دون مشط

<html> 1. الأنزيمية deglycosylation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام أنابيب PCR لتقليل فاقد المياه بسبب التبخر. تسمية مجموعة واحدة من أنابيب 1-7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد في 10X G7 العازلة ، وتغيير طبيعة 10X العازلة بروتين سكري ، ونسبة 10 ٪ NP - 40 واضغط بلطف أنابيب لخلط محتوياتها. تبقي في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قارورة تحتوي على انزيم على الجليد. في محاولة للحد من ذوبان الجليد / تجميد دورات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل محتويات القارورة hCGβ (150 ميكروغرام) في 600 درهم ميكرولتر من 2 O والحفاظ على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 مل من إعداد 1X العازلة التي G7 تمييع المخزون 10X درهم في 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخفف 0.5 ميكرولتر من F PNGase العازلة في 25 ميكرولتر G7 1X والحفاظ على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مزيج exoglycosidase (EG مزيج) من خلال الجمع بين كل من 2 ميكروليتر α - Acetylgalactosaminidase - N ، فوكوزيداز α1 - 2 ، غالاكتوزيداز β1 - 3 ، وα1 3 ، 6 غالاكتوزيداز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء أنابيب PCR على النحو المبين : </li></ol>حزب العدالة والتنمية &quot;&gt; <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> أنبوب / عينة # </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> hCGβ (0.25mg/ml) </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> -- </td><td> -- </td><td> -- </td></tr><tr><td> جلايكوبروتين 10X تغيير طبيعة العازلة </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> -- </td><td> -- </td><td> -- </td><td> -- </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td></tr></tbody></table><ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غطاء الأنابيب ، مزيج بلطف ومكانته فيthermocycler ، إغلاق الغطاء وتفسد البروتينات التي يحتضنها 10 دقائق في 94 درجة مئوية ، ويعقبها عقد 4 درجات مئوية (PCR باستخدام أنابيب في thermocycler يمنع التبخر بشكل كبير في عينات صغيرة الحجم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأنابيب من thermocycler والطرد المركزي لإزالة أي تكثف مرئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الكواشف التالية على النحو المبين : </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عينة # </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> 10 ٪ NP - 40 </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> G7 الاحتياطي 10X </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5 و مو؛ ل </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> PNGase F 01:50 ديل. </td><td> -- </td><td> 2μl </td><td> -- </td><td> -- </td><td> 2μl </td><td> -- </td><td> -- </td></tr><tr><td> Deglycosylation ميكس </td><td> -- </td><td> -- </td><td> 2μl </td><td> 2μl </td><td> -- </td><td> 2μl </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> مزيج EG </td><td> -- </td><td> -- </td><td> -- </td><td> 2μl </td><td> -- </td><td> -- </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> 10μl </td><td> 8μl </td><td> 8μl </td><td> 6μl </td><td> 8μl </td><td> 8μl </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> مجموع ردود الفعل المجلد. </td><td> μ ل 25 </td><td> μ ل 25 </td><td> μ ل 25 </td><td> 25 μ ل &lt;/ TD&gt; <td> μ ل 25 </td><td> μ ل 25 </td><td> μ ل 25 </td></tr></tbody></table><ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق أنابيب PCR باستخدام قبعات جديدة (تجاهل تلك المستخدمة لأنها لا تناسب بشكل صحيح بعد دورة الحضانة واحد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج الأنابيب بالنقر برفق 4 مرات ثم تدور محتويات أسفل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الأنابيب في thermocycler واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات ثم تبرد العينات الى 4 درجة مئوية. </li></ol> 2. SDS - PAGE عينات deglycosylated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 130 الطازجة 3X ميكرولتر تحميل SDS خفض العازلة بإضافة 4 ميكرولتر من DTT 1.25M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 12.5 ميكرولتر من إعداد 3X خفض العازلة تحميل SDS على كل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق أنابيب مع قبعات جديدة والاستفادة برفق لمزج الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأنابيب في thermocycler في 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم تبرد إلى 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 30 ميكرولتر من كل عينة و 10 ميكرولتر من البروتين علامة على هلام تريس - جليكاين 10-20 ٪. إنقاذ ما تبقى من عينة لجزء 3.1. تحميل 10μl من البروتين Prestained ColorPlus ماركر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrophorese الجل ب 130 فولت في درجة حرارة الغرفة حتى صبغ الجبهة بالقرب من الجزء السفلي من هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند انتهاء تشغيل هلام ، إزالة هلام من المدلى بها ووضعها في علبة بلاستيكية صغيرة زرقاء مع بقع Coomasie يكفي لتغطية هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار في هلام لمدة 1 ساعة مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اغسل الجل ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة في 50 مل من محلول يزيل اللون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل الصور باستخدام transilluminator الضوء الأبيض أو الماسح الضوئي. بدلا من ذلك ، يمكن المجففة هلام بين ورقة من السيلوفان في إطار. </li></ol> 3. س الموالية للالزمرد 300 للكشف عن البروتينات في الغليكوزيلاتي SDS - PAGE المواد الهلامية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالتوازي مع هلام في 2.1) ، وتحميل ما تبقى من العينات على هلام تريس - جليكاين 10-20 ٪. تحميل 10 و مو؛ لتر من ماركر ColorPlus Prestained البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن جل يشغل حل كاشف الزمرد الموالية للسؤال مع DMF وإعداد المخزون فيكس ، اغسل والمؤكسدة حلول للالزمرد برو - Q 300 وصمة عار في أعقاب دليل المنتج المتوفرة مع الطقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند اكتمال الكهربائي ، إزالة هلام من المدلى بها ووضعها في صندوق من البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح هلام بإضافة 100 مل من الحل إصلاح بين عشية وضحاها ، وتركها في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل هلام مع 100 مل من محلول الغسيل لمدة 10 إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات غير اليهود. تكرار غسل بمحلول غسيل الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أكسدة الكربوهيدرات التي يحتضنها الجل مع الإثارة لطيف لمدة 30 دقيقة في 25 مل من محلول المؤكسدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اغسل الجل كما هو موضح في الخطوة 3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن جل هو غسل إعداد الطازجة برو - Q 300 الزمرد وصمة عار وذلك بإضافة 500 ميكروليتر من محلول الزمرد برو - Q 300 كاشف الذائبة في خطوة 3،2-25 ملتلطيخ العازلة المنصوص عليها في الطقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار الجل وذلك بإضافة 25 مل من وصمة عار على استعداد في الخطوة 3.8 و تفرخ في الظلام لطيف مع الانفعالات لمدة 90 إلى 120 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات غسل المذكورين في الخطوة 3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل صور الأشعة فوق البنفسجية مع transilluminator في 300nm. استخدام علامة كيلو دالتون 80 ، وهو المسمى مع الأخضر الزمردي الموالية للسؤال ، لتداخل صورة إلى صورة الأشعة فوق البنفسجية الضوء الأبيض من هلام تبين prestained سلم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قارن بين الصور من هلام ملون على Coomasie 2.10 في الخطوة مع هلام الزمرد الموالية للسؤال الملون من الخطوة 3.11. </li></ol> 4. ممثل النتائج وتظهر التغييرات في الهجرة بعد deglycosylation البروتين الأنزيمي في الشكل 2. مقارنة بين عينة التحكم (لوحة A ، حارة 1) مع العلاج F PNGase (إزالة N - glycans ، لين 2) ، وميكس Deglycosylation (F PNGase ؛ زائد إندو وexoglycosidases لإزالة O - glycans ، حارة 3). لا مزيد من الانخفاضفي الحجم يعتبر بعد هضم مع glycosidases إضافية (حارة 4). بالإضافة إلى تغيير في الكتلة ، والعصابات أصبحت أكثر وضوحا حيث ستزال glycans. فرقة تعمل تحت علامة 17 كيلو دالتون (النجمة) ويمثل (MW : 16 كيلو دالتون) deglycosylated تماما hCGβ ببتيد. قد فرق أخرى مستمدة من deglycosylation ناقصة أو من البروتينات مجهولة متعددة موجودة في عينة hCGβ (انظر حارة 1). الممرات 5-7 (الضوابط) إظهار الفرق المقابلة لglycosidases. يظهر تلطيخ بروتين سكري بواسطة الزمرد الأخضر في هذه اللوحة ب كاشف يتأكسد والبقع جميع glycans موجودة في جزيء البروتين. ولشدة إشارة النقصان كما هو deglycosylated إنزيمي hCGβ (حارة حارة من 1 إلى 4). إشارة المتبقية في الحارات 3 و 4 تشير إلى وجود زخارف غليكان ، والتي هي مقاومة للالانزيمات المستخدمة. وglycosidases إضافية تستخدم في حارة 4 إزالة مخلفات السكر في عدد قليل اضافي : هجرة البروتين هو نفسه ، ولكنويمكن ملاحظة انخفاض طفيف في كثافة في تلطيخ. والأنصاف السكر المقاومة غير موجودة في جميع أنواع البروتين : لم يتم الكشف عن بعض الفرق التي كتبها الزمرد الأخضر (تغيب في صورة الأشعة فوق البنفسجية ، بين قوسين) ، مما يدل على نطاق واسع أنها كانت deglycosylated. بيانات إضافية تدعم الاستنتاج القائل الغليكوزيلاتي heterogeneously hCGβ. انخفاض الفرقة في حارة 2 (السهم) وخافت على الصورة الأخضر الزمردي ، في حين أن الشريط العلوي في حارة 2 هو مشرق ، مشيرا إلى أن العديد من الجماعات glycans لا تزال موجودة. هذه البيانات تدعم الاستنتاج بأن hCGβ المؤتلف وأعرب في خلايا الفأر يحتوي glycoforms متعددة 9. وتمتد هذه glycoforms مختلفة نظرا لعدم التجانس المتأصل في بعض البروتينية ارتباط بالغليكوزيل حيث لا تتلقى غليكان الآراء في كل موقع و / أو بعض glycans حين أن البعض الآخر حتى على البروتين نفسه ليسوا كذلك. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3749/3749fig1.jpg" /> الشكل 1.ارتباط بالغليكوزيل أنماط نموذجية ليفرز أو جليكوبروتينات سطح الخلية. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3749/3749fig2.jpg" /> الشكل 2. SDS - PAGE الهلام يظهر deglycosylation الأنزيمية من hCGβ. وتظهر لوحة تلوين Coomasie زرقاء بينما الفريق B يظهر نتائج الموالية للسؤال عن التصور الزمرد 300 من البروتينات الغليكوزيلاتي. عينة رقم : 1 ، ومراقبة hCGβ ؛ 2 ، F PNGase الهضم ؛ 3 ، Deglycosylation الهضم ميكس ، 4 ، ميكس Deglycosylation زائد exoglycosidases الهضم ، وعينات 5-7 هي الضوابط كاشف (O - Glyc ، O - غليكوزيداز ؛ GNA ، β - N - Acetylglucosaminidase ؛ غال / الجبهة ، β1 - 3 غالاكتوزيداز ، α1 - 3 ، 6 غالاكتوزيداز وα1 2 - فوكوزيداز ؛ GalNA ، α - N - Acetylglalactosaminidase ؛ نوي ، النورامينيداز ؛ PNGase ؛ PNGase F)

<ol>
	<li>Spiro, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation:+nature,+distribution,+enzymatic+formation,+and+disease+implications+of+glycopeptide+bonds.">Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds.</a> Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).</li><li>Ohtsubo, K., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation+in+Cellular+Mechanisms+of+Health+and+Disease.">Glycosylation in Cellular Mechanisms of Health and Disease.</a> Cell. 126, 855-867 (2006).</li><li>Arnold, J. N., Wormald, M. R., Sim, R. B., Rudd, P. M., Dwek, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+glycosylation+on+the+biological+function+and+structure+of+human+immunoglobulins.">The impact of glycosylation on the biological function and structure of human immunoglobulins.</a> Annual Review of Immunology. 25, 21-50 (2007).</li><li>Mitra, N., Sinha, S., Ramya, T. N. C., Surolia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+oligosaccharides+as+outfitters+for+glycoprotein+folding,+form+and+function.">N-linked oligosaccharides as outfitters for glycoprotein folding, form and function.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31, 156-163 (2006).</li><li>Carlsen, R. B., Bahl, O. P., Swaminathan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+chorionic+gonadotropin.+Linear+amino+acid+sequence+of+the+beta+subunit.">Human chorionic gonadotropin. Linear amino acid sequence of the beta subunit.</a> Journal of Biological Chemistry. 248 (19), 6810-6812 (1973).</li><li>Tarentino, A. L., Plummer, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deglycosylation+of+Asparagine-linked+Glycans+by+PNGaseF.">Deglycosylation of Asparagine-linked Glycans by PNGaseF.</a> Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 5 (23), 163-170 (1993).</li><li>Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-N4-(N-acetyl-&#946;-glucosaminyl)asparagine+amidase+F+cannot+release+glycans+with+fucose+attached+&#945;1-3+to+the+asparagine-linked+N-acetylglucosamine+residue.">Peptide-N4-(N-acetyl-&#946;-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached &#945;1-3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue.</a> European Journal of Biochemistry. 199, 647-652 (1991).</li><li>Koutsioulis, D., Landry, D., Guthrie, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+endo-&#945;-N-acetylgalactosaminidases+with+broader+substrate+specificity.">Novel endo-&#945;-N-acetylgalactosaminidases with broader substrate specificity.</a> Glycobiology. 18 (10), 799-805 (2008).</li><li>Thakur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+glycoforms+of+the+intact+alpha+subunit+of+recombinant+human+chorionic+gonadotropin+by+high-resolution+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry.">Profiling the glycoforms of the intact alpha subunit of recombinant human chorionic gonadotropin by high-resolution capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (2), 8900-8907 (2009).</li><li>Park, S., Lee, M. R., Shin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+microarrays+as+powerful+tools+in+studies+of+carbohydrate-mediated+biological+processes.">Carbohydrate microarrays as powerful tools in studies of carbohydrate-mediated biological processes.</a> Chemical Communications. 37, 4389-4399 (2008).</li><li>Zachara, N. E., Vosseller, K., Hart, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+analysis+of+proteins+modified+by+O-linked+N-acetylglucosamine.">Detection and analysis of proteins modified by O-linked N-acetylglucosamine.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 95, 17-17 (2011).</li><li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Essentials of Glycobiology. , (2008).</li></ol>

ويعمل في كتاب من قبل نيو انغلاند Biolabs ، والتي تنتج العديد من الكواشف المستخدمة في هذه المقالة.

وصف الأسلوب هنا باستخدام deglycosylation الأنزيمية وSDS PAGE ، يمكن أن توفر معلومات قيمة حول حالة ارتباط بالغليكوزيل من البروتين من الفائدة ، بينما غليكان محددة الكواشف تسهيل تفسير البيانات. ويهدف هذا البروتوكول للدراسات الأولية للارتباط بالغليكوزيل البروتين وخصوصا انه يناسب لإفرازية وجليكوبروتينات الغشاء من خلايا الثدييات : الانزيمات المختار في هذه الحالة على وجه التحديد سوف يزيل جميع N - glycans وأو N - glycans زائد والسكريات الأكثر شيوعا توسيع وتشكيل نواة O - glycans. Glycosidases لديها ميزة إضافية كونها معتدلة ، مقارنة مع أساليب deglycosylation الكيميائية ، والحفاظ على سلامة كل من السكريات والبروتين العمود الفقري. لتوضيح معدل الإشغال (التي هي الغليكوزيلاتي الأحماض الأمينية) ، ومدى ارتباط بالغليكوزيل ، أو لتحديد هيكل غرامة glycans ، وتقنيات أكثر تطورا مثل ممطلوبة الطيف الحمار ، واللوني السائل أو الرنين المغناطيسي النووي. بسبب بساطتها ، يمكن تعديلها عدة خطوات في هذا البروتوكول ، واستبداله ، و / أو مجتمعة لتلبية احتياجات مختلف التجريبية. ومع ذلك ، من أجل الحصول على النتائج التي يمكن أن تفسر بشكل واضح أنه من المهم أن نفهم نقاط قوتها والقيود. أولا ، لخصوصية ونقاء glycosidases حاسمة : يجب ان تستخدم فقط الانزيمات جيدا اتسم اختبارها لتكون خالية من البروتياز وغيرها من الأنشطة الملوثة. للأسف ، لا توجد وحدة انزيم تعريف موحد للglycosidases ؛ يجب على المستخدم تحديد بدائل مناسبة وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. الثاني ، وهو اختيار دقيق للكشف ضروري : أ تلطيخ بروتين) الكواشف مفيدة فقط إذا deglycosylation في النتائج تحولا كبيرا في الكتلة الجزيئية. ليست هذه نتيجة واضحة كما هو موضح هنا تم الحصول عليها دائما. في حالات أخرى ، شهدنا ميل طبيعيغريشن بعد deglycosylation (بعيدا عن الوزن الجزيئي وتوقع ، أو حتى الهجرة أبطأ). ليست هذه الظاهرة مفهومة جيدا ، ولكن يمكن القول أن أي تغيير في الهجرة هي الأدلة التي تم deglycosylated البروتين. ب) الكشف عن الأجسام المضادة للسكر مع تحديات فريدة الحد من تطبيقها. فقد كان من الصعب للغاية لتوليد العامة لمكافحة غليكان الأضداد ؛ تثار عادة ضد هدف غليكان المعقدة ، الأمر الذي يحد من استخدامها. وعلاوة على ذلك ، وعدة وحيدة النسيلة المضادة للأضداد غليكان عرض تفاعلية عبر 10 غير مرغوب فيها. ج) Lectins (البروتينات مع تقارب السكر الذاتية) هي مناسبة تماما للكشف عن السكر ، بالإضافة إلى أنها تعطي فكرة عن هيكل غليكان. ومع ذلك ، ليس كل منهم يملك خصوصية ضيقة ، وتتميز العديد جزئيا فقط (بمعنى أنها يمكن أن تكون الصلات غير معروف). باعتباره نتيجة تلطيخ lectin مؤشرا إيجابيا ، وليس دليلا ، من وجود غيفين السكر. د وضع العلامات الكيميائية) مجموعات (على أساس الأكسدة بريودات من السكريات) هي الطريقة المفضلة لصبغ جميع جليكوبروتينات ، وبالتالي تتناسب بشكل جيد لمتابعة deglycosylation. عند معالجة عينة مجهولة ، وهو ممارسة جيدة لتشمل الضوابط بروتين سكري. فتوين هي متاحة بسهولة N -- O وبروتين سكري ؛ موجهة الغدد التناسلية المشيمية (سواء مفارز) هو أيضا خيارا جيدا. ألبومين المصل البقري يمكن (BSA) أن يستخدم كعنصر تحكم سلبية. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن بعض البروتينات غير الغليكوزيلاتي يتفاعل بشكل طفيف مع الزمرد الموالية للس 300 ، وخاصة عندما تستخدم في تركيزات عالية. غير الغليكوزيلاتي معايير الوزن الجزيئي ، مثل علامة البروتين prestained المستخدمة في هذا البروتوكول ، لديها ميزة عرض شرائح حادة. فقط عن طريق الصدفة هي واحدة من هذه البروتينات (80 كيلو دالتون) رد الفعل المؤيدة للالزمرد س 300. لذا ، قد يكون للمستخدم تريد تشغيل سلم القياسية بدلا من بروتين سكري ، مثل حلوى قصب من Invitrogeن. أخيرا ، بسيطة في جل كشف جليكوبروتينات nucleocytosolic (والتي يتم تعديلها مع GlcNAc - O واحد) هو ممكن مع استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، جنبا إلى جنب β - N - Acetylglucosaminidase من أجل السيطرة النوعية 11. وصف هذا الأسلوب هو ما وراء وتجدر الإشارة نطاق هذه المقالة ، ولكنه كما glycosidases هي أدوات مفيدة لدراسة جليكوبروتينات أخرى كثيرة ، وglycoconjugates موجودة في الخلايا. يمكن العثور على العلاج الشامل لجميع أشكال معروفة من ارتباط بالغليكوزيل في الطبعة الثانية من &quot;أساسيات غليكوبيولوغي&quot; ؛ عبر الإنترنت الحرة المتوفرة على رف الكتب NCBI (ID BOOKSHELF : NBK1908 ؛ PMID : 20301239) 12.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> β الإنسان موجهة الغدد التناسلية المشيمية </td><td> سيغما الدريتش </td><td> C6572 </td><td></td></tr><tr><td> PCR أنابيب </td><td> VWR </td><td> 20170-004 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Thermocycler </td><td> تطبيق النظم البيولوجية </td><td> 4359659 </td><td></td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> نيو انغلاند Biolabs </td><td> P0704 </td><td> الموردة مع مخازن </td></tr><tr><td> البروتين Deglycosylation ميكس </td><td> نيو انغلاند Biolabs </td><td> P6039 </td><td> الموردة مع مخازن </td></tr><tr><td> α - N - Acetylglalactosaminidase </td><td> نيو انغلاند Biolabs </td><td> P0734 </td><td> مزودة العازلة </td></tr><tr><td> α1 - 2 فوكوزيداز </td><td> نيو انغلاند Biolabs </td><td> P0724 </td><td> مزودة العازلة </td></tr><tr><td> α1 - 3 ، 6 غالاكتوزيداز </td><td> نيو انغلاند Biolabs </td><td> P0731 </td><td> مزودة العازلة </td></tr><tr><td> β1 - 3 غالاكتوزيداز </td><td> نيو انغلاند Biolabs </td><td> P0726 </td><td> مزودة العازلة </td></tr><tr><td> 10X الاحتياطي G7 (500 ملي فوسفات الصوديوم) </td><td> نيو انغلاند Biolabs </td><td> --- </td><td> مزودة PNGaseF أو مزيج Degl </td></tr><tr><td> 10X الاحتياطي جلايكوبروتين تغيير طبيعة (5 ٪ SDS ، 400 مم DTT) </td><td> نيو انغلاند Biolabs </td><td> --- </td><td> مزودة PNGaseF أو مزيج Degl </td></tr><tr><td> 10 ٪ NP - 40 </td><td> نيو انغلاند Biolabs </td><td> --- </td><td> مزودة PNGaseF أو مزيج Degl </td></tr><tr><td> 3X SDS تحميل العازلة (187.5 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 ، 6 ٪ SDS ، الجلسرين 30 ٪ ، 0.03 ٪ بروميتش البيونophenol الأزرق) </td><td> نيو انغلاند Biolabs </td><td> B7703 </td><td> مزودة DTT 1.25M </td></tr><tr><td> Prestained ColorPlus ماركر البروتين </td><td> نيو انغلاند Biolabs </td><td> P7709 </td><td></td></tr><tr><td> 10-20 ٪ تريس - جليكاين Multigel </td><td> شركة كوزمو بيو </td><td> DCB - 414893 </td><td></td></tr><tr><td> الكاسيت الكهربائي وحدة </td><td> شركة كوزمو بيو </td><td> DCB - 303111 </td><td></td></tr><tr><td> EPS الكهربائي التيار الكهربائي 301 </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr><tr><td> س الموالية للالزمرد كيت جلايكوبروتين 300 اللطخة </td><td> Invitrogen </td><td> P - 21857 </td><td></td></tr><tr><td> الأزرق اللامع R </td><td> سيغما الدريتش </td><td> B0149 </td><td></td></tr><tr><td> AlphaImager نظام HP </td><td> خلية العلوم البيولوجية </td><td> 92-13823-00 </td><td></td></tr></tbody></table>

identification and characterization of protein glycosylation using specific endo- and exoglycosidases

ارتباط بالغليكوزيل ، إضافة السكريات مرتبطة تساهميا ، هي كبرى بعد التعديل متعدية من البروتينات التي يمكن أن تؤثر تأثيرا كبيرا على عمليات مثل خلية التصاق ، والاتجار الجزيئية ، وإزالة الألغام ، ونقل الإشارة 1-4. في حقيقيات النوى ، والتعديلات ارتباط بالغليكوزيل الأكثر شيوعا في مسار إفرازية والاضافات في البقايا الأسباراجين الآراء (N - مرتبط) ، أو على بقايا أو السيرين ثريونين (O - مرتبط) (الشكل 1). يتم حفظها للغاية بدء N - غليكان التوليف في حقيقيات النوى ، في حين أن المنتجات النهائية يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا بين الأنواع المختلفة ، والأنسجة ، أو البروتينات. تبقى بعض glycans معدلة (&quot;عالية مانوز N - glycans&quot;) أو يتم معالجتها مرة أخرى في غولجي (&quot;معقدة N - glycans&quot;). تم العثور على تنوع أكبر لO - glycans ، والتي تبدأ مع بقايا المشتركة (GalNAc) N - Acetylgalactosamine في الخلايا الحيوانية ولكنها تختلف في أقل الكائنات الحية 1. الأنف والحنجرة &quot;&gt; تحليل مفصل للارتباط بالغليكوزيل من البروتينات هو حقل في حد ذاته ويتطلب موارد واسعة وخبرة لتنفيذ بشكل صحيح ، ولكن مجموعة متنوعة من الانزيمات التي تعمل على إزالة السكريات المتوفرة (glycosidases) يجعل من الممكن أن يكون فكرة عامة عن حالة من ارتباط بالغليكوزيل . بروتين في إعداد مختبر القياسية ونحن هنا توضيح استخدام glycosidases لتحليل بروتين سكري طراز : المشيمي البشري المؤتلف جونادوتروبين بيتا (hCGβ) ، الذي يحمل N - two glycans وأربعة O - 5 glycans تقنية بسيطة تتطلب فقط يمكن أن تكون الأجهزة والمواد الاستهلاكية العادية ، وأنها تتكيف بسهولة لتحليل عينات من بروتين سكري متعددة. ويمكن استخدام العديد من الانزيمات في دراسة موازية لبروتين سكري. PNGase F قادرة على إزالة ما يقرب من جميع أنواع N - مرتبطة glycans 6،7. لO - glycans ، لا يوجد أي انزيم المتاحة التي يمكن أن يلتصق an oligosaccharide سليمة من اله البروتين العمود الفقري. بدلا من ذلك ، يتم قطع O - glycans بواسطة exoglycosidases إلى نواة قصيرة ، وهو ثم إزالتها بسهولة عن طريق O - غليكوزيداز. ويحتوي على مزيج من البروتين Deglycosylation PNGase F ، O - غليكوزيداز ، النورامينيداز (سياليداز) ، غالاكتوزيداز β1 - 4 و β - N - Acetylglucosaminidase. يتم استخدامها لإزالة في وقت واحد N - glycans وبعض glycans O - 8. أخيرا ، تم استكمال ميكس Deglycosylation بمزيج من exoglycosidases الأخرى (α - N - Acetylgalactosaminidase ، α1 فوكوزيداز - 2 ، α1 - 3 ، 6 غالاكتوزيداز وغالاكتوزيداز β1 - 3) ، والتي تساعد على إزالة السكريات الأحادية التي يمكن أن تقاوم إلا أن تكون موجودة في O - glycans معينة. يستخدم SDS-PAGE/Coomasie الزرقاء لتصور الاختلافات في بروتين الهجرة قبل وبعد العلاج غليكوزيداز. بالإضافة الى ذلك ، السكر التلوين بطريقة محددة ، ProQ الزمرد - 300 ، كما يظهر إشارة تقلص glycans هي succeإزالة ssively. ويهدف هذا البروتوكول لتحليل كميات صغيرة من بروتين سكري (0،5-2 ميكروغرام) ، رغم أنه يمكن تحجيمها deglycosylation الأنزيمية لاستيعاب كميات أكبر من البروتين حسب الحاجة.

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases at JoVE.com

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

باستخدام glycosidases محددة لإزالة السكر من جليكوبروتينات تليها SDS - PAGE هي طريقة للكشف عن قيمة غليكان تعديلات على عينات البروتين و هو اختيار جيد للدراسات غليكوبيولوغي الأولي. ويمكن الكشف عن التغييرات التالية deglycosylation والتحولات في التنقل هلام أو تلطيخ مع الكواشف الحساسة غليكان.

تحديد وتوصيف ارتباط بالغليكوزيل باستخدام بروتين معين إندو وexoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

identification-characterization-protein-glycosylation-using-specific

Research

JoVE Journal

Biology

36.4K Views.  New England Biolabs. باستخدام glycosidases محددة لإزالة السكر من جليكوبروتينات تليها SDS - PAGE هي طريقة للكشف عن قيمة غليكان تعديلات على عينات البروتين و هو اختيار جيد للدراسات غليكوبيولوغي الأولي. ويمكن الكشف عن التغييرات التالية deglycosylation والتحولات في التنقل هلام أو تلطيخ مع الكواشف الحسا...

Video: Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

تحديد بروتين المجمعات مع كمية البروتينات في البيرة س.

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

تحديد الشركاء البروتين عن طريق التفاعل جنبا الى جنب الانجذاب تنقية

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

كيميائيا سدت [ميكروأري] لتحديد ملامح عالية الإنتاجية من تعدد في الإرسال ارتباط بالغليكوزيل بروتين معين في عينات مجمع

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

طريقة لعزل وتحديد من microRNAs، وmRNAs ومكونات البروتين من بروتين نووي ريبوزي مجمعات من مقتطفات خلية باستخدام رقاقة RIP

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer's disease (A&beta;, tau), Parkinson's Disease (&alpha;-synuclein), Huntington's disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for A&beta;6, tau7-9, &alpha;-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
 Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic &alpha;-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.

The generation, purification and cell invasion of intracellular, cytoplasmic full length DISC1 protein aggresomes from cell cultures and of a labeled, multimeric recombinant DISC1 protein fragment in E. coli are described. Cell invasiveness is shown for recipient cells in cell culture and for neurons in vivo after stereotactical brain inoculation.

جيل وتنقية، وتوصيف الأنواع الغازية خلية البروتين DISC1

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. The advantages of pyrosequencing for microbiology applications include rapid and reliable high-throughput screening and accurate identification of microbes and microbial genome mutations. Pyrosequencing involves sequencing of DNA by synthesizing the complementary strand a single base at a time, while determining the specific nucleotide being incorporated during the synthesis reaction. The reaction occurs on immobilized single stranded template DNA where the four deoxyribonucleotides (dNTP) are added sequentially and the unincorporated dNTPs are enzymatically degraded before addition of the next dNTP to the synthesis reaction. Detection of the specific base incorporated into the template is monitored by generation of chemiluminescent signals. The order of dNTPs that produce the chemiluminescent signals determines the DNA sequence of the template. The real-time sequencing capability of pyrosequencing technology enables rapid microbial identification in a single assay. In addition, the pyrosequencing instrument, can analyze the full genetic diversity of anti-microbial drug resistance, including typing of SNPs, point mutations, insertions, and deletions, as well as quantification of multiple gene copies that may occur in some anti-microbial resistance patterns.

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains, and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. In this video, the procedure for microbial amplicon generation, amplicon pyrosequencing, and DNA sequence analysis will be demonstrated.

Pyrosequencing لتحديد وتوصيف الميكروبية

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

عزل المناطق الجينوم محددة وتحديد أسوشيتد الجزيئات التي enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.