وكان هذا المشروع دعما جزئيا من قبل جامعة جونز هوبكنز، مكتب وكيل الجامعة من خلال مبادرة العلوم وبوابة QIAGEN شركة

مقدمة: مستعمرة بكتيرية واحدة ينبغي أن تستخدم لتطعيم مرق ثقافة المناسبة التي حضنت بين عشية وضحاها. ثم تتم معالجة بيليه البكتيرية لتنقية الحمض النووي الجيني باستخدام المتاحة تجاريا الجيني عدة العزلة. الحمض النووي الجيني تنقية ينبغي أن يكون لها نسبة 260/280 (نانومتر)&gt; 1.8 لضمان أن تكون العينة خالية من التلوث البروتين. كمية من الحمض النووي الجيني اللازمة لتوليد القالب pyrosequencing هو 10-20 نانوغرام. A. التضخيم من قالب (PyroMark PCR الدليل؛ <a href="http://www.qiagen.com/handbooks" target="_blank">www.qiagen.com / كتيبات</a> 1) إعداد رد فعل PCR ملاحظة: يجب أن البيروكسيديز واحد التمهيدي في نهاية ه 5 &#39;، ووينصح أن يكون HPLC المنقى لإعداد القالب. نوصي PyroMark الفحص تصميم البرمجيات 2.0 ل PCR وSEquence التصميم التمهيدي التي هي الأمثل لفترة قصيرة للقراءة التسلسل، ومع ذلك، التمهيدي للانفجارات ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome" target="_blank">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi؟LINK_LOC=BlastHome</a> يمكن) من NCBI أيضا أن تستخدم لتصميم التمهيدي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد كل الحلول المطلوبة (المذكورة في الجدول 1) وتخلط كل بدقة. إعداد رد فعل وفقا للجدول 1. ويمكن أن يتم كل العمل في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> ملاحظة: PCR ماجستير ميكس يحتوي MgCl 2 لتركيز النهائي من 1.5 ملم، والتي توفر نتائج مرضية في معظم الحالات. إذا كان أعلى 2 ملغ مطلوب + تركيز، وتصل إلى 3.5 ميكرولتر من 25 ملم MgCl 2 يمكن أن تضاف إلى رد فعل. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخلط جيدا مزيج رد فعل من قبل pipetting بلطف صعودا ونزولا، ثم الاستغناء عن وحدات التخزين المناسبة في أنابيب PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة templatه الحمض النووي لكل أنبوب PCR. ونحن نوصي 10 نانوغرام من الحمض النووي الجيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برنامج cycler الحرارية وفقا للجدول 2. A عقد النهائي في 4 درجات مئوية لمدة ينصح الراحة. إذا باستخدام cycler الحرارية دون غطاء ساخنة، وردود الفعل تراكب مع 100 ميكرولتر الزيوت المعدنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنابيب PCR في cycler وبدء برنامج ركوب الدراجات. </li></ol> B. البروتوكول محطة فراغ شل حركة المنتجات PCR البيروكسيديز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل مزيج الرئيسي وفقا لالرقم 4. </li></ol> ملاحظة: قبل pipetting ل، هز بلطف زجاجة من الخرز سيفاروز streptavidin المغلفة لضمان تعليق متجانسة. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعتمادا على حجم المنتج PCR المستخدمة، الاستغناء 60-75 ميكرولتر مزيج الرئيسي في كل بئر من لوحة PCR لإعطاء حجم ما مجموعه 80 ميكرولتر لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5-20 ميكرولتر منتج PCR البيروكسيديز إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اغلاق الآبار مع قطاع CAPS وتستنهض الهمم لوحة PCR في 1،400 دورة في الدقيقة لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية) باستخدام شاكر المداري. </li></ol> تمسخ من الحمض النووي وبالإضافة إلى ذلك من تسلسل التمهيدي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الاشعال التسلسل إلى 0.3 ميكرومتر مع الصلب العازلة والاستغناء عن 25 ميكرولتر في كل بئر من لوحة رد فعل. وضع لوحة على محطة العمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أحواض محطة العمل وفقا لمخطط الشكل 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مضخة فراغ، وتأكد من ضبط المفتاح على أداة فراغ لفي (الشكل 6). مسح تحقيقات مع فلتر المياه عالية النقاء (ملي-Q 18.2 ميغاواط X سم أو ما يعادلها) في الحوض الصغير 5 (الشكل 5). إعادة ملء الحوض بالماء عالية النقاء العذبة للاستخدام في الخطوة 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل بسرعة، ووضع لوحة PCR مع الخرز على محطة العمل. ضمان أن كلا من لوحات في نفس التوجه كما هو الحال عندما تم تحميل العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع التبديل فراغ ON، خفض الفراغأداة في الآبار من لوحة PCR لمدة 20 ثانية أو حتى تم يستنشق كل حجم. سوف يتم القبض على حبات من قبل أداة فراغ (الشكل 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الفراغ لا يزال ON، تدفق أداة مع الايثانول 70٪ (الحوض الصغير 1) لمدة 20 ثانية أو حتى تم يستنشق كل حجم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع فراغ ON، تدفق أداة مع حل تمسخ (حوض 2) لمدة 20 ثانية أو حتى تم يستنشق كل حجم. </li></ol> ملاحظة: يحتوي الحل تمسخ هيدروكسيد الصوديوم، الذي هو العين وأنسجة الجلد. دائما ارتداء معطف المختبر، والقفازات، ونظارات واقية. <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع فراغ ON، تدفق أداة مع غسل العازلة (الحوض الصغير 3) لمدة 20 ثانية أو حتى تم يستنشق كل حجم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع فراغ ON، رفع أداة الفراغ الى ما بعد 90 درجة عمودي لمدة 5 ثوانى، للسماح لجميع السائل إلى استنزاف للخروج من أداة فراغ. تحويل مضخة OFF، ومحاذاة أداة فراغ مع لوحة رد فعل. أخفض أداة فراغ فيالآبار ويهز بلطف من جانب إلى آخر للافراج عن الخرز في الآبار التي تحتوي على تسلسل التمهيدي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل تنظيف أداة فراغ، تستنهض الهمم تحقيقات مرشح في المياه عالية النقاء (الحوض الصغير 4) لمدة 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل ON فراغ ومسح أداة بالماء عالية النقاء (حوض 5) لمدة 20 ثانية أو حتى تم يستنشق كل حجم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع أداة الفراغ الى ما بعد 90 ° C عمودي لمدة 5 ثوانى، ثم التبديل الفراغ من وتخزينها في موقف &quot;انتظار&quot;. </li></ol> الصلب التمهيدي لتسلسل الحمض النووي مسارات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة رد فعل في حامل لوحة قبل تحسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسخين لوحة على كتلة التدفئة في 80 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة من حامل ووضعت على وصفة طبية لتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li></ol> Pyromark Q24 عملية ملاحظة: شغل أداة باستخدام مفتاح الطاقة الموجود أعلى سلك الطاقة. نجمةكبش يمكن أن يستغرق فترة تصل الى 1 دقيقة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء خرطوشة وفقا للتعليمات الواردة في PyroMark الذهب Q24 الكواشف الدليل (2). لتحديد حجم الحاجة، إعداد ملف تشغيل في البرنامج الصك، وضمن القائمة أدوات اختيار تمهيدي معلومات تشغيل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان الصك بالفعل على، تأكد من أنه لا يؤدون شوط ومن ثم فتح الغطاء. سوف تنبعث إشارة تحذير مسموعة إذا تم فتح الغطاء عندما يكون غير آمن للقيام بذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح باب خرطوشة وأدخل خرطوشة مع التسمية متقابلة إلى الأمام (الشكل 8). تأكد من أن خرطوشة يتم إدراج بشكل صحيح (يجب أن يكون خط مرئي في الجبهة) وإغلاق البوابة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح إطار لوحة (الفيتو) ووضع لوحة مع عينات داخل الصك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق إطار لوحة القابضة وغطاء صك (الشكل 9). </li></ol> بدء التشغيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج عصا USB مع ملف التشغيلق إنشاؤها بواسطة هذه البرامج أداة في منفذ USB في مقدمة الصك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;تشغيل&quot; في القائمة الرئيسية ثم اضغط على &quot;OK&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدم الأسهم التمرير لتحديد ملف التشغيل المطلوب ثم اضغط على &quot;اختيار&quot;. </li></ol> ملاحظة: وسوف تبدأ صك الاستغناء الكواشف عندما يتم التوصل إلى كل الضغوط مسبقا ومستويات درجة الحرارة (قد يستغرق هذا عدة دقائق). خلال شوط، يعرض على الشاشة الصك pyrogram من اختيارها بشكل جيد في الوقت الحقيقي. استخدم الأسهم التمرير لعرض pyrogram من الآبار الأخرى. استكمال تشغيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يؤكد الصك أن يتم الانتهاء من تشغيل وتم حفظ ملف تشغيل إلى عصا USB، اضغط على &quot;إغلاق&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عصا USB. إذا تمت إزالته قبل تشغيل الانتهاء، إدراج عصا USB. حدد &quot;إدارة&quot; ثم &quot;نسخ أشواط غير محفوظ&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن الآن فتح ملف تشغيل وتحليلها باستخدام برنامج الصك ومقارنةإلى مكتبة من الميكروبات المعروفة باستخدام برنامج Identifire. </li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PyroMark PCR Handbook. , (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PyroMark Q24 User Manual. , (2012).</li><li>Elahi, E., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+a+tool+for+DNA+sequencing+analysis.">Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis.</a> Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).</li><li>Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+and+accurate+detection+platform+for+single+nucleotide+polymorphisms.">Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms.</a> Hum. Mutat. 19 (5), 479-485 (2002).</li><li>Langaee, T., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+analyses+by+pyrosequencing.">Genetic variation analyses by pyrosequencing.</a> Mutat. Res. 573 (1-2), 96-102 (2005).</li><li>Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F. D., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+pyrosequencing+reads+suffice+for+accurate+microbial+community+analysis.">Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis.</a> Nucleic Acids Res. 35 (18), e120 (2007).</li><li>Novais, R. C., Thorstenson, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+Pyrosequencing+for+microbiology:+From+genes+to+genomes.">The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes.</a> J. Microbiol. Methods. 86 (1), 1-7 (2011).</li><li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification.">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin. Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li><li>Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T. P., Davenport, R. J., Hall, N., Head, I. M., Read, L. F., Sloan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+microbial+diversity+from+454+pyrosequencing+data.">Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data.</a> Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).</li><li>Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+DNA+sequencing+using+detection+of+pyrophosphate+release.">Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release.</a> Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).</li><li>King, C., Scott-Horton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+A+simple+method+for+accurate+genotyping.">Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping.</a> J. Vis. Exp. (11), e630 (2008).</li><li>Rothberg, J. W., Heinz, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+semi-conductor+device+that+enabling+non-optical+genome+sequencing.">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li><li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zero-Mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations.">Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li><li>Eid, J., Fehr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules.">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li></ol>

وترعى الإنتاج وحرية الوصول إلى هذه المقالة عن طريق QIAGEN. المؤلف أحمد، ديروشير، جيسن وفاردي والعاملين في QIAGEN شركة التي تنتج الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

وقد تم تسويقها القليلة المقبلة أساليب جديدة التسلسل جيل. ثلاثة من أكثر الوسائل المستخدمة على نطاق واسع هي أيون تسلسل أشباه الموصلات، واحدة جزيء الحقيقي التسلسل الوقت، وتسلسل عن طريق التخليق (SBS). 3-11 كل من هذه الطرق يعتمد على التسلسل عن طريق التخليق ولكن توظيف المنصات رواية للكشف عن النيوكليوتيدات يدمج. في أيون أشباه الموصلات التسلسل، ضفيرة واحدة من الحمض النووي بمثابة قالب لحبلا التسلسل. 12 البلمرة والنيوكليوتيدات تضاف بالتتابع كما هو الحال في pyrosequencing. عند إضافة النوكليوتيدات إلى حبلا الحمض النووي المتزايد، ويتم تحريرها أيون الهيدروجين. تم الكشف عن أيون الهيدروجين بواسطة تأثير الترانزستور الاستشعار الميدانية. واحد جزيء الحقيقي التسلسل الوقت يعتمد على وضع دليل موجة صفر (كتبها zmw). كتبها zmw 13 هو بنية صغيرة حيث يتم إرفاق جزيء البلمرة واحدة إلى أسفل البئر. يضيء في مثل هذه الطريقة أن فلورويمكن الكشف عن جزيء رائحة. غير الموسومة كل النوكليوتيدات مع جزيء نيون. كما أدرج النوكليوتيدات الموسومة fluorescently، كاشف يحدد النوكليوتيدات. عندما تتم إضافة النوكليوتيدات المقبل، هو المشقوق جزيء الفلورسنت 14 التسلسل عن طريق التخليق (SBS) يستخدم طريقة فريدة من نوعها لتضخيم الحمض النووي المستهدف بحيث يتم إنشاء مجموعات من متواليات فريدة من نوعها. قوالب 15 الذين تقطعت بهم السبل واحدة يتم إنشاؤها ثم يتم تصنيعه حبلا التكميلية. يتم تصنيف كل النوكليوتيدات مع جزيء الفلورسنت وبعد كل إضافة قاعدة يتم تسجيل مضان من قاعدة المضافة.

Pyrosequencing هو طريقة سريعة ودقيقة لتسلسل الأحماض النووية التي تقوم على مبدأ &quot;التسلسل عن طريق التخليق&quot;. &quot;التسلسل عن طريق التخليق&quot; ينطوي على استخدام قالب DNA ضفيرة واحدة لتجميع حبلا التكميلية قاعدة واحدة في وقت واحد، والكشف عن قاعدة أدرجت (A، T، G، أو C) في كل خطوة من خلال الكشف عن إشارة chemiluminescent. يتضمن رد فعل pyrosequencing الحمض النووي القالب، dNTPs (dATP، dGTP، dTTP، dCTP)، البلمرة DNA، ATP sulfurylase، وسيفيرين، وسيفيراز، وآبيراز. يبدأ رد فعل التوليف عن طريق إضافة واحدة من dNTPs أربعة والبلمرة DNA إلى واحد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي القالب البيروكسيديز. البلمرة DNA يدمج dNTP التكميلية على القالب، مع الافراج اللاحقة من بيروفوسفات (الشكل 1). ATP sulfurylase يحول نسبيا في بيروفسفات إلى ATP. ATP يعمل كمحفز لتحويل وسيفيراز بوساطة من وسيفيرين إلى oxyluciferin، التييولد ضوء (الشكل 2). شدة الضوء يتناسب مع عدد من النيوكليوتيدات أدرجت ويحدد ما إذا كان هو واحد أو أكثر dNTP معينة (dATP، dTTP، dGTP، أو dCTP) موجودة على حبلا قالب بالتسلسل (الشكل 3). أي dNTP الفردية هي التي تدهورت بفعل آبيراز قبل اضافة dNTP المقبل لاستمرار رد فعل التوليف. ويتكرر هذا &quot;التسلسل عن طريق التخليق&quot; رد فعل مع اضافة كل من dNTPs أربعة حتى يتم تحديد تسلسل الحمض النووي من القالب الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد. لعرض الرسوم المتحركة للتفاعل pyrosequencing <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405movie1.mov" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة الفيلم</a> .

<table border=1>
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark PCR Master Mix, 2x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoralLoad Concentrate, 10x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Q-Solution, 5x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2, 25 mM</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase-Free Water</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>129112</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978776 or 978777</td>
 <td>Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 &mu;M.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pyromark Gold Q24 Reagents</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>970802</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-purity water (Milli-Q 18.2 M&Omega; x cm or equivalent)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin Sepharose High Performance Beads</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>17-5113-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Annealing Buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Denaturation Solution</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Wash Buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9001514</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Cartridge</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979202</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q96 HS Tip Holder Box</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979105</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Vacuum Workstation</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9001516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Plate Holder</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9022273</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Orbital shaker</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>11-675-297</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heat block</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>11-718Q</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

pyrosequencing for microbial identification and characterization

Pyrosequencing هي تقنية متعددة الاستخدامات التي تسهل تسلسل الجينوم الميكروبي التي يمكن استخدامها لتحديد الأنواع البكتيرية، تميز السلالات البكتيرية وكشف الطفرات الجينية التي تمنح مقاومة العوامل المضادة للميكروبات. وتشمل مزايا pyrosequencing لتطبيقات علم الأحياء الدقيقة سريعة وموثوقة الفرز الفائق الإنتاجية وتحديد دقيق للميكروبات والطفرات الجينية الميكروبية. Pyrosequencing ينطوي على تسلسل الحمض النووي عن طريق تجميع حبلا التكميلية قاعدة واحدة في وقت واحد، مع تحديد كائن النوكليوتيدات محددة أدرجت خلال رد فعل التوليف. يحدث رد فعل على يجمد واحد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي القالب حيث يتم إضافة ريبوزية أربعة (dNTP) بالتسلسل وdNTPs الفردية هي المتدهورة إنزيمي قبل اضافة dNTP بجانب رد فعل التوليف. ويتم رصد الكشف عن قاعدة محددة دمجها في قالب من قبل جيل من chemilumإشارات inescent. ترتيب dNTPs التي تنتج الإشارات chemiluminescent يحدد تسلسل الحمض النووي للقالب. القدرة التسلسل في الوقت الحقيقي التكنولوجيا pyrosequencing يمكن تعريف الميكروبي السريع في فحص واحد. وبالإضافة إلى ذلك، الصك pyrosequencing، يمكن تحليل التنوع الجيني الكامل لمكافحة الجراثيم المقاومة للأدوية، بما في ذلك كتابة من تعدد الأشكال، والطفرات نقطة، الإدراج، والحذف، وكذلك الكمي من نسخ الجينات المتعددة التي قد تحدث في بعض المقاومة المضادة للميكروبات أنماط.

نتائج شوط pyrosequencing نموذجي باستخدام برنامج يظهر الموقع من الاشعال إلى الأمام وعكس تستخدم لتوليد AMPLICON، والتمهيدي التسلسل تستخدم للتفاعل pyrosequencing داخل 16S الحفظ تسلسل الريباسي (الشكل 10). تسلسل hypervariable بين التمهيدي مواقع يسمح لتحديد البكتيريا من عدد كبير من الأنواع البكتيرية باستخدام التمهيدي تسلسل الحفظ (5&#39;-TACATGCAAGTCGA). باعتبارها مراقبة الجودة الداخلية، وتسلسل الحمض النووي بين أقواس المنطقة متغير ويمكن التحقق من أن أؤكد أن المنطقة DNA الصحيح وقد تم تحليلها . البرنامج pyrosequencing يسمح للمقارنة ومحاذاة تسلسل ولدت لقاعدة بيانات داخلية من تسلسل الريباسي البكتيرية لتحديد البكتيريا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحليل تسلسل لتحديد الطفرات التي تمنح المضادات الحيوية المقاومة للأدوية. على سبيل المثال، تحليل الطفرات في الجينات 23S الريباسي من Helicobيوضح بيلوري acter نمطين الطفرة (غا أو AGA) التي تمنح المقاومة للمضادات الحيوية (الشكل 11). تحليل عزلات متعددة من نفس المريض يمكن أن يعاير في وقت واحد لتتبع ظهور المقاومة للأدوية على مر الزمن للمساعدة في التحقيقات الوبائية لانتشار الجراثيم المقاومة للأدوية. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig1.jpg" /> الشكل 1. يتم استخدام المنتج PCR البيروكسيديز كقالب لدمج dNTPs بواسطة البلمرة DNA، مما يؤدي إلى توليد بيروفوسفات (نقطة في البوصة). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig2.jpg" /> الشكل 2. ATP sulfurylase يحول نسبيا بيروفسفات إلى ATP. أعمال ATP كمحفز لتحويل وسيفيراز بوساطة من وسيفيرين إلى oxyluciferin، الذي يولد الضوء الذي هو برو<html> portional لكمية من ATP. يتم تسجيل النور كما الذروة على تتبع pyrogram ويشير إلى إدماج النوكليوتيدات. وdNTPs الفردية هي التي تدهورت بفعل آبيراز قبل إضافة dNTP المقبل لمواصلة عملية التجميع. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig3.jpg" /> الشكل (3). شدة الضوء ولدت يشير إلى ما إذا تأسست واحد أو أكثر dNTP معينة (dATP، dTTP، dGTP، أو dCTP) على قالب حبلا بالتتابع. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig4.jpg" /> الشكل 4. الرسم البياني لإعداد مزيج الرئيسي لشل حركة المنتج PCR البيروكسيديز. <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig5.jpg" /><html> GE = &quot;دائما&quot;&gt; الشكل 5. PyroMark محطة العمل، مع PCR لوحة، لوحة PyroMark، والمواقع الحوض الصغير. <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig6.jpg" /> الشكل (6). مواقع التبديل فراغ ON OFF والمواقف. <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig7.jpg" /> الرقم 7. أداة فراغ. التعامل الصحيح مع أداة فراغ. <img alt="الرقم 8" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig8.jpg" /> الرقم 8. فتح باب خرطوشة مع خرطوشة في مكانها. <img alt="الرقم 9" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig9.jpg" /> الشكل 9. خرطوشة إدخالها بشكل صحيح مع البوابة مغلقة. &quot;FO: المحافظة على together.within الصفحات =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الرقم 10" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig10.jpg" /> الشكل 10. Pyrosequencing نتائج تحديد البكتيريا القائم. صممت الاشعال PCR للمناطق المحمية من القالب الحمض النووي، ويتم وضع تسلسل التمهيدي فورا المنبع من A-تتميز كذلك تحديد تسلسل الحمض النووي hypervariable داخل AMPLICON (كما هو موضح باللون الأزرق). <img alt="الرقم 11" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig11.jpg"/> الشكل 11. الكشف عن المضادات الحيوية المقاومة للأدوية في هيليكوباكتر بيلوري باستخدام pyrosequencing. تحليل الطفرات في الجينات 23S التي تمنح مقاومة للجراثيم في هيليكوباكتر بيلوري التي تحتوي على غا أو متواليات AGA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405fig11large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr> &lt;TD&gt; مكون </td><td> حجم في رد الفعل </td><td> تركيز النهائي </td></tr><tr><td> بايرو PCR ماجستير ميكس، 2X </td><td> 12.5 ميكرولتر </td><td> 1X </td></tr><tr><td> مركزات CoralLoad، 10X </td><td> 2.5 ميكرولتر </td><td> 1X </td></tr><tr><td> 25 ملي MgCl 2 (اختياري) </td><td> متغير </td><td> ≥ 1.5 ملم </td></tr><tr><td> Q-الحل، 5X (اختياري) </td><td> 5 ميكرولتر </td><td> 1X </td></tr><tr><td> التمهيدي A / B التمهيدي </td><td> متغير / متغير </td><td> 0.2 ميكرومتر μM/0.2 </td></tr><tr><td> الماء ريبونوكلياز خالية </td><td> متغير </td><td> - </td></tr><tr><td> اجمالى حجم التداول (بعد إضافة الحمض النووي القالب) </td><td> 25 ميكرولتر </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 1. PCR تفاعل الخليط. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> &amp; NBSP؛ </td><td></td><td> تعليقات إضافية </td></tr><tr><td> الخطوة الأولي تفعيل PCR </td><td> 15 دقيقة </td><td> 95 ° C </td><td> يتم تنشيط HotStartTaq الحمض النووي البلمرة </td></tr><tr><td> 3 الخطوة الدراجات: تمسخ </td><td> 30 ثانية </td><td> 94 ° C </td><td></td></tr><tr><td> الصلب </td><td> 30 ثانية </td><td> 60 ° C 56 ° C </td><td> لالحمض النووي الجيني لبيسلفيت الحمض النووي تحويلها </td></tr><tr><td> تمديد </td><td> 30 ثانية </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr><tr><td> عدد دورات </td><td> 45 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> التمديد النهائي </td><td> 10 دقيقة </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 2. PCR دورة المواصفات.

Watch this Scientific Journal Video about Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization at JoVE.com

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing هي تقنية متعددة الاستخدامات التي تسهل تسلسل الجينوم الميكروبي التي يمكن استخدامها لتحديد الأنواع البكتيرية، تميز السلالات البكتيرية، والكشف عن الطفرات الوراثية التي تمنح مقاومة العوامل المضادة للميكروبات. في هذا الفيديو، سيظهر الإجراء لتوليد الميكروبية AMPLICON، AMPLICON pyrosequencing، وتحليل تسلسل الحمض النووي.

Pyrosequencing لتحديد وتوصيف الميكروبية

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

pyrosequencing-for-microbial-identification-and-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

46.8K Views.  Johns Hopkins University. Pyrosequencing هي تقنية متعددة الاستخدامات التي تسهل تسلسل الجينوم الميكروبي التي يمكن استخدامها لتحديد الأنواع البكتيرية، تميز السلالات البكتيرية، والكشف عن الطفرات الوراثية التي تمنح مقاومة العوامل المضادة للميكروبات. في هذا الفيديو، سيظهر الإجراء لتوليد الميكر...

Video: Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

المجتمعات الميكروبية في الطبيعة ومختبر -- مقابلة

Biology of Microbial Communities  - Interview

بيولوجيا المجتمعات الميكروبية -- مقابلة

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing : طريقة بسيطة لالتنميط الجيني دقيقة

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

تحديد وتوصيف ارتباط بالغليكوزيل باستخدام بروتين معين إندو وexoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

استخدام الكيموستات في الميكروبية بيولوجيا الأنظمة

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

عزل المناطق الجينوم محددة وتحديد أسوشيتد الجزيئات التي enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in understanding the gene regulation and spatiotemporal expression patterns of target genes. On the other hand, it is also critical to establish promoter evaluation tools and genetic transformation techniques that are fast, efficient, and reproducible. In this study, we investigated the spatiotemporal expression pattern of the rhizobial symbiosis-specific nodule inception (NIN) promoter of Phaseolus vulgaris in the transgenic hairy roots. Using plant genome databases and analysis tools we identified, isolated, and cloned the P. vulgaris NIN promoter in a transcriptional fusion to the chimeric reporter &#946;-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Further, this protocol describes a rapid and versatile system of genetic transformation in the P. vulgaris using Agrobacterium rhizogenes induced hairy roots. This system generates &#8805;2 cm hairy roots at 10 to 12 days after transformation. Next, we assessed the spatiotemporal expression of NIN promoter in Rhizobium inoculated hairy roots at periodic intervals of post-inoculation. Our results depicted by GUS activity show that the NIN promoter was active during the process of nodulation. Together, the present protocol demonstrates how to identify, isolate, clone, and characterize a plant promoter in the common bean hairy roots. Moreover, this protocol is easy to use in non-specialized laboratories.

Promoter expression analyses are crucial to improving the understanding of gene regulation and the spatiotemporal expression of target genes. Herein we present a protocol to identify, isolate, and clone a plant promoter. Further, we describe the characterization of the nodule-specific promoter in the common bean hairy roots.

نبات مروج التحليل: تحديد وتوصيف للعقيدات الجذرية المروج محددة في الفول المشتركة

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

بروتوكول المصحوبة بمرشدين لتوصيف الجراثيم البراز بتسلسل الرنا الريباسي-Amplicon 16S

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in muscle homeostasis, injury, and repair. Current protocols for FAPs identification and isolation use flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS) and studies evaluating their function in vivo to date have been undertaken exclusively in mice. The larger inherent size of the rat allows for a more comprehensive analysis of FAPs in skeletal muscle injury models, especially in severely atrophic muscle or when investigators require substantial tissue mass to conduct multiple downstream assays. The rat additionally provides a larger selection of muscle functional assays that do not require animal sedation or sacrifice, thus minimizing morbidity and animal use by enabling serial assessments. The flow cytometry/FACS protocols optimized for mice are species specific, notably restricted by the characteristics of commercially available antibodies. They have not been optimized for separating FAPs from rat or highly fibrotic muscle. A flow cytometry/FACS protocol for the identification and isolation of FAPs and MPs from both healthy and denervated rat skeletal muscle was developed, relying on the differential expression of surface markers CD31, CD45, Sca-1, and VCAM-1. As rat-specific, flow cytometry-validated primary antibodies are severely limited, in-house conjugation of the antibody targeting Sca-1 was performed. Using this protocol, successful Sca-1 conjugation was confirmed, and flow cytometric identification of FAPs and MPs was validated by cell culture and immunostaining of FACS-isolated FAPs and MPs. Finally, we report a novel FAPs time-course in a prolonged (14 week) rat denervation model. This method provides the investigators the ability to study FAPs in a novel animal model.

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

This protocol outlines a method to isolate Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) from rat skeletal muscle. Utilization of the rat in muscle injury models provides increased tissue availability from atrophic muscle for the analysis and a larger repertoire of validated methods to assess muscle strength and gait in free-moving animals.

تحديد وعزل وتوصيف السلف الليفية الشحمية (FAPs) والذرى العضلية المنشأ (أعضاء البرلمان) في العضلات الهيكلية في الجرذ

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs that are formed via back-splicing. These circRNAs are predominantly studied for their roles as regulators of various biological processes. Notably, emerging evidence demonstrates that host circRNAs can be differentially expressed (DE) upon infection with&#160;pathogens (e.g., influenza and coronaviruses), suggesting a role for circRNAs in regulating host innate immune responses. However, investigations on the role of circRNAs during pathogenic infections are limited by the knowledge and skills required to carry out the necessary bioinformatic analysis to identify DE circRNAs from RNA sequencing (RNA-seq) data. Bioinformatics prediction and identification of circRNAs is crucial before any verification, and functional studies using costly and time-consuming wet-lab techniques. To solve this issue, a step-by-step protocol of in silico prediction and characterization of circRNAs using RNA-seq data is provided in this manuscript. The protocol can be divided into four steps: 1) Prediction and quantification of DE circRNAs via the CIRIquant pipeline; 2) Annotation via circBase and characterization of DE circRNAs; 3) CircRNA-miRNA interaction prediction through Circr pipeline; 4) functional enrichment analysis of circRNA parental genes using Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). This pipeline will be useful in driving future in vitro and in vivo research to further unravel the role of circRNAs in host-pathogen interactions.

In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions

The protocol submitted here explains the complete in silico pipeline needed to predict and functionally characterize circRNAs from RNA-sequencing transcriptome data studying host-pathogen interactions.

في سيليكو تحديد وتوصيف الحمض النووي الريبي السيرك أثناء التفاعلات بين المضيف والممرض

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs that are formed via back-splicing. These circRNAs are predominantly studied for their roles as ...