저자 E1E4 항체의 종류 선물 샐리 로버츠 (버밍엄 대학, 버밍햄 영국) 감사드립니다. 이 작품은 국립 암 연구소 (4R00CA137160-03)에서 교부금에 의해 지원되었다.

1. Organotypic 뗏목 문화를위한 준비 <ol><li> 금속 뗏목 격자가 훨씬 먼저 분화 과정을 방해할 수있는 찌꺼기를 제거하는 삼가의 크롬을 함유하는 제품 황산으로 처리됩니다. 한 시간 만이라도 황산이 들어있는 유리 비커에 잠그다 금속 격자는 다음 지속적으로 수돗물로 씻어서 하룻밤. 린스 하룻밤 후, 뗏목 격자가 이중으로 증류수에 3-5시간 위해 씻어서되어야합니다. </li><li> 보트에 대한 지원을 제공하기 위해 서로 동등한 거리에서 0.5 cm에 대한 뗏목 세 가지 측면을 구부. 금속 격자 그런 다음 autoclaved해야합니다. </li><li> 2.2 g NaHCO3 및 4.8 g의 Hepes을 추가하여 10X reconstitution 버퍼를 준비합니다. 0.05 M NaOH의 100 ML에 디졸브. 필터 소독 및 -20 ° C.에서 5 ML의 aliquots에 저장 </li><li> 나트륨 중탄산염없이 10X DMEM을 준비합니다. 필터 소독 및 -20 ° C.에서 5 ML의 aliquots에 저장 </li><li> 마우스 표피 성장 인자를 준비 : EGF의 100 MG와 B의 10 밀리그램을 디졸브SA 10 ML에서 각각 ddH 2 0를 deionized. EGF와 BSA를 결합 및 100 ML의 총 볼륨의 deionized ddH 2 0 80 ML에 추가합니다. 필터 소독, 나누어지는 (5 ML) 및 -20 ° C.에 저장 전자 매체의 각 리터에 대해 1 밀리그램 / ML EGF (최종 농도 5 NG / ML) 5 ML에 추가합니다. </li></ol> 2. 콜라겐 젤의 작성 <ol><li> 하나는 콜라겐 젤은 각 뗏목이 필요합니다. 콜라겐이 응고하지 않도록 얼음에 보관해야합니다. 추위 쥐 - 꼬리 콜라겐 유형 I (최종 농도 3-4 밀리그램 / ML), 0.3 ML 10X reconstitution 버퍼, 0.3 ML 10X DMEM and1-2 X 10 6 마우스의 2.4 ML : 각 콜라겐 젤은 구성된 콜라겐 믹스 3 ML이 필요합니다 피더 세포와 같은 3T3 J2 섬유아 세포. 쥐의 꼬리 콜라겐의 높은 농도 솔루션의 경우 올바른 작동 농도를 달성하기 위해 0.02 M 초산에 희석. </li><li> 당신은 콜라겐의 양을, 10X reconstit위한 마스터 믹스를 계산 후 필요합니다 콜라겐 젤 (보트)의 개수를 결정ution 버퍼, 10X DMEM과 J2 섬유아 세포가 필요합니다. 콜라겐의 점성으로 인해 3-4 여분 젤류 각 마스터 믹스에 충분히 포함합니다. </li><li> 콜라겐 젤을 준비하려면, J2 섬유아 세포를 trypsinize와 매체로 무력화. 50 ML 원뿔 유리병의 모든 섬유아 세포와 장소를 결합. 만들 수 보트의 수를 결정하는 세포를 세어보세요. 다시 말하지만, 1-2x10 6 섬유아 세포는 뗏목 당 따라서 콜라겐 젤별로 요구하고있다. 낮은 속도로 세포를 내려 봐. </li><li> 10X reconstitution 버퍼, 10X DMEM과 계산 보트의 수를위한 콜라겐의 적절한 금액 fibroblast 펠렛과 resuspend에서 매체를 기음. 너무 빨리 응고에서 젤을 방지하기 위해 콜라겐이 마​​지막에 추가합니다. 콜라겐이 추가되면 젤로 거품의 도입을 방지하기 위해 부드럽게 빠르게 섞는다지만. 겔은 올바른 산도 나타내는 붉은 오렌지 색상이어야합니다. 겔 혼합물이 너무 노란색 경우 필터 소독 1N의 안약 몇 가지 추가NaOH와 혼합 부드럽게 정확한 색상을 구하십시오. </li><li> 콜라겐 3 ML 추가 : fibroblast 혼합물을 6 아니라 문화 접시의 우물에. 콜라겐 혼합물은 거품을 발생하지 않도록 천천히 각 우물의 측면 아래로 pipetted해야합니다. 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에 금속판을 놓고 30 분 동안 응고 수 있습니다. </li><li> 30 분 후에, 경화 콜라겐 젤 위쪽에 EGF와 전자 매체 3 ML을 추가하고 배양기에 플레이트를 반환합니다. 젤은 최소한 하루에 37 ° C에서 보관 아니고 넷 일 이내에 사용해야합니다. 최적의 결과는 부화 두 가지 일 후에 발생합니다. </li></ol> 3. 차별 화를위한 준비 Keratinocytes <ol><li> 낮은 통로 keratinocytes는 약 70 % confluency로 성장해야한다. 각 뗏목은 1-2x10 6 keratinocytes가 필요합니다. keratinocytes을 Trypsinize 및 EGF와 전자 매체로 무력화. 만들 수 보트의 수를 결정하는 세포를 세어보세요. 낮은 spe에서 세포를 다운 던가에드. 계산된 각 뗏목 문화에 대한 EGF와 전자 매체의 1 ML에 펠렛을 Resuspend. </li><li> 틸팅 6 잘 판에 의해 콜라겐 젤에서 매체를 기음. 각 겔에 대한 EGF와 함께 신선한 전자 매체는 2 ML을 추가합니다. 각 겔 들어, 조심스럽게 잘에 이미 존재 전자 매체의 2 ML에 resuspended keratinocytes 1 ML을 추가합니다. 다음 부드럽게 pipet keratinocytes을 더한 미디어의 두 ML하고 가을 드롭이 많다는 다시 젤 향해 보자. 떨고하거나 번호판을 출렁 이는 것은 콜라겐 겔 중 한쪽으로 세포의 분포가 불규칙이 생길 수 있습니다. 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다. </li><li> 세포는 매일 전자 매체를 대체, confluency로 성장해야한다. 세포가 합류하는 경우 중간에 변경 후 노란색 언젠가 매체 변경됩니다. 이것은 보통 2~4일 소요됩니다. 매체가 하루 네에 의해 변경되지 않은 경우 다음 단계로 진행합니다. </li></ol> 4. 뗏목 문화 만들기 <ol><li> 멸균 금속 뗏목 격자를 배치 멸균 집게를 사용하여, 양측 내려가 보자, 10cm 접시에. 콜라겐 겔에서 매체를 기음. 잘의 측면에서 젤을 느슨하게하려면, 동작을 위아래를 사용하여 멸균 주걱으로 젤의 주위에 이동하십시오. 콜라겐 젤을 제거하려면 약간 접시를 기울이고 주걱의 아래를 삽입하여 리프트. 그리드와 젤 사이에 기포를 생성하지 않고 금속 격자에 콜라겐 젤 놓는다. 두 젤류는 각 격자에 둘 수 있습니다. </li><li> 공기 - 액체 인터페이스를 만들기 위해서는, 뗏목 격자가 미디어를 감동적 있도록 접시의 바닥에 천천히 EGF없이 전자 매체를 추가하지만, 콜라겐 젤이 아닙니다. 미디어 그리드에 구멍을 통과해서는 안됩니다. 이 균일한 분화를 차단하므로 그리드 아래에 거품을 발생하지 않도록 천천히 매체를 추가하십시오. 37 ° C에서 보트를 부화하고 공기 - 액체 인터페이스를 유지하고 매일 매체를 변경합니다. 십사일 후 보트를 수확. </li></ol> 5. 대표 결과 때 t그 프로토콜이 기본 keratinocytes에서 제대로 수행됩니다, 성형 수술은 피부의 다른 레이어는 증거들이 잘 차별 상피집니다. 이것은 같은 그림 1B에 나타난 hematoxylin 및 eosin (H &amp; E)의 뗏목 문화의 부분을 더럽히는 것으로 histological 시험을 통해 달성될. H &amp; E 염색법은 보트와 계충화하다와 차별화하는 세포의 능력에 바이러스 또는 항바이러스 화합물의 효과의 형태를 검사하는 것도 유용합니다. 예를 들어, HPV-불후의 기본 인간 keratinocytes (HFK-31)로 만든 보트가 특히 두꺼운 확산의 증가 속도와 차별화 세포 활성 유지하는 HPV 단백질의 능력을 반영, 정상적인 인간의 포피를 keratinocytes (HFK)로 만든 보트와 비교된다 세포주기의 (그림 1B) 10. 상피 전역의 핵 보유에이 결과, 정상 keratinocytes가의 붕괴가 발생, 분화에 따라 세포주기를 종료 반면,핵 봉투. 더 자세히 분화를 조사하려면, immunohistochemistry는 cytokeratins뿐만 아니라, involucrin, 그리고 filaggrin 포함하여 특정 분화 마커를 조사하기 위해 수행할 수 있습니다. 다른 cytokeratins는 분화 7의 특정 단계에서 표현됩니다. 그림 2에 표시된 바와 같이, cytokeratin 10 (K10)가 기초 레이어로 표현되지 않으며 오직 점진적으로 차별화 세포로 구성되어 suprabasal 레이어에서 발견된다. HPV 긍정적인 보트에서 K10의 표현이 다시 keratinocyte 분화에 HPV 단백질의 영향을 반영하는 정상 keratinocytes, 그에 비해 지연될 수 있습니다. Immunohistochemistry은 또한 바이러스 유전자의 표현 프로필을 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 3에 표시된 것은 표현 상피의 맨 위에 레이어로 제한됩니다 늦은 단백질은 HPV 단백질 E1 ^ E4의 표현을 검토 대표적인 염색법이다. 예상했던대로 아무 염색법 정상 huma에서 뗏목 문화에서 관찰되지 않습니다포피의 keratinocytes 그렇죠. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig1.jpg" /> 그림 1. 기본 keratinocytes이나 상피 세포 라인에서 organotypic 뗏목 문화를 준비하기위한 방법의) 개요. 안정적으로 HPV-31 (HFK-31) episomes, 또는 정상적인 인간의 포피를 keratinocytes (HFK)에서을 유지하는 인간의 포피를 keratinocytes에서 발생 organotypic 뗏목 문화 B) Hematoxylin 및 eosin 염색법. 각각의 상피 층은 물론 콜라겐 플러그로서 식별됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig2.jpg" /> 그림 2. Cytokeratin 10 (K10) 표현식은 상피의 suprabasal 레이어로 제한됩니다. Immunohistochemistry은 K10에 항체를 사용하여 HFK-31 세포뿐만 아니라 정상 HFKs에서 생성된 organotypic 뗏목 문화의 교차 부분에서 수행되었다. 세포의 DNA는 DAPI로 counterstained되었다. 이미지는 conf 파일을 사용 잡혔었지ocal 형광 현미경. 화살표는 상피의 기저 계층을 나타냅니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig3.jpg" /> 그림 3. HPV E1 ^ E4 단백질은 후반 바이러스 생활주기의 생산 단계에서 생산된다. Immunohistochemistry은 E1E4에 항체를 사용하여 HFK-31 세포뿐만 아니라 정상 HFKs에서 생성된 organotypic 뗏목 문화의 교차 부분에서 수행되었다. 세포의 DNA는 DAPI로 counterstained되었다. 이미지가 공촛점 형광 현미경을 사용하여 캡처했다. 화살표는 상피의 기저 계층을 나타냅니다.

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	<li>Andrei, G., Duraffour, S., VandenOord, J., Snoeck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+raft+cultures+for+investigations+of+virus+growth,+pathogenesis+and+efficacy+of+antiviral+agents.">Epithelial raft cultures for investigations of virus growth, pathogenesis and efficacy of antiviral agents.</a> Antiviral Research. 85, 431-449 (2010).</li><li>Asselineau, D., Prunieras, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+'simplified'+skin:+control+of+fabrication.">Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication.</a> The British Journal of Dermatology. 111, 219-222 (1984).</li><li>Bodily, J., Alam, S., Chen, H., Meyers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Organotypic epithelial raft cultures and the study of the natural history of human papillomavirus. , (2006).</li><li>Cheng, S., Schmidt-Grimminger, D. C., Murant, T., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation-dependent+up-regulation+of+the+human+papillomavirus+E7+gene+reactivates+cellular+DNA+replication+in+suprabasal+differentiated+keratinocytes.">Differentiation-dependent up-regulation of the human papillomavirus E7 gene reactivates cellular DNA replication in suprabasal differentiated keratinocytes.</a> Genes &#38; Development. 9, 2335-2349 (1995).</li><li>Dollard, S. C., Wilson, J. L., Demeter, L. M., Bonnez, W. R., Reichman, C., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+human+papillomavirus+and+modulation+of+the+infectious+program+in+epithelial+raft+cultures.+OFF.">Production of human papillomavirus and modulation of the infectious program in epithelial raft cultures. OFF.</a> Genes &#38; Development. 6, 1131-1142 (1992).</li><li>Frattini, M. G., Lim, H. B., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+synthesis+of+oncogenic+human+papillomaviruses+requires+episomal+genomes+for+differentiation-dependent+late+expression.">In vitro synthesis of oncogenic human papillomaviruses requires episomal genomes for differentiation-dependent late expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 3062-3067 (1996).</li><li>Kopan, R., Traska, G., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoids+as+important+regulators+of+terminal+differentiation:+examining+keratin+expression+in+individual+epidermal+cells+at+various+stages+of+keratinization.">Retinoids as important regulators of terminal differentiation: examining keratin expression in individual epidermal cells at various stages of keratinization.</a> The Journal of Cell Biology. 105, 427-440 (1997).</li><li>Longworth, M. S., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+human+papillomaviruses+in+differentiating+epithelia.">Pathogenesis of human papillomaviruses in differentiating epithelia.</a> Microbiology and Molecular Biology Review. 68, 362-372 (2004).</li><li>Meyers, C., Frattini, M. G., Hudson, J. B., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+human+papillomavirus+from+a+continuous+cell+line+upon+epithelial+differentiation.">Biosynthesis of human papillomavirus from a continuous cell line upon epithelial differentiation.</a> Science. 257, 971-973 (1992).</li><li>Wilson, R., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Differentiation of HPV-Containing Cells Using Organotypic Raft Culture or Methylcellulose. , 119-119 (2006).</li><li>zur Hausen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papillomavirus+infections--a+major+cause+of+human+cancers.">Papillomavirus infections--a major cause of human cancers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1288, F55-F78 (1996).</li></ol>

우리는 공개 할게 없다.

여기서 일반적으로 상피 분화를 연구하는 데 사용할 수있는 방법을 설명하지만, 또한 쉽게 바이러스성 pathogenesis뿐만 아니라 잠재적인 치료제의 효능을 연구하기 위해 적용할 수 있습니다. 많은 바이러스 herpesviruses와 마찬가지로 HPV의 경우처럼, 또는 바이러스 생활주기의 어느 시점에서 감염의 주 사이트로서 중 상피 세포를 타겟팅합니다. 숙주 세포의 상호 작용 : organotypic 뗏목 문화를 성장하는...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 쥐의 꼬리 콜라겐 타입 1 (4-5mg/ml) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354,236 </td></tr><tr><td> NaHC0 세없이 DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-061 </td></tr><tr><td> NaHC0 3 </td><td> 시그마 </td><td> S5761 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Calbiochem </td><td> 391,338 </td></tr><tr><td> 스테인레스 금속 격자 </td><td> 윌리엄스와 기질 (주) </td><td> CR-03063-040-100-S </td></tr><tr><td> 전자 매체 11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 표피 성장 인자 </td><td> BD Biosciences </td><td> 354,010 </td></tr></tbody></table>

generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes

organotypic 상피 뗏목 문화의 발달은 체외 시스템을 충실히 recapitulates 상피 분화에 효율적으로 연구자를 제공합니다. 이 시스템에 대한 많은 용도가 있습니다. 예를 들어, keratinocytes의 입체 organotypic 뗏목 문화를 성장하는 능력은 인간 papillomavirus (HPV) 1의 연구에 중요한 이정표가되었습니다. HPV의 라이프 사이클은 긴밀하게 편평 상피 2의 분화에 링크되어 있습니다. 같은 Organotypic 상피 뗏목 문화가 여기에 바이러스 생산 3,4,5 포함한 전체 papillomavirus 수명주기를 재현 보여주었다. 또한, 이러한 뗏목 문화가 HPV와 생체내 감염에 따라 관찰 비슷한 dysplastic 병변을 나타냅니다. 따라서이 시스템은 또한 상피 세포 암뿐만 아니라, 일반적으로 상피 세포 분화에 대한 약물의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 원래 Asselineau 및 Prunieras 개발한 <s6&gt; 백업 및 Kopan 외 7.에 의해 수정, organotypic 상피 뗏목 문화 시스템이 콜라겐으로 세포의 성장과 관련된 일반적인, 비교적 쉬운 문화 모델로 성숙 공기 - 액체 인터페이스 (그림 1A)에서 관리하고 플러그. 10-14일의 과정 동안, 전지 계충화하다과 차별화, 차별화 특정 cytokeratins을 생산하고 전체 두께 상피 형성. 수확 보트는뿐만 아니라 표준 분자 및 생화 학적 기법으로, histologically 검사를 할 수 있습니다. 이 문서에서는 기본 인간 keratinocytes에서 뗏목 문화의 생성을위한 방법을 설명합니다. 동일한 기술은 설립 상피 세포 라인과 함께 사용할 수 있으며, 쉽게 정상 또는 질병 biopsies 8 시부터 상피 조직을 사용하기 위해 적용할 수 있습니다. 많은 바이러스가 대상 중 피부 또는 점막 상피 자신의 replicative 수명주기의 일부로. 지난 몇 년 동안의 가능성은 organotypic 뗏목 예찬에게 사용바이러스 숙주 세포 상호 작용을 연구하는 방법으로서 ures는 여러 herpesviruses뿐만 아니라 adenoviruses, parvoviruses 및 poxviruses 9 보여줘왔다. Organotypic 뗏목 문화는 따라서 바이러스 pathogenesis를 조사하기 위해 적응하고, 영구 세포 라인에 cultivable없는 이들 바이러스 소설 항바이러스 대리인을 테스트하는 유일한 수단입니다 수 있습니다.

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Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

<em&gt; 체외에서</em모방하는&gt; 방법<em&gt; 생체내에서</em&gt; 상피 분화가 설명되어 있습니다. 대부분의 바이러스는 바이러스 라이프 사이클의 일부로서 상피 세포를 타겟으로,이 방법은 바이러스를 검사하는 수단을 제공합니다 : 호스트 상호 작용을보다 밀접하게 발생하는 것이 비슷한 것을<em&gt; 생체내에서</em&gt;. 이 기술은 기본 keratinocytes 설립 세포 라인뿐만 아니라, 정상 또는 질병 생검 조직에서 사용할 수 있습니다.

기본 인적 Keratinocytes에서 Organotypic 뗏목 문화의 생성

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.1K 조회수.  University of North Carolina-Chapel Hill.  체외에서 방법 생체내에서 상피 분화가 설명되어 있습니다. 대부분의 바이러스는 바이러스 라이프 사이클의 일부로서 상피 세포를 타겟으로,이 방법은 바이러스를 검사하는 수단을 제공합니다 : 호스트 상호 작용을보다 밀접하게 발생하는 것이 비슷한 것을 생체내에서. 이 기술은 기본 keratinocytes 설립 세포 라인뿐?...

비디오: Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

약화 된 인간의 진피를 사용하여 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

연구

발생학

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased metastatic potential. Recently, mono-chemotherapies continue to improve by melanoma specific combination therapies with targeted kinase inhibitors. Still, metastatic melanoma remains a life-threatening disease because tumors exhibit primary resistance or develop resistance to novel therapies, thereby regaining tumorigenic capacity. In order to improve the therapeutic success of malignant melanoma, the determination of molecular mechanisms conferring resistance against conventional treatment approaches is necessary; however, it requires innovative cellular in vitro models. Here, we introduce an in vitro three-dimensional (3D) organotypic melanoma spheroid model that can portray the in vivo architecture of malignant melanoma and may warrant new insights into intra-tumoral as well as tumor-host interactions. The model incorporates defined numbers of mature and differentiated melanoma spheroids in a 3D human full skin reconstruction model consisting of primary skin cells. The cellular composition and differentiation status of the embedded melanoma spheroids is similar to the one of cutaneous melanoma metastasis in vivo. Using this organotypic melanoma spheroid model as a drug screening platform may support the identification of responders to selected combination therapies, while sparing the unnecessary treatment burden for non-responders, thereby increasing the benefit of therapeutic interventions.

Here, we present a protocol to generate a 3D organotypic melanoma spheroid skin model that recapitulates both the architecture and multicellular complexity of an organ/tumor in vivo but at the same time accommodates systematic experimental intervention.

3D Organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

암 연구학

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

생성 및 기본 인간 Keratinocytes 성인 피부에서의 경작

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human cancers. As a lining tissue, the skin epithelium is often subject to injury and has evolutionarily adapted by acquiring the cellular plasticity necessary to repair damaged tissue. Over the years, several efforts have been made to study epithelial plasticity using in&#160;vitro and ex vivo cell-based models. However, these efforts have been limited in their capacity to recapitulate the various phases of epithelial cell plasticity. We describe here a protocol for generating 3D epidermal spheroids and epidermal spheroid-derived cells from primary neonatal human keratinocytes. This protocol outlines the capacity of epidermal spheroid cultures to functionally model distinct stages of keratinocyte generative plasticity and demonstrates that epidermal spheroid re-plating can enrich heterogenous normal human keratinocytes (NHKc) cultures for integrin&#945;6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations with enhanced stem-like characteristics. Our report describes the development and maintenance of a high throughput system for the study of skin keratinocyte plasticity and epidermal regeneration.

Here we describe a protocol for the systematic cultivation of epidermal spheroids in 3D suspension culture. This protocol has wide-ranging applications for use in a variety of epithelial tissue types and for the modeling of several human diseases and conditions.

각질 줄기 세포 가소성을 모델링하기 위해 높은 처리량 표피 스페로이드 배양 시스템 구축

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

대규모로 3차원 재건 된 인간 표피 를 육성

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

생체공학

Organotypic 3D Skin Culture: A Cassette-based In Vitro Culture Technique to Regenerate Human Epidermis on Acellular Dermis

Source: Jingting Li et al. <a href="https://www.jove.com/v/53280"> Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis</a>, J. Vis. Exp. (2015).
This video protocol describes a cassette-based in vitro culture technique to generate&#160;human organotypic skin using epidermal keratinocytes and devitalized human dermis. They mimic the function and physiology of their in vivo tissue counterparts.

유기형 3D 피부 배양: 무세포 진피에서 인간 표피를 재생하는 카세트 기반 체외 배양 기술

Source: Jingting Li et al.  Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis, J. Vis. Exp. (2015).
This video ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Skin Cancer

Assays and techniques

Human Skin Keratinocyte Isolation: A Method to Culture Primary Keratinocytes from Skin Samples

Johansen, C. et al. <a href="https://www.jove.com/v/56863"> Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin</a>. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of keratinocytes&#8212;the most prominent cells of human skin&#39;s epidermal layer, by employing a combination of enzymatic digestion and mechanical disruption methods. This method helps in the preferential growth of keratinocytes over other skin cell types using a selective growth medium.

인간 피부 각질 세포 분리: 피부 샘플에서 1차 각질 세포를 배양하는 방법

Johansen, C. et al.  Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of ...

Genetic Modification of Primary Human Keratinocytes: A Method for Genetically Manipulating Keratinocytes Using Recombinant Retroviruses

Source: Li, J. et al. <a href="https://www.jove.com/v/53280"> Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis</a>. J. Vis. Exp. (2015)
This video describes a detailed protocol for producing genetically modified primary human keratinocytes recombinant retrovirus. This method can be used to manipulate gene expression in keratinocytes.