Yazarlar E1E4 antikor tür hediye için Sally Roberts (University of Birmingham, Birmingham UK) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü (4R00CA137160-03) bir hibe ile desteklenmiştir.

1. Organotipik Raft Kültürler Hazırlık <ol><li> Metal sal ızgaraları kadar ilk farklılaşma sürecine müdahale olabilecek artıkları temizlemek için kromik sülfürik asit ile tedavi edilebilir. Bir saat için sülfürik asit içeren bir cam beher içinde bırakın metal ızgaralar, daha sonra sürekli musluk suyu ile bir gece durulanmalıdır. Durulama gece sonra, radye ızgaraları çift distile su içinde 3-5 saat durulanmalıdır. </li><li> Sal destek sağlamak için, birbirinden eşit mesafede 0.5 cm radye üç tarafı bükün. Metal ızgaraları sonra otoklava edilmelidir. </li><li> 2,2 g NaHCO3 ve 4.8 g Hepes ekleyerek 10X sulandırma tamponu hazırlayın. 0.05 M NaOH 100 ml eritin. Filtre sterilize ve -20 ° C&#39;de 5 ml hacimde depolamak </li><li> Sodyum bikarbonat olmadan 10X DMEM hazırlayın. Filtre sterilize ve -20 ° C&#39;de 5 ml hacimde depolamak </li><li> Fare epidermal büyüme faktörü hazırlayın: EGF 100 mg ve B 10 mg eritilirSA 10 ml her GKD 2 0 deiyonize. EGF ve BSA birleştirin ve 100 ml toplam hacim deiyonize GKD 2 0 80 ml ​​ekleyin. Filtre sterilize, tablet (5 ml) ve -20 ° C&#39;de saklayın E, orta her litre için 1 mg / ml EGF (nihai konsantrasyon 5 ng / ml), 5 ml ilave edilir. </li></ol> 2. Kollajen Jeller hazırlanması <ol><li> Bir kollajen jel her salı için gereklidir. Kollajen katılaşabilme önlemek için buz üzerinde tutulmalıdır. Sıçan soğuk-kuyruk kolajeni tip I (nihai konsantrasyon 3-4 mg / ml), 0.3 ml 10X rekonstitüsyon tamponu, 0.3 ml DMEM 10X AND1-2 X 10 6 fare 2.4 ml: her kollajen jel oluşan kollajen karışımı 3 ml gerektirir besleyici hücreler olarak 3T3 J2 fibroblastlar. Fare kuyruk kolajeni ile yüksek konsantrasyonlu çözümler için, doğru çalışma konsantrasyonu elde etmek için 0.02 M asetik asit içinde tamamlanır. </li><li> Eğer kolajen miktarı, 10X reconstit için bir master miks hesaplamak daha sonra ihtiyacınız olacak kollajen jel (sallar) sayısını belirlemekution tampon, 10X DMEM ve J2 fibroblastlar gereklidir. Kollajen viskozite nedeniyle 3-4 ekstra jeller için her ana karışım yeterli ekleyin. </li><li> Kollajen jel hazırlamak için, J2 fibroblastlar trypsinize ve orta ile nötralize. 50 ml&#39;lik konik flakon tüm fibroblastlar ve yerde birleştirin. Yapılabilir sallar numarasını belirlemek için hücreleri hesaplama. Yine, 1-2x10 6 fibroblastlar sal başına böylece kollajen jel başına gereken ve uygulanır. Düşük hızda hücreleri aşağı Spin. </li><li> 10X rekonstitüsyon tamponu, 10X DMEM ve hesaplanan salları sayısı için kolajen uygun miktarlarda fibroblast pelet ve Pastör pipetiyle gelen ortamı aspire. Hızlı katılaşmayı gelen jel önlemek için kolajen son ekleyin. Kollajen eklendikten sonra, jel içine kabarcıklarının giriş önlemek için hızlı bir şekilde yavaşça karışımı, fakat. Jel Doğru pH göstergesi kırmızımsı portakal rengi, olmalıdır. Jel karışımı aşırı sarı ise, filtre ile sterilize 1N damla bir çift eklemeNaOH ve karışımı yavaşça doğru renk elde etmek. </li><li> Kollajen 3 ml ekleyin: fibroblast karışımı 6 kuyu kültür yemeğin kuyulara. Kollajen karışımı kabarcıklar oluşturarak önlemek için yavaş yavaş her iyi tarafı aşağı pipetlenir edilmelidir. Bir 37 ° C doku kültürü plakası inkübatörde yerleştirin ve 30 dakika boyunca katılaşmaya izin verir. </li><li> 30 dakika sonra, katılaştırılmış kollajen jel üst EGF E orta 3 ml ekleyin ve plaka inkübatöre geri döner. Jeller, en az bir gün boyunca 37 ° C&#39;de tutulur, ancak dört gün içinde kullanılmalıdır. Optimal sonuçlar inkübasyon iki gün sonra ortaya çıkar. </li></ol> 3. Farklılaşma için hazırlık Keratinositler <ol><li> Düşük geçit keratinositler yaklaşık% 70 konfluense büyüdü edilmelidir. Her salı 1-2x10 6 keratinositler gerektirir. Keratinositler Trypsinize ve EGF ile E orta ile nötralize. Yapılabilir sallar numarasını belirlemek için hücreleri hesaplama. Düşük SPE olarak hücreleri aşağı Spined. Hesaplanan her sal kültürü için EGF ile E ortamın 1 ml pelletini. </li><li> Eğerek 6 sıra plaka ile kollajen jel gelen orta aspire. Her jel EGF taze E orta 2 ml ekleyin. Her jel için, dikkatle de zaten mevcut E orta 2 ml süspanse keratinositlerin 1 ml ekleyin. Sonra yavaşça pipet keratinositlerin artı medyanın 2 ml ve sonbahar açılan akıllıca geri jel üzerine izin verin. Çalkalama veya plaka sallanan kollajen jel bir tarafında hücrelerinin düzensiz dağılımı ile sonuçlanabilir. 37 ° C inkübatörde plakası yerleştirin. </li><li> Hücreler günlük E orta yerine, konfluent için yetiştirilen edilmelidir. Hücreler konfluent olduğunda, orta bir değişiklikten sonra sarı bir gün için orta değişir. Bu genellikle 2-4 gün sürer. Orta günde dört tarafından değişmedi, bir sonraki adıma geçin. </li></ol> 4. Radye Kültürler yapma <ol><li> Steril bir metal sal ızgara yerleştirmek için steril forseps kullanma, taraf eğildi, Bir 10 cm çanak içine. Kollajen jelden orta aspire. İyi bir taraftan jel gevşetmek için, hareketli bir yukarı ve aşağı kullanılarak steril bir spatula ile jel çevresi etrafında gider. Kollajen jel kaldırmak için hafifçe eğin plaka ve bir spatula altına koyarak kaldırın. Izgara ve jel arasındaki kabarcıklar oluşturmadan metal ızgara üzerinde kollajen jel yatırın. İki jeller her ızgara üzerine yerleştirilebilir. </li><li> Bir hava-sıvı arayüz hale getirmek için, sal ızgara ortam dokunmadan böylece tabağın tabanına kadar yavaş EGF olmadan E orta ilave fakat kollajen jel değildir. Medya kılavuzunda deliklerden gelmemeli. Bu tip farklılaşmasını önlemek olacak şekilde, kılavuz altında kabarcıkları üretmek önlemek için yavaş yavaş ortam ekleyin. 37 ° C&#39;de inkübe sallar ve hava-sıvı arayüzü koruyarak her geçen gün orta değiştirin. 14 gün sonra hasat sallar. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Zaman tO protokolü primer keratinositler ile düzgün bir şekilde gerçekleştirilir, bu işlem cilt katman değişik belirgindir iyi farklılaşmış epitel neden olacaktır. Bu Şekil 1B gösterildiği hematoksilen ve eozin (H &amp; E) sal kültürler, bölümleri boyanarak histolojik inceleme ile elde edilebilir. H &amp; E boyama sallar ve tabakalandırmak ve ayırt hücrelerinin yeteneği üzerinde virüs veya antiviral bileşiklerin etkisi morfolojisini incelemek de faydalıdır. Örneğin, HPV-ölümsüzleştirdi birincil insan keratinositleri (HFK-31) yapılan sallar özellikle kalın çoğalması oranında herhangi bir artış ve farklılaşma hücreleri aktif tutmak için HPV proteinlerin yeteneğini yansıtan, normal insan sünnet derisi keratinositleri (HFK) yapılan sallar karşılaştırıldığında hücre döngüsü içinde (Şekil 1B) 10. Epitel boyunca çekirdeklerin tutulması Bu sonuç, normal keratinositlerin bir arıza ile sonuçlanan farklılaşma üzerine hücre döngüsü çıkmak iseçekirdek zarı. Daha yakından incelemek için farklılaşma, immünhistokimya Sitokeratin yanı sıra involukrin ve filagrin gibi özel farklılaşma belirteçler, incelemek için yapılabilir. Farklı Sitokeratin farklılaşma 7 spesifik aşamaları ile ifade edilir. Şekil 2 de gösterildiği gibi, sitokeratin 10 (K10) taban katmanı olarak ifade değildir ve tek aşamalı olarak ayırt hücreleri içerir suprabasal tabakalar halinde bulunur. HPV pozitif sallar olarak, K10 ifadesi tekrar keratinosit farklılaşma HPV proteinlerinin etkisini yansıtan Normal keratinositler kıyasla gecikir. İmmünohistokimya da viral genlerin ifadesi profili incelemek için kullanılabilir. Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi ifade epitelinin üst tabaka ile sınırlıdır geç bir proteindir HPV proteini E1 ^ E4, ifade inceleyerek bir temsilcisi olan boyama. Beklenildiği gibi, herhangi bir boyama, normal huma gelen sal kültürlerinde görülmektedirSünnet derisi keratinositler n. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig1.jpg" /> Şekil 1. Primer keratinositler ya epitel hücre hattından organotipik sal kültürler hazırlanması için yöntem A) içeriği. Stably HPV-31 (HFK-31) episomes veya normal insan sünnet derisi keratinositleri (HFK) den korumak, insan sünnet derisi keratinositlerinden oluşturulan organotipik sal kültür B) Hematoksilen ve eozin boyanma. Bireysel epiteliyal tabakalar yanı kollajen tıkaç olarak tespit edilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig2.jpg" /> Şekil 2. Sitokeratin 10 (K10) ifade epitelin suprabasal katmanları ile sınırlıdır. İmmünohistokimya K10 için bir antikor kullanılarak HFK-31 hücreleri, hem de normal bir HFKs elde organotipik sal kültürlerin kesitleri üzerinde yapıldı. Hücresel DNA DAPI ile zıt edildi. Görüntüler conf kullanılarak çekilenÖcal floresan mikroskobu. Oklar epitelin bazal tabaka göstermektedir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig3.jpg" /> Şekil 3. HPV E1 ^ E4 proteini geç virüs ömrü çevrimi ile verimli bir faz olarak üretilir. İmmünohistokimya E1E4 karşı antikorlar kullanılarak HFK-31 hücreleri, hem de normal bir HFKs elde organotipik sal kültürlerin kesitleri üzerinde yapıldı. Hücresel DNA DAPI ile zıt edildi. Görüntüler konfokal floresan mikroskobu kullanarak ele geçirildi. Oklar epitelin bazal tabaka göstermektedir.

<ol>
	<li>Andrei, G., Duraffour, S., VandenOord, J., Snoeck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+raft+cultures+for+investigations+of+virus+growth,+pathogenesis+and+efficacy+of+antiviral+agents.">Epithelial raft cultures for investigations of virus growth, pathogenesis and efficacy of antiviral agents.</a> Antiviral Research. 85, 431-449 (2010).</li><li>Asselineau, D., Prunieras, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+'simplified'+skin:+control+of+fabrication.">Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication.</a> The British Journal of Dermatology. 111, 219-222 (1984).</li><li>Bodily, J., Alam, S., Chen, H., Meyers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Organotypic epithelial raft cultures and the study of the natural history of human papillomavirus. , (2006).</li><li>Cheng, S., Schmidt-Grimminger, D. C., Murant, T., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation-dependent+up-regulation+of+the+human+papillomavirus+E7+gene+reactivates+cellular+DNA+replication+in+suprabasal+differentiated+keratinocytes.">Differentiation-dependent up-regulation of the human papillomavirus E7 gene reactivates cellular DNA replication in suprabasal differentiated keratinocytes.</a> Genes &#38; Development. 9, 2335-2349 (1995).</li><li>Dollard, S. C., Wilson, J. L., Demeter, L. M., Bonnez, W. R., Reichman, C., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+human+papillomavirus+and+modulation+of+the+infectious+program+in+epithelial+raft+cultures.+OFF.">Production of human papillomavirus and modulation of the infectious program in epithelial raft cultures. OFF.</a> Genes &#38; Development. 6, 1131-1142 (1992).</li><li>Frattini, M. G., Lim, H. B., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+synthesis+of+oncogenic+human+papillomaviruses+requires+episomal+genomes+for+differentiation-dependent+late+expression.">In vitro synthesis of oncogenic human papillomaviruses requires episomal genomes for differentiation-dependent late expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 3062-3067 (1996).</li><li>Kopan, R., Traska, G., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoids+as+important+regulators+of+terminal+differentiation:+examining+keratin+expression+in+individual+epidermal+cells+at+various+stages+of+keratinization.">Retinoids as important regulators of terminal differentiation: examining keratin expression in individual epidermal cells at various stages of keratinization.</a> The Journal of Cell Biology. 105, 427-440 (1997).</li><li>Longworth, M. S., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+human+papillomaviruses+in+differentiating+epithelia.">Pathogenesis of human papillomaviruses in differentiating epithelia.</a> Microbiology and Molecular Biology Review. 68, 362-372 (2004).</li><li>Meyers, C., Frattini, M. G., Hudson, J. B., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+human+papillomavirus+from+a+continuous+cell+line+upon+epithelial+differentiation.">Biosynthesis of human papillomavirus from a continuous cell line upon epithelial differentiation.</a> Science. 257, 971-973 (1992).</li><li>Wilson, R., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Differentiation of HPV-Containing Cells Using Organotypic Raft Culture or Methylcellulose. , 119-119 (2006).</li><li>zur Hausen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papillomavirus+infections--a+major+cause+of+human+cancers.">Papillomavirus infections--a major cause of human cancers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1288, F55-F78 (1996).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Burada genel olarak epitelyal farklılaşma incelemek için kullanılabilecek bir yöntem tarif eder, fakat, aynı zamanda kolaylıkla viral patogenezine gibi potansiyel terapötik etkinlik incelemek için adapte edilebilir. Birçok virüs herpesvirüslerinin ile olduğu gibi, HPV durumunda olduğu gibi, ya da virüs ömrü çevrimi içinde bir noktada, enfeksiyon primer olarak ya epitel hücreleri hedef. Konak hücre etkileşimleri: organotipik sal kültürler büyüyen zaman alıcı, virüsü incelemek için son derec...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Sıçan Kuyruk Kollajen tip 1 (4-5mg/ml) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> NaHC0 3 olmadan DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-061 </td></tr><tr><td> NaHC0 3 </td><td> Sigma </td><td> S5761 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Calbiochem </td><td> 391338 </td></tr><tr><td> Paslanmaz çelik metal ızgaralar </td><td> Williams ve hırs A.Ş. </td><td> CR-03063-040-100-S </td></tr><tr><td> E orta 11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Epidermal Büyüme Faktörü </td><td> BD Biosciences </td><td> 354010 </td></tr></tbody></table>

generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes

Organotipik epitel sal kültürlerin gelişimi vitro sistemde sadakatle özetlediği epitel farklılaşmasında etkili olan araştırmacılar sağlamıştır. Bu sistem için bir çok kullanıma vardır. Örneğin, keratinositlerin üç boyutlu organotipik sal kültürleri yetiştirme yeteneğiyle, insan papilloma virüsü (HPV) 1 çalışmalarında önemli bir kilometre taşı olmuştur. HPV yaşam döngüsü sıkıca skuamöz epitel 2 farklılaşma bağlantılıdır. Olarak Organotipik epitel sal kültürler burada virüs üretimi 3,4,5 dahil olmak üzere, tüm papillomavirus yaşam döngüsü yeniden gösterdi. Ayrıca, bu sal kültürler HPV ile in vivo enfeksiyon üzerine görülenlere benzerdir displastik lezyonlar gösterirler. Böylece bu sistem, aynı zamanda epitel hücre kanserleri, yanı sıra genel olarak epitel hücre farklılaşması üzerinde ilaçların etkisini araştırmak üzere de kullanılabilir. Başlangıçta Asselineau ve Prunieras tarafından geliştirilen <s6&gt; yukarı ve Kopan ve ark. 7 tarafından değiştirilmiş, organotipik epitel sal kültürü sistemi üzerindeki kolajen hücrelerinin büyümesini içeren bir genel olarak, nispeten kolay kültürü modeli, haline geldi bir hava-sıvı arayüzü (Şekil 1A) muhafaza bağlanır. 10-14 gün boyunca, hücrelerin tabakalandırmak ve farklılığı, farklılaşma özgü Sitokeratin üreten bir tam kat epitel oluşturulması. Hasat sal yanı sıra standart moleküler ve biyokimyasal teknikler ile, histolojik olarak kontrol edilebilir. Bu yazıda, birincil insan keratinositlerinden sal kültürlerin üretimi için bir yöntem açıklanmaktadır. Aynı teknik kurulan epitel hücre çizgileri ile birlikte kullanılabilir, ve kolay bir şekilde, normal veya hastalıklı biyopsileri 8 den epiteliyal doku ile kullanım için uyarlanabilir. Birçok virüs hedef ya deri veya mukozal epitelin kendi replikatif yaşam döngüsünün bir parçası olarak. Son birkaç yılda, fizibilite organotipik sal kült kullanarakVirüs-konak hücre etkileşim okuyan bir yöntem olarak ures birkaç herpesvirüslerinin yanı sıra adenovirüsler, parvoviruses ve poxviruses 9 için gösterilmiştir. Organotipik sal kültürler böylece viral patogenez incelemek için uyarlanmış ve kalıcı hücre serilerinde tarıma olmayan bu virüs için antiviral ajanlarla test etmek için tek yöntem olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes at JoVE.com

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Bir<em&gt; In vitro</emTaklit etmek&gt; yöntemi<em&gt; In vivo</em&gt; Epitelyal farklılaşma tarif edilmektedir. Birçok virüs bulaşıcı yaşam döngüsünün bir parçası olarak epitel hücreleri hedef ve bu yöntem, virüsün incelenmesi için bir araç sağlar: konak etkileşimleri daha yakından oluştuğu benzediği<em&gt; In vivo</em&gt;. Bu tekniğin temel keratinositler, oluşturulan hücre çizgileri, aynı zamanda, normal veya hastalıklı biyopsi doku ile birlikte kullanılabilir.

İlköğretim İnsan Keratinositler gelen Organotipik Radye Kültürlerin Üretimi

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

generation-organotypic-raft-cultures-from-primary-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.1K Görüntüleme.  University of North Carolina-Chapel Hill. Bir In vitro yöntemi In vivo Epitelyal farklılaşma tarif edilmektedir. Birçok virüs bulaşıcı yaşam döngüsünün bir parçası olarak epitel hücreleri hedef ve bu yöntem, virüsün incelenmesi için bir araç sağlar: konak etkileşimleri daha yakından oluştuğu benzediği In vivo. Bu tekniğin temel keratinositler, oluşturulan hücre çizgileri, aynı zamanda, normal veya hastalıklı biyopsi doku il...

Video: Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Gelişim Biyolojisi

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased metastatic potential. Recently, mono-chemotherapies continue to improve by melanoma specific combination therapies with targeted kinase inhibitors. Still, metastatic melanoma remains a life-threatening disease because tumors exhibit primary resistance or develop resistance to novel therapies, thereby regaining tumorigenic capacity. In order to improve the therapeutic success of malignant melanoma, the determination of molecular mechanisms conferring resistance against conventional treatment approaches is necessary; however, it requires innovative cellular in vitro models. Here, we introduce an in vitro three-dimensional (3D) organotypic melanoma spheroid model that can portray the in vivo architecture of malignant melanoma and may warrant new insights into intra-tumoral as well as tumor-host interactions. The model incorporates defined numbers of mature and differentiated melanoma spheroids in a 3D human full skin reconstruction model consisting of primary skin cells. The cellular composition and differentiation status of the embedded melanoma spheroids is similar to the one of cutaneous melanoma metastasis in vivo. Using this organotypic melanoma spheroid model as a drug screening platform may support the identification of responders to selected combination therapies, while sparing the unnecessary treatment burden for non-responders, thereby increasing the benefit of therapeutic interventions.

Here, we present a protocol to generate a 3D organotypic melanoma spheroid skin model that recapitulates both the architecture and multicellular complexity of an organ/tumor in vivo but at the same time accommodates systematic experimental intervention.

3D Organotypic Melanom küresel Cilt modeli

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Kanser Araştırmaları

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

Oluşturma ve birincil insan lenfositi yetişkin cilt, kültür

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

3B cilt Organoid kablosu kan kaynaklı nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human cancers. As a lining tissue, the skin epithelium is often subject to injury and has evolutionarily adapted by acquiring the cellular plasticity necessary to repair damaged tissue. Over the years, several efforts have been made to study epithelial plasticity using in&#160;vitro and ex vivo cell-based models. However, these efforts have been limited in their capacity to recapitulate the various phases of epithelial cell plasticity. We describe here a protocol for generating 3D epidermal spheroids and epidermal spheroid-derived cells from primary neonatal human keratinocytes. This protocol outlines the capacity of epidermal spheroid cultures to functionally model distinct stages of keratinocyte generative plasticity and demonstrates that epidermal spheroid re-plating can enrich heterogenous normal human keratinocytes (NHKc) cultures for integrin&#945;6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations with enhanced stem-like characteristics. Our report describes the development and maintenance of a high throughput system for the study of skin keratinocyte plasticity and epidermal regeneration.

Here we describe a protocol for the systematic cultivation of epidermal spheroids in 3D suspension culture. This protocol has wide-ranging applications for use in a variety of epithelial tissue types and for the modeling of several human diseases and conditions.

Keratinosit Kök Hücre Plastisitesini Modellemek için Yüksek Verimli Epidermal Sferoid Kültür Sistemi Kurulması

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Büyük Ölçekte Üç Boyutlu Yeniden Yapılandırılmış İnsan Epidermisi Yetiştirmek

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Biyomühendislik

Organotypic 3D Skin Culture: A Cassette-based In Vitro Culture Technique to Regenerate Human Epidermis on Acellular Dermis

Source: Jingting Li et al. <a href="https://www.jove.com/v/53280"> Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis</a>, J. Vis. Exp. (2015).
This video protocol describes a cassette-based in vitro culture technique to generate&#160;human organotypic skin using epidermal keratinocytes and devitalized human dermis. They mimic the function and physiology of their in vivo tissue counterparts.

Organotipik 3D Cilt Kültürü: Aselüler Dermiste İnsan Epidermisini Yeniden Oluşturmak İçin Kaset Tabanlı İn Vitro Kültür Tekniği

Source: Jingting Li et al.  Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis, J. Vis. Exp. (2015).
This video ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Cilt kanseri

Analizler ve teknikler

Human Skin Keratinocyte Isolation: A Method to Culture Primary Keratinocytes from Skin Samples

Johansen, C. et al. <a href="https://www.jove.com/v/56863"> Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin</a>. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of keratinocytes&#8212;the most prominent cells of human skin&#39;s epidermal layer, by employing a combination of enzymatic digestion and mechanical disruption methods. This method helps in the preferential growth of keratinocytes over other skin cell types using a selective growth medium.

İnsan Derisi Keratinosit İzolasyonu: Deri Örneklerinden Primer Keratinositlerin Kültürlenmesinde Bir Yöntem

Johansen, C. et al.  Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of ...

Genetic Modification of Primary Human Keratinocytes: A Method for Genetically Manipulating Keratinocytes Using Recombinant Retroviruses

Source: Li, J. et al. <a href="https://www.jove.com/v/53280"> Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis</a>. J. Vis. Exp. (2015)
This video describes a detailed protocol for producing genetically modified primary human keratinocytes recombinant retrovirus. This method can be used to manipulate gene expression in keratinocytes.

Primer İnsan Keratinositlerinin Genetik Modifikasyonu: Rekombinant Retrovirüsler Kullanılarak Keratinositlerin Genetik Olarak Manipüle Edilmesi İçin Bir Yöntem