فإن الكتاب أود أن أشكر سالي روبرتس (جامعة برمنغهام، برمنغهام المملكة المتحدة) للهدية نوع من الأجسام المضادة E1E4. وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعهد الوطني للسرطان (4R00CA137160-03).

1. استعدادا للثقافات الطوافة عضوي النمط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وشبكات طوف أول معدن كثيرا أن تعامل مع حامض الكبريتيك الكروم لإزالة أية بقايا يمكن أن تتداخل مع عملية التفاضل. شبكات معدنية غمر في كوب من الزجاج التي تحتوي على حامض الكبريتيك لمدة ساعة، ثم تشطف باستمرار بين عشية وضحاها مع ماء الصنبور. بعد ليلة وضحاها شطف، يجب أن تشطف شبكات طوف لمدة 3-5 ساعات في الماء المقطر مزدوجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقديم الدعم للطوافات، والانحناء ثلاث جهات لطوف عن 0.5 سم على مسافة متساوية من بعضها البعض. وينبغي بعد ذلك أن تعقم شبكات معدنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة إعادة 10X بإضافة 2.2 غرام و 4.8 NaHCO3 Hepes ز. تذوب في 100 مل من هيدروكسيد الصوديوم M 0.05. تصفية تعقيم وتخزين في aliquots 5 مل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد DMEM 10X بدون بيكربونات الصوديوم. تصفية تعقيم وتخزين في aliquots 5 مل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد عامل نمو البشرة الفأر: ذوب 100 ملغ من EGF و 10 ملغ من BSA كل منزوع الأيونات في 10 مل DDH 2 0. الجمع بين EGF وديوان الرقابة المالية وإضافة الى 80 مل من DDH منزوع الأيونات 2 0 لإجمالي حجم 100 مل. فلتر تعقيم، قسامة (5 مل) ومخزن في -20 درجة مئوية. لكل لتر من متوسط ​​E إضافة 5 مل من EGF ملغ / مل 1 (التركيز النهائي 5 نانوغرام / مل). </li></ol> 2. إعداد الهلام الكولاجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مطلوب واحد جل الكولاجين لكل طوف. ينبغي أن تظل الكولاجين على الجليد لمنعه من ترسيخ. كل هلام الكولاجين يتطلب 3 مل من مزيج الكولاجين تتكون من: 2.4 مل من البرد نوع الكولاجين الجرذ الذيل الأول (تركيز النهائي 3-4 ملغ / مل)، 0.3 مل العازلة إعادة 10X، 0.3 DMEM مل 10X and1-2 X 10 6 الماوس 3T3 J2 الخلايا الليفية والخلايا المغذية. عن حلول تركيز عال من الكولاجين ذيل فأر، في تمييع حامض الخليك 0،02 م لتحقيق تركيز العمل الصحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد المواد الهلامية الكولاجين (الطوافات)، ستحتاج ثم حساب مزيج الرئيسي لكمية الكولاجين، reconstit 10Xالعازلة ution، DMEM 10X والخلايا الليفية J2 المطلوبة. وتشمل بما فيه الكفاية في كل مزيج رئيسية لالهلام إضافي 3-4 بسبب اللزوجة من الكولاجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحضير هلام الكولاجين، ويعرض للتريبسين في الخلايا الليفية J2 وتحييد مع المتوسط. الجمع بين جميع الخلايا الليفية والمكان في قارورة 50 مل مخروطي. عد الخلايا لتحديد عدد من الطوافات التي يمكن تقديمها. مرة أخرى، هناك حاجة 1-2x10 6 الليفية في هلام الكولاجين، وبالتالي في الطوافة. تدور باستمرار على الخلايا على سرعة منخفضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في المتوسط ​​من بيليه الليفية وresuspend في كمية مناسبة من العازلة إعادة 10X، DMEM 10X والكولاجين لعدد من الطوافات محسوب. إضافة الكولاجين الماضي لمنع الجل من ترسيخ بسرعة كبيرة جدا. مرة واحدة يتم إضافة الكولاجين، وخلط بسرعة، ولكن بلطف لمنع دخول من الفقاعات في هلام. وينبغي أن يكون جل اللون البرتقالي المحمر، مما يدل على درجة الحموضة الصحيح. إذا كان خليط جل أصفر أيضا، إضافة بضع قطرات من فلتر تعقيم 1Nهيدروكسيد الصوديوم والمزيج بلطف للحصول على اللون الصحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 3 مل من الكولاجين: إلى آبار طبق ثقافة 6 جيدا خليط الخلايا الليفية. وينبغي pipetted الخليط الكولاجين ببطء أسفل الجانب من كل بئر لتجنب توليد فقاعات. وضع لوحة في 37 درجة مئوية نسيج ثقافة حاضنة والسماح ليصلب لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 30 دقيقة، أضف 3 مل من المتوسط ​​E مع صندوق تعديل العولمة الأوروبي إلى الجزء العلوي من هلام الكولاجين طدت والعودة إلى لوحة الحاضنة. ينبغي أن تظل المواد الهلامية في 37 درجة مئوية على الأقل يوم واحد ولكنها تستخدم في غضون أربعة أيام. النتائج المثلى تحدث بعد يومين من الحضانة. </li></ol> 3. إعداد الكيراتينية للتمايز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن نمت الخلايا الكيراتينية مرور الأقل إلى ما يقرب من 70٪ confluency. كل طوف يتطلب 1-2x10 6 الكيراتينية. يعرض للتريبسين في القرنية وتحييد مع متوسط ​​E مع صندوق تعديل العولمة الأوروبي. عد الخلايا لتحديد عدد من الطوافات التي يمكن تقديمها. تدور أسفل الخلايا في جمعية مهندسي البترول منخفضةأد. Resuspend لبيليه في 1 مل من المتوسط ​​E مع EGF لكل ثقافة طوف محسوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في المتوسط ​​من المواد الهلامية الكولاجين عن طريق إمالة لوحة (6) وبشكل جيد. أضف 2 مل من المتوسط ​​E جديدة مع صندوق تعديل العولمة الأوروبي إلى كل جيل. لكل جيل، إضافة بعناية 1 مل من الخلايا الكيراتينية معلق إلى 2 مل من المتوسط ​​E موجودة بالفعل في البئر. الماصة بلطف القرنية بالإضافة إلى 2 مل من وسائل الاعلام ومن ثم السماح سقوط قطرة من زاوية ثانية على هلام. قد تهتز أو تعكير لوحة يؤدي إلى توزيع غير متساو من الخلايا إلى جانب واحد من هلام الكولاجين. وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن تنمو هذه الخلايا إلى confluency، لتحل محل المتوسطة E يوميا. كانت الخلايا متموجة عندما يتغير المتوسطة إلى يوم واحد أصفر بعد حدوث تغيير في المتوسط. هذا عادة ما يستغرق 2-4 أيام. إذا كان المتوسط ​​لم يتغير من قبل أربعة أيام، والمضي قدما الى الخطوة التالية. </li></ol> 4. جعل الثقافات الطوافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عازمة الجانبين استخدام ملقط معقم لوضع أساسات معدن عقيم شبكة، بانخفاض، في طبق 10 سم. نضح في المتوسط ​​من هلام الكولاجين. لتخفيف هلام من جانبي جيد، اذهب حول محيط الجل مع ملعقة معقمة باستخدام الحركة صعودا ونزولا. لإزالة هلام الكولاجين، وإمالة لوحة قليلا، ورفع عن طريق وضع تحت الملعقة. وضع الجل الكولاجين على الشبكة المعدنية من دون توليد فقاعات بين الشبكة وهلام و. يمكن وضعها في اثنين من المواد الهلامية في كل شبكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل جعل واجهة الهواء السائل، إضافة المتوسطة E بدون EGF ببطء إلى أسفل طبق ذلك شبكة مجموعة كبيرة لمس وسائل الاعلام ولكن جل الكولاجين ليست كذلك. وينبغي أن وسائل الإعلام لا تأتي من خلال الفتحات الموجودة في الشبكة. إضافة المتوسطة ببطء لتجنب توليد فقاعات في إطار الشبكة، حيث سيؤدي ذلك إلى منع التمييز موحدة. احتضان والطوافات في 37 درجة مئوية وتغيير المتوسطة كل يوم الحفاظ على واجهة الهواء السائل. حصاد طوافات بعد 14 يوما. </li></ol> 5. ممثل النتائج عندما روالذي كان يقوم به بروتوكول بشكل صحيح مع الكيراتينية الأولية، فإن هذا الإجراء يؤدي إلى ظهارة جيدا متباينة حيث الطبقات المختلفة من الجلد واضحة. يمكن تحقيق ذلك من خلال الفحص النسيجي بواسطة تلطيخ أقسام الثقافات لطوف هيماتوكسيلين ويوزين (H &amp; E)، كما هو مبين في الشكل 1B. H &amp; E تلطيخ مفيد أيضا لدراسة مورفولوجية الطوافات وتأثير الفيروسات أو المركبات المضادة للفيروسات على قدرة الخلايا لتطبق وتفرق. على سبيل المثال، وخصوصا طوافات مصنوعة من فيروس الورم الحليمي البشري خلد الكيراتينية الإنسان الأساسية (HFK-31) مقابل سمكا على عوامات مصنوعة من الطبيعي الكيراتينية القلفة البشرية (HFK)، مما يعكس زيادة في نسبة الانتشار وقدرة بروتينات فيروس الورم الحليمي البشري للحفاظ على الخلايا التفريق نشط في دورة الخلية (الشكل 1B) 10. وهذا يؤدي إلى الإبقاء على النوى في جميع أنحاء البشرة، في حين أن الخلايا الكيراتينية العادي الخروج من دورة الخلية على التمايز، مما أدى إلى انهيارنووي مغلف. لمزيد من التمايز عن كثب فحص، ويمكن أن يؤديها المناعية لفحص علامات التمايز محددة، بما في ذلك cytokeratins، فضلا عن involucrin، وfilaggrin. يتم التعبير عن cytokeratins مختلفة في مراحل معينة من التمايز 7. كما هو مبين في الشكل 2، لا يتم التعبير عن cytokeratin 10 (K10) في الطبقة القاعدية، ويوجد فقط في الطبقات suprabasal التي تتكون من خلايا التفريق تدريجيا. في الطوافات فيروس الورم الحليمي البشري الإيجابية، يتم تأخير التعبير عن K10 مقارنة بما كان عليه من الخلايا القرنية الطبيعية، والتي تعكس مرة أخرى من تأثير البروتينات فيروس الورم الحليمي البشري على تمييز خلية كيراتينية. ويمكن أيضا أن تستخدم المناعية لدراسة الملف التعبير عن الجينات الفيروسية. هو مبين في الشكل (3) هو تلطيخ ممثل دراسة التعبير عن بروتين فيروس الورم الحليمي البشري E4 ^ E1، وهو البروتين الذي أواخر التعبير يقتصر على الطبقات العليا من البشرة. كما هو متوقع، يتم احترام أي تلطيخ في الثقافات طوف من هوما طبيعين الكيراتينية القلفة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig1.jpg" /> الشكل 1. مخطط) من طريقة لإعداد الثقافات طوف عضوي النمط من الخلايا الكيراتينية الأولية أو خطوط الخلايا الظهارية. B) هيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ الثقافات طوف عضوي النمط المتولدة من الخلايا الكيراتينية القلفة الإنسان الحفاظ على ثابت HPV-31 (HFK-31) episomes، أو من الطبيعي الكيراتينية القلفة البشرية (HFK). ويتم تحديد طبقات الفردية الظهارية، وكذلك سد الكولاجين. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig2.jpg" /> الشكل 2، ويقتصر Cytokeratin 10 (K10) التعبير للطبقات suprabasal من الظهارة. تم تنفيذ المناعية على المقاطع العرضية للثقافات طوف عضوي النمط المتولدة من خلايا-31 HFK، فضلا عن HFKs طبيعي ان استخدام أجسام مضادة لK10. وكان counterstained الحمض النووي الخلوي مع دابي. تم القبض على الصور باستخدام أسيوطمضان المجهر ocal. تبين الأسهم الطبقة القاعدية من البشرة. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig3.jpg" /> الشكل (3)، وفيروس الورم الحليمي البشري E1 ^ ينتج بروتين E4 في وقت متأخر من مرحلة مثمرة من دورة الحياة الفيروسية. تم تنفيذ المناعية على المقاطع العرضية للثقافات طوف عضوي النمط المتولدة من خلايا-31 HFK، فضلا عن HFKs العادية باستخدام الأجسام المضادة لE1E4. وكان counterstained الحمض النووي الخلوي مع دابي. تم القبض على الصور باستخدام مضان المجهري متحد البؤر. تبين الأسهم الطبقة القاعدية من البشرة.

<ol>
	<li>Andrei, G., Duraffour, S., VandenOord, J., Snoeck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+raft+cultures+for+investigations+of+virus+growth,+pathogenesis+and+efficacy+of+antiviral+agents.">Epithelial raft cultures for investigations of virus growth, pathogenesis and efficacy of antiviral agents.</a> Antiviral Research. 85, 431-449 (2010).</li><li>Asselineau, D., Prunieras, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+'simplified'+skin:+control+of+fabrication.">Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication.</a> The British Journal of Dermatology. 111, 219-222 (1984).</li><li>Bodily, J., Alam, S., Chen, H., Meyers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Organotypic epithelial raft cultures and the study of the natural history of human papillomavirus. , (2006).</li><li>Cheng, S., Schmidt-Grimminger, D. C., Murant, T., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation-dependent+up-regulation+of+the+human+papillomavirus+E7+gene+reactivates+cellular+DNA+replication+in+suprabasal+differentiated+keratinocytes.">Differentiation-dependent up-regulation of the human papillomavirus E7 gene reactivates cellular DNA replication in suprabasal differentiated keratinocytes.</a> Genes &#38; Development. 9, 2335-2349 (1995).</li><li>Dollard, S. C., Wilson, J. L., Demeter, L. M., Bonnez, W. R., Reichman, C., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+human+papillomavirus+and+modulation+of+the+infectious+program+in+epithelial+raft+cultures.+OFF.">Production of human papillomavirus and modulation of the infectious program in epithelial raft cultures. OFF.</a> Genes &#38; Development. 6, 1131-1142 (1992).</li><li>Frattini, M. G., Lim, H. B., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+synthesis+of+oncogenic+human+papillomaviruses+requires+episomal+genomes+for+differentiation-dependent+late+expression.">In vitro synthesis of oncogenic human papillomaviruses requires episomal genomes for differentiation-dependent late expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 3062-3067 (1996).</li><li>Kopan, R., Traska, G., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoids+as+important+regulators+of+terminal+differentiation:+examining+keratin+expression+in+individual+epidermal+cells+at+various+stages+of+keratinization.">Retinoids as important regulators of terminal differentiation: examining keratin expression in individual epidermal cells at various stages of keratinization.</a> The Journal of Cell Biology. 105, 427-440 (1997).</li><li>Longworth, M. S., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+human+papillomaviruses+in+differentiating+epithelia.">Pathogenesis of human papillomaviruses in differentiating epithelia.</a> Microbiology and Molecular Biology Review. 68, 362-372 (2004).</li><li>Meyers, C., Frattini, M. G., Hudson, J. B., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+human+papillomavirus+from+a+continuous+cell+line+upon+epithelial+differentiation.">Biosynthesis of human papillomavirus from a continuous cell line upon epithelial differentiation.</a> Science. 257, 971-973 (1992).</li><li>Wilson, R., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Differentiation of HPV-Containing Cells Using Organotypic Raft Culture or Methylcellulose. , 119-119 (2006).</li><li>zur Hausen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papillomavirus+infections--a+major+cause+of+human+cancers.">Papillomavirus infections--a major cause of human cancers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1288, F55-F78 (1996).</li></ol>

ليس لدينا ما يكشف.

نحن هنا وصف طريقة التي يمكن استخدامها لدراسة التمايز الظهارية بشكل عام، ولكن يمكن أيضا أن تتكيف بسهولة لدراسة المرضية الفيروسية، فضلا عن فعالية من العلاجات المحتملة. العديد من الفيروسات تستهدف الخلايا الظهارية اما الموقع الرئيسي للعدوى، كما هو الحال بالنسبة لفيرو?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> نوع الفئران الكولاجين الذيل 1 (4-5mg/ml) </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> DMEM بدون NaHC0 3 </td><td> إينفيتروجن </td><td> 12100-061 </td></tr><tr><td> NaHC0 3 </td><td> سيغما </td><td> S5761 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Calbiochem </td><td> 391338 </td></tr><tr><td> غير القابل للصدأ الفولاذ شبكات معدنية </td><td> وليامز وشركاه قوة الشخصية </td><td> CR-03063-040-100-S </td></tr><tr><td> E المتوسطة 11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> عامل نمو البشرة </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 354010 </td></tr></tbody></table>

generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes

وقد وفرت تنمية عضوي النمط الثقافات طوف الظهارية مع الباحثين فعالة في نظام المختبر أن التمايز يلخص بأمانة الظهارية. هناك العديد من الاستخدامات لهذا النظام. على سبيل المثال، كانت القدرة على النمو ثلاثي الأبعاد الثقافات طوف عضوي النمط من الخلايا الكيراتينية معلما هاما في دراسة فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) 1. وترتبط بإحكام دورة حياة فيروس الورم الحليمي البشري إلى التفريق بين ظهارة الحرشفية 2. تظاهر عضوي النمط الثقافات طوف الظهارية كما تتكاثر هنا حياة فيروس الورم الحليمي كامل دورة، بما في ذلك إنتاج فيروس 3،4،5. وبالإضافة إلى ذلك، هذه الثقافات طوف معرض آفات خلل التنسج مماثلة لتلك التي لوحظت على العدوى في الجسم الحي مع فيروس الورم الحليمي البشري. ومن هنا يمكن أيضا أن تستخدم هذا النظام لدراسة سرطان الخلايا الظهارية، فضلا عن تأثير المخدرات على تمايز الخلايا الظهارية بشكل عام. وضعت أصلا من قبل Asselineau وPrunieras <sيصل&gt; (6) وتعديلها من قبل Kopan وآخرون. 7، وعضوي النمط ثقافة طوف الظهارية نظام قد نضجت في عام، نموذج ثقافة سهلة نسبيا، والذي ينطوي على نمو الخلايا في الكولاجين المقابس المحافظة على واجهة الهواء السائل (الشكل 1A). على مدار 10-14 يوما، وخلايا تطبق وتفرق، وتشكيل ظهارة سمك كامل الذي ينتج التمايز محددة cytokeratins. يمكن فحص القوارب التي تحصد تشريحيا، فضلا عن مستوى التقنيات الجزيئية والكيمياء الحيوية. في هذه المقالة، ونحن تصف طريقة لتوليد الثقافات طوف من الخلايا الكيراتينية الإنسان الأساسية. ويمكن استخدام نفس الأسلوب مع إنشاء خطوط الخلايا الظهارية، ويمكن بسهولة تطويعها للاستخدام مع الأنسجة الظهارية من الخزعات طبيعي أو المريضة 8. العديد من الفيروسات الهدف إما ظهارة الغشاء المخاطي الجلدي أو كجزء من تنسخي دورة الحياة. على مدى السنوات العديدة الماضية، وجدوى استخدام عضوي النمط عبادة طوفوقد تبين أن القوام كوسيلة لدراسة التفاعلات الخلية الفيروسات المضيف لherpesviruses عدة، فضلا عن الفيروسات الغدية، parvoviruses، وpoxviruses 9. وبالتالي يمكن أن الثقافات طوف عضوي النمط يمكن تكييفها لدراسة المرضية الفيروسية، و هي الوسيلة الوحيدة لاختبار العوامل المضادة للفيروسات جديدة لتلك الفيروسات التي ليست صالحة للزراعة في خطوط الخلايا دائم.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes at JoVE.com

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

و<em&gt; في المختبر</em&gt; طريقة لتقليد<em&gt; في الجسم الحي</emيوصف&gt; تمايز الظهارية. العديد من الفيروسات تستهدف الخلايا الظهارية كجزء من دورة حياتها الفيروسية، وهذه الطريقة توفر وسيلة لفحص فيروس: التفاعلات المضيف أن أكثر شبها أن الذي يحدث<em&gt; في الجسم الحي</em&gt;. ويمكن استخدام هذه التقنية مع الكيراتينية الأولية، وخطوط الخلايا المنشأ، فضلا عن الأنسجة المريضة طبيعي أو الخزعة.

جيل من الثقافات الطوافة عضوي النمط من الخلايا الكيراتينية الإنسان الأساسية

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

generation-organotypic-raft-cultures-from-primary-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.0K Views.  University of North Carolina-Chapel Hill. و في المختبر طريقة لتقليد في الجسم الحي تمايز الظهارية. العديد من الفيروسات تستهدف الخلايا الظهارية كجزء من دورة حياتها الفيروسية، وهذه الطريقة توفر وسيلة لفحص فيروس: التفاعلات المضيف أن أكثر شبها أن الذي يحدث في الجسم الحي. ويمكن ا?...

Video: Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

وهناك طريقة بسيطة وفعالة لعزل تقوم البلاعم من الثقافات الابتدائية المختلطة من خلايا الكبد الكبار

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&amp;#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

جيل من الخلايا المستحثة تي التنظيمية من المرحلة الابتدائية الإنسان خلايا T ساذجة والذاكرة

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الابتدائية المختلطة من زراعات الخلايا الغروية من المواليد الجدد الجرذ أنسجة المخ

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

توليد خلايا T الإنسان مستضد خيفي محددة من الدم المحيطي

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

الجيل المؤتلف الإنسان مفتش حيدة النسيلة من مخلد خلايا التصنيف B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell repertoire. In vitro models to study T lineage commitment and development have provided valuable insights into this process. However, these systems lack the complete three-dimensional thymic milieu necessary for T cell development and, therefore, are incomplete approximations of in vivo thymic selection. Some of the challenges related to modeling T cell development can be overcome by using in situ models that provide an intact thymic microenvironment that fully supports thymic selection of developing T cells. Thymic slice organotypic cultures complement existing in situ techniques. Thymic slices preserve the integrity of the thymic cortical and medullary regions and provide a platform to study development of overlaid thymocytes of a defined developmental stage or of endogenous T cells within a mature thymic microenvironment. Given the ability to generate ~20 slices per mouse, thymic slices present a unique advantage in terms of scalability for high throughput experiments. Further, the relative ease in generating thymic slices and potential to overlay different thymic subsets or other cell populations from diverse genetic backgrounds enhances the versatility of this method. Here we describe a protocol for the preparation of thymic slices, isolation and overlay of thymocytes, and dissociation of thymic slices for flow cytometric analysis. This system can also be adapted to study non-conventional T cell development as well as visualize thymocyte migration, thymocyte-stromal cell interactions, and TCR signals associated with thymic selection by two-photon microscopy.

We describe the preparation of thymic slices that, in combination with flow cytometry, can be used to model positive and negative selection of developing T cells. Thymic slices can also be adapted for the in situ analysis of thymocyte migration, localization, and signaling via immunofluorescence and two-photon microscopy.

إعداد وتطبيقات الثقافات عضوي التوتة شريحة

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

جيل من الوحيدات المستمدة الخلايا الجذعية البشرية من الدم الكامل

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

تحريض استجابة التهابية في الثقافات الابتدائية الكبدية من الفئران

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

الصغيرة RNA ترنسفكأيشن في الخلايا الأولية Th17 الإنسان من قبل الجيل القادم Electroporation لل

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

جيل من التمييزية مونوكلونل البشرية من خلايا نادرة محددة مستضد ب المتداولة في الدم

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...