithioerythritol, 1 mM ATP, (כלומר האנזים T4 קבוע למאגר ה-DNA); </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70 pmoles של oligonucleotide 1, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 215 pmoles (1.76-7.1 מיקרוגרם) VACC Topo </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 יחידות האנזים T4 DNA (500 U / mL) </li></ol></td></tr></tbody></table><ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות על ידי pipetting. מולקולרית לבנות כמעט מיד עצמית מרכיב בפתרון זה והוא יכול לשמש מיד בטמפרטורת החדר (23 ° C). הגדלת הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס חוסם את האנזים T4 DNA מבוסס רכיב של תיוג. </li></ol> 3. באמצעות מכונות מולקולריות בסעיפים רקמות 5&#39;OH תווית כפולה 5&#39;PO4 הפסקות DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הפתרון preblocking וליישם 25μL של תערובת התגובה מלא המכיל 70 pmoles של oligonucleotide 1, 53-215 pmoles (1.76-7.1 מיקרוגרם) VACCTopo ו -10 יחידות האנזים T4 DNA (500 U / ml) בתמיסה של HCl 66 מ&quot;מ טריס, pH 7.5, MgCl 5mm 2, 0.1 מ&quot;מ dithioerythritol, 1 mM ATP, ו 15% פוליאתילן גליקול-8000. Oligonucleotide אותו רצף נושאת תווית FITC יחיד, oligonucleotide 2, יכול לשמש במקום לצורך זיהוי של סוג אחד של הפסקות DNA. במקרה כזה האנזים להשמיט מן התגובה תיוג. גם במצב זה פתרון של 50mm טריס-HCL, pH 7.4, 15% PEG-8000 יכול לשמש במקום למאגר ה-DNA האנזים T4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר (23 ° C) בתא humidified עם coverslip פלסטיק. הגנה מן האור. הפחתת הטמפרטורה עד 16 מעלות מפחיתה את האות האנזים מבוסס; העלייה בטמפרטורה עד 37 מעלות צלזיוס לחלוטין מבטל את האות האנזים מבוסס. עיכוב חלקי של האנזים לפעמים מתרחשת לערבב את התגובה, אולי בשל מזהמים הציג בהכנות topoisomerase. לכן, דגירה ארוך (2-4 שעות), ייתכן שיהיה צורך במיוחד כאשר sמספרים ignificant של האנזים שכותרתו שוברת נוכחים. למרות ששני האנזים אותות topo ניתן לצפות בשלב זה, במקרים רבים האות האנזים ניתן לשפר עוד יותר על ידי יישום מחדש של תמהיל תגובה ללא VACC Topo ו oligonucleotide כפול שכותרתו, אך המכיל oligonucleotide מכבנה בצורת (oligonucleotide 3) (35 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ו-DNA האנזים T4 (250 U / mL). כדי לשפר את האות לשלב 3, כדי לראות את התגובה ללא שיפור עבור לשלב 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר coverslips ידי בעדינות לטבול את השקופיות אנכית בצנצנת Coplin המכיל מים בטמפרטורת החדר. לשאוב מים עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שפר את האות האנזים על ידי יישום של 25 μL לערבב תגובה ללא VACC Topo ו oligonucleotide 1, אך המכיל oligonucleotide 3: 66 מ&quot;מ טריס HCl, pH 7.5, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 0.1 מ&quot;מ dithioerythritol, 1 mM ATP, ו 15% פוליאתילן גליקול- 8000, 5 יחידות האנזים T4 DNA, 35 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​oligonucleotide 3 (מכבנה בוטה הסתיים). ההיקף הכולל של הפתרון ca תיוגn להיות scaled עד כדי להכיל את החלקים גדול יותר. דגירה של שעה 18 (לילה) בטמפרטורת החדר (23 ° C) בתא humidified עם coverslip פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר coverslips ידי בעדינות לטבול את השקופיות אנכית בצנצנת Coplin המכיל מים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשטוף דקות סעיף 3x10 במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם חיץ סודיום ביקרבונט. פתרון בסיסי לשטוף משפר FITC פלואורסצנטי, שהוא רגיש pH ו מצטמצם משמעותית מתחת pH 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי בסעיף פתרון antifading (Vectashield עם DAPI), coverslip ולנתח את האות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פעמיים גדיל DNA עם הפסקות 5&#39;OH לזרוח יהיה ירוק, 5&#39;PO 4 שובר - יהיה לזרוח אדום (איור 2). </li></ol> 4. נציג תוצאות <img alt="באיור 2." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig2.jpg" /> באיור 1. חצי מלאכותי מכונה מולקולרית מזהה שני סוגים שלה-DNA נזק באתרם. מכונת פלורסנט עצמית מרכיב כאשר VACC Topo נקשר מכבנה פעמיים 32-mer. המכשיר מתחיל הניתוח עצמו על ידי פיצול לשתי יחידות הגלאי דרך topoisomerase מתוצרת לחתוך בסוף &#39;3 של רצף ההכרה. התוצאה היא תהליך מחזורי שבו יחידת FITC שכותרתו ברציפות מפריד religates בחזרה ליחידה, שכותרתו rhodamine. זה נמשך עד להפסקה DNA לזיהוי הוא נתקל. כאשר acceptor כזה אלטרנטיבה (DNA 5&#39;OH בוטה לשבור סוף) נמצא קטע הרקמה, החלק FITC יהיה ולקשור אליו. החלק הנותר rhodamine יצרף ת.ד. &quot;5 4 בוטה DNA שובר סוף בעזרת האנזים דנ&quot;א T4. כתוצאה מכך, שני סוגי הפסקות DNA מזוהים בו זמנית. <img alt="באיור 1." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig1.jpg" /> באיור 2. מכונת תוויות מולקולרית כפול שני סוגים של הפסקות DNAבקטע הרקמה של dexamethasone שטופלו התימוס. בלאנט, הסתיימו הפסקות DNA של DNase I-II ו DNase מסוג מזוהים באזורים קורטיקליים הרתי העוברים אפופטוזיס. הקרינה cytoplasmic הירוק (5&#39;OH הפסקות DNA) סימני מקרופאגים קליפת המוח לעכל חומר גרעיני של thymocytes אפופטוטיים. אות זה מופק על ידי VACC Topo, ו localizes כדי phagolysosomes עם DNA המכיל 5&#39;OH פעמיים גדיל הפסקות 11,12. אדום פלואורסצנטי (5&#39;PO 4 הפסקות) תוויות גרעינים של thymocytes אפופטוטיים לא נבלע על ידי מקרופאגים. מספרים עצומים של thymocytes בו זמנית לעבור אפופטוזיס מלווה דור 5&#39;PO 4 פעמיים גדיל הפסקות, דמיינו ידי תיוג האנזים מבוסס. הפסקות אלה ממוקמים בפריפריה גרעיני, ויצרו טבעת בצורת דפוסי. כל הגרעינים הסלולר הם דמיינו ידי counterstaining עם DAPI (כחול פלואורסצנטי).

<ol>
	<li>Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).</li><li>Schuldt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Pol+expeditions.">Dynamic Pol expeditions.</a> Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+machines:+how+motion+and+other+functions+of+living+organisms+can+result+from+reversible+chemical+changes.">Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).</li><li>Schneider, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+molecular+machines+I.+Channel+capacity+of+molecular+machines.">Theory of molecular machines I. Channel capacity of molecular machines.</a> J. Theor. Biol. 148, 83-123 (1991).</li><li>McClare, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+machines,+Maxwell's+demon+and+living+organisms.">Chemical machines, Maxwell's demon and living organisms.</a> J. Theor. Biol. 30, 1-34 (1971).</li><li>Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+as+a+molecular+machine.">Ribosome as a molecular machine.</a> FEBS Lett. 514, 2-10 (2002).</li><li>Fabbrizzi, L., Foti, F., Licchelli, M., Maccarini, P. M., Sacchi, D., Zema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+molecular+machines:+pH-induced+intramolecular+motions+in+a+fluorescent+nickel(II)+scorpionate+complex.">Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex.</a> Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).</li><li>Drexler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation. , (1992).</li><li>Freitas, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanomedicine: basic capabilities. , (1999).</li><li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+probes+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET):+designs+and+applications.">DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications.</a> BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).</li><li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis:+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA.">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16, 4599-4614 (2011).</li><li>Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-artificial+fluorescent+molecular+machine+for+DNA+damage+detection.">Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection.</a> Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).</li><li>Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+double-strand+breaks+with+single-base+3'+overhangs+in+cells+undergoing+apoptosis+but+not+necrosis.">Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis.</a> J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).</li><li>Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin-labeled+hairpin+oligonucleotides.+Probes+to+detect+double-strand+breaks+in+DNA+in+apoptotic+cells.">Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells.</a> Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).</li><li>Jones, R. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft Machines: Nanotechnology and life. , (2007).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בסרטון הזה, אנו מראים כיצד להרכיב ולהשתמש כפול תיוג DNA חיישן נזק. החיישן הוא מכונה מולקולרית מונע על ידי מנוע ביו מולקולרית, וירוס המקודד חלבון VACC Topo מקושר עם מרכיבים מלאכותיים. הפיתוח המוצג מדגים גישה ביו מופעלת הדוגלת בהתאמת מבנים ביולוגיים, ארכיטקטורות בפועל חלקים...

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קסילן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 80 ו - 96% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון 2% אלבומין בסרום שור (BSA) במים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oligonucleotide 1: סיכת ראש כפולה, כפולה עם שכותרתו והעמסת ו tetramethylrhodamine: </li></ol> 5&#39;-AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC tta ACG CAT R AT מהפקולטה לרוקחות אוכלים TT-3 &quot;; F - FITC-DT; R - Tetramethylrhodamine-DT. אחרים אדום העביר fluorophores כגון BODIPY TR, rhodamine או טמרה יכול לשמש במקום tetramethylrhodamine כמו R. לחילופין אתה יכול להשתמש 2 oligonucleotide -. בודדת מכבנה פעמיים שכותרתו עם והעמסת (לצורך זיהוי של סוג אחד של הפסקות DNA (DNase מסוג II בלבד) בדיקה חד fluorophore נושאי משמעותית פחות יקר נוח בכל אחת סוג לשבור DNA היא להיות מתויג: 5&#39;-AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC tta ACG CAT ATG CGT T-3 &quot;; F - FITC-DT </p&gt; <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oligonucleotide 3. בלאנט, הסתיים rhodamine שכותרתו מכבנה להגברת האות של קשירת באתרו עם האנזים T4 DNA: 5&#39;-CTA מהפקולטה לרוקחות אוכלים GAC C R G GTC TAG CGC-3 &quot;; R - Tetramethylrhodamine-DT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vaccinia DNA topoisomerase l (VACC Topo) - 3000 U / μL (טכנולוגיות Vivid). בניסויים הראשונים השתמשנו pmoles 215 (7.1 מיקרוגרם) של Topo VACC לכל μL 25 כל תמהיל התגובה. עם זאת, ריכוז topoisomerase ניתן לצמצם באופן משמעותי ללא איבוד של רגישות. אנחנו אחר כך השתמשו בכמות פחותה של ארבע פעמים VACC Topo לכל סעיף (1.76 מיקרוגרם ב μL 25 של תערובת התגובה לכל סעיף) עם תוצאות דומות. צמצום כמות האנזים עד 880 ננוגרם (ב μL 25 של תערובת התגובה) הביא אות חלש של 8.8 ננוגרם VACC Topo הפיק שום אות לזיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> T4 DNA האנזים 5 U / μL (Roche). זו הכנה האנזים מרוכז מאוד ונותן את האות הטוב ביותר בתנאי הניסוי שלנו. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 x חיץ תגובה עבור האנזים T4 DNA: 660 mM טריס-HCl, 50 מ&quot;מ MgCl 2, dithioerythritol 10 מ&quot;מ, 10 mM ATP, ה-pH 7.5 (20 ° C) (Roche). ATP במאגר התגובה הוא נהרס בקלות במחזורים חוזרים של הפשרה, הקפאה. Aliquot חיץ מנות קטנות μL 15-20 ולאחסן ב - 20 ° C. השתמש פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30% (w / v) פתרון של PEG-8000 (Sigma) במים bidistilled. 15% PEG-8000 בתמהיל תגובה מאוד מגרה את זיהוי, להגדיל את ריכוזי יעיל של המרכיבים שלה על ידי הרחקה נפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Proteinase K (Roche) 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​מניות פתרון במים מזוקקים. חנות ב - 20 ° C. בשנת פתרון התגובה 50mg/mL להשתמש ב-PBS, מוכנים מהמלאי. אל חוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Vectashield עם DAPI (וקטור מעבדות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביקרבונט חיץ נתרן: 50 מ &#39;NaHCO 3, 15m M NaCl, pH 8.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכוכית 22x22mm או 22x40mm או coverslips פלסטיק. Coverslips פלסטיק עדיפים במהלך התגובה, כפי שהםמחדש קל להסיר הסעיף. </li></ol>

in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage

באופן טבעי ביו מולקולרית מכונות לעבוד בכל תא חי להציג מגוון של עיצובים 1-6. עם זאת, פיתוח של מכונות מולקולריות מרכזי מלאכותי על מכשירים המסוגלים תנועה כיוונית, כלומר מנועים מולקולריים, ועל חלקים מוקטנת שלהם מכני (גלגלים, axels, תליונים וכו &#39;) 7-9. זה מחקה את המאקרו מכונות, למרות התכונות הפיסיקליות חיוני עבור התקנים אלה, כגון אינרציה ושימור תנע, לא שמיש בסביבות nanoworld 10. עיצובים חלופיים, אשר לא פעל תוכניות מכני macromachines ולהשתמש במנגנוני התפתח באבולוציה של מולקולות ביולוגיות, יכולים לנצל את התנאים הספציפיים של nanoworld. חוץ מזה, התאמת מולקולות ביולוגיות בפועל למטרות ננו עיצוב מפחית הסכנות הטמונות במוצרים ננוטכנולוגיה עשויה להוות. כאן אנו מדגימים את הרכבה ואת היישום של לבנות חיים ביו אפשרה כאלה, כמואמי-מלאכותי התקן מולקולרי המשלבת מכונה מולקולרית טבעיים המתחוללים עם מרכיבים מלאכותיים. מנקודת מבט enzymology, לבנות שלנו הוא מעצב פלורסנט אנזימים המצע מורכב להרכיב לבצע פונקציה שימושית ספציפית. הרכבה זו מעצם הגדרתה מכונה מולקולרית, כפי שהוא מכיל 12. עם זאת, השילוב שלו עם החלק מהונדסים - סיכת ראש כפול פלורסנט - מחדש מכוון שזה משימה חדשה של תיוג נזק לדנ&quot;א 12. לבנות שלנו מרכיב מתוך ה-DNA 32-mer ו אנזים vaccinia topoisomerase אני (VACC Topo). המכונה ואז משתמש בתוכן משלה לפברק שתי יחידות גלאי שכותרתו fluorescently (איור 1). אחת היחידות (פלואורסצנטי ירוק) נושא VACC Topo מחוברת קוולנטית אל 3&#39;end שלה ליחידה אחרת (אדום פלואורסצנטי) היא סיכת חינם עם 3&#39;OH סופנית. היחידות קצרת ובמהירות מחדש בחזרה לבנות המקורי, אשר לאחר מכן recleaves.בהעדר DNA הפסקות אלו שתי יחידות נפרדות ברציפות religate בצורה מחזורית. בקטעים רקמה עם נזק לדנ&quot;א, יחידת topoisomerase נושאי גלאי סלקטיבי מייחסת בוטה, שהסתיימה עם הפסקות DNA 5&#39;OH (DNase II מסוג הפסקות) 11,12, fluorescently תיוג אותם. השני, אנזים ללא מכבנה נוצר לאחר מחשוף oligonucleotide, יהיה ולקשור את הפסקה 5&#39;PO בוטה, הסתיים 4 (DNase אני מסוג הפסקות) 11,12, אם האנזים T4 DNA נמצא הפתרון 13,14. כאשר האנזים T4 DNA הוא הוסיף קטע רקמה או פתרון המכילים DNA עם 5&#39;PO 4 קהה הסתיים הפסקות, האנזים מגיב עם 5&#39;PO 4 קצוות DNA, ויצרו חצי יציב אנזים-DNA קומפלקסים. סיכות הסתיים בוטה יקיימו אינטראקציה עם אלה מתחמי שחרור האנזים סיכות ו קוולנטית קישור ל-DNA, ובכך תיוג 5&#39;PO 4 בוטה-DNA הסתיימו הפסקות. פיתוח זה מדגים גישה מעשית חדשה העיצוב דואר של מכונות מולקולריות ומספק חיישן שימושי עבור זיהוי של אפופטוזיס ו-DNA נזק בתאים וברקמות קבוע.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage at JoVE.com

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

אנו מדגימים את הרכבה ואת היישום של התקן מולקולרי בקנה מידה מופעל על ידי חלבון topoisomerase. לבנות הוא חיישן ביולוגי מולקולרי אשר תוויות שני סוגים עיקריים של הפסקות DNA בסעיפים רקמה על ידי מצרפת שניים fluorophores שונים למטרותיהם.

בשנת העצרת במבחנה של מכונת חצי מלאכותית מולקולרית השתמש שלה עבור איתור של נזק לדנ&quot;א

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

in-vitro-assembly-semi-artificial-molecular-machine-its-use-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

11.5K Views.  Baylor College of Medicine. אנו מדגימים את הרכבה ואת היישום של התקן מולקולרי בקנה מידה מופעל על ידי חלבון topoisomerase. לבנות הוא חיישן ביולוגי מולקולרי אשר תוויות שני סוגים עיקריים של הפסקות DNA בסעיפים רקמה על ידי מצרפת שניים fluorophores שונים למטרותיהם.

Video: In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

המצאה של אלקטרוכימי-DNA Biosensors לגילוי Reagentless של חומצות, חלבונים ומולקולות קטנות גרעין

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: תפוקה גבוהה 96-ובכן פלטפורמה למדידת נזק לדנ&quot;א בתאי Microarrayed אדם

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

אוטומטית רובוטית טיפול בנוזלים הרכבה של התקנים DNA מודולרי

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

סינתזה של Cationized Magnetoferritin עבור המגנטיזציה אולטרה-מהירה של תאים

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) has been demonstrated to increase MSC osteogenic differentiation in vitro and promote bone healing in clinical settings. Here we describe the construction of an EStim cell culture chamber and its use in treating rat bone-marrow-derived MSC to enhance osteogenic differentiation. We found that treating MSCs with EStim for 7 days results in a significant increase in the osteogenic differentiation, and importantly, this pro-osteogenic effect persists long after (7 days) EStim is discontinued. This approach of pretreating MSCs with EStim to enhance osteogenic differentiation could be used to optimize bone tissue engineering treatment outcomes and, thus, help them to achieve their full therapeutic potential. In addition to this application, this EStim cell culture chamber and protocol can also be used to investigate other EStim-sensitive cell behaviors, such as migration, proliferation, apoptosis, and scaffold attachment.

Here we present a protocol for the construction of a cell culture chamber designed to expose cells to various types of electrical stimulation, and its use in treating mesenchymal stem cells to enhance osteogenic differentiation.

בנייה ושימוש חדר גירוי חשמלי לשיפור Osteogenic התמיינות בתאי גזע Mesenchymal/סטרומה במבחנה

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically been studied in vivo in animal models showing characteristic patterns of cell migration. However, in vivo models have several limitations, including intercellular mediators that are difficult to access and analyze, as well as the inability to directly analyze human neutrophils. Because of these limitations, there is a need for an in vitro platform that studies swarming with human neutrophils and provides easy access to the molecular signals generated during swarming. Here, a multistep microstamping process is used to generate a bioparticle microarray that stimulates swarming by mimicking an in vivo infection. The bioparticle microarray induces neutrophils to swarm in a controlled and stable manner. On the microarray, neutrophils increase in speed and form stable swarms around bioparticle clusters. Additionally, supernatant generated by the neutrophils was analyzed and 16 proteins were discovered to have been differentially expressed over the course of swarming. This in vitro swarming platform facilitates direct analysis of neutrophil migration and protein release in a reproducible, spatially controlled manner.

This protocol generates bioparticle microarrays that provide spatially controlled neutrophil swarming. It provides easy access to the mediators that neutrophils release during migration and allows for quantitative imaging analysis.

ביו-מאמר מיקרומערכים למיקרוטקטיקה וניתוח מולקולרי של נויטרופילים אנושיים

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

דגמי כבד תלת-ממדיים מתקדמים לבדיקות גנוטוקסיות במבחנה בעקבות חשיפה ננו-חומרית לטווח ארוך

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. Ultrasound-mediated sonoporation is an emerging technique for rapid intracellular delivery of biomolecules. Sonoporation occurs when cavitation of gas-filled microbubbles forms transient pores in nearby cell membranes, which enables rapid uptake of biomolecules from the surrounding fluid. Current techniques for in vitro sonoporation of cells in suspension are limited by slow throughput, variability in the ultrasound exposure conditions for each cell, and high cost. To address these limitations, a low-cost acoustofluidic device has been developed which integrates an ultrasound transducer in a PDMS-based fluidic device to induce consistent sonoporation of cells as they flow through the channels in combination with ultrasound contrast agents. The device is fabricated using standard photolithography techniques to produce the PDMS-based fluidic chip. An ultrasound piezo disk transducer is attached to the device and driven by a microcontroller. The assembly can be integrated inside a 3D-printed case for added protection. Cells and microbubbles are pushed through the device using a syringe pump or a peristaltic pump connected to PVC tubing. Enhanced delivery of biomolecules to human T cells and lung cancer cells is demonstrated with this acoustofluidic system. Compared to bulk treatment approaches, this acoustofluidic system increases throughput and reduces variability, which can improve cell processing methods for biomedical research applications and manufacturing of cell-based therapeutics.

This protocol describes the assembly and operation of a low-cost acoustofluidic device for rapid molecular delivery to cells via sonoporation induced by ultrasound contrast agents.