وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من إدارة تقنية جنوب ولاية تكساس (POCrr 2009.041)، ومعهد للتكامل الطب والعلوم من المركز الوطني للبحوث الموارد (UL 1RR025767)، و من المعهد الوطني لأبحاث طب الأسنان والجمجمة ( 5R21DE017294).

1. إعداد الشرائح Functionalized <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شرائح المجهر في رفوف الشريحة القابلة للإزالة، ويغسل مرتين من تخبط في وعاء يحتوي على تلطيخ الايثانول 99٪ (الصف النسيجية). مسح الشرائح تنظيف استخدام المناديل الورقية (لضمان عدم تولد الغبار ورقة)، والجاف باستخدام طائرة من غاز النيتروجين المضغوط. </li></ol> ملاحظة: لا تستخدم كيم المسحات لمسح الشرائح كما من شأنه أن يولد غرامة الغبار ورقة. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج رف الشريحة التي تحتوي على الشرائح في وعاء مليء تلطيخ حامض الكبريتيك المركز واحتضانها في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. </li></ol> ملاحظة: لتجنب ملامسة الجلد، واستخدام مقاومة للمواد الكيميائية والقفازات ونظارات السلامة أثناء العمل مع الأحماض والمواد الكيميائية السامة والمسببة للتآكل. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن الشرائح لمدة 30 دقيقة، ويغسل مع ميلي-Q (18 MΩ) الماء لمدة 30 دقيقة، مع متابعة آخر يغسل فيcetone لمدة 5 دقائق. هذا العلاج يعرض مجموعات silanol على سطح الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف الشرائح نظيفة مع 2.5٪ (المجلد / المجلد في الماء) من aminopropyltriethoxysilane-3 (APTES) حل، بغمر رف الشريحة في APTES لمدة 30 دقيقة، والغسيل 3 مرات في الملة-Q الماء لمدة 15 دقيقة كل الغسيل، والخبز الشرائح في الفرن على 110 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. الخبز يسمح عبر الربط بين APTES، مما أدى إلى-functionalization-NH2 من السطح. </li></ol> ملاحظة: تحقق الحل APTES في وعاء من البلاستيك منذ الودائع APTES تفضيلي على جدران إناء زجاجي. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام تدور المغطي، معطف الشرائح مع 1٪ (وزن / المجلد في التولوين) البوليستيرين-CO-هيدرازيد الاندريد (PS-MA) (سيجما) للتوصل إلى أحادية طبقة من طلاء مسعور 6. إضافة 2.0 مل من PS-MA على شريحة زجاجية نظيفة شنت على المغطي تدور ومعطف في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ق. قد تختلف هذه الشروط على معايير طلاء تدور مثل طلاء لذلكlution، الركيزة، سمك الطلاء والتي تحكمها المعادلة التالية (7) </li></ol><img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/3845/3845eq1.jpg" /> حيث ح هو سمك طلاء الفيلم، والبريد هو معدل التبخر، η، C و ρ هي اللزوجة، والتركيز والكثافة من الحل طلاء، على التوالي، وω هي السرعة الزاوية. ويوصى التولوين هو ضار عند استنشاقه لفترة طويلة واستخدام غطاء الدخان: ملاحظة. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تخزين الشرائح في رف الشريحة لمدة تصل الى شهر واحد في ظروف جافة خالية من الغبار، في 2-8 درجة مئوية. </li></ol> 2. إعداد قائح الخميرة وتغليف الكولاجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد الثقافة بين عشية وضحاها من C. المبيضة البيضاء سلالة SC5314، في البيبتون خميرة سكر العنب [YPD، و 10 جرام / لتر خلاصة الخميرة، و 20 البيبتون غ / ل و 20 الدكستروز غ / ل] المتوسطة السائل، فحقن مستعمرة واحدة من C. آلbicans إلى 10-20 مل من YPD 8. احتضان الثقافة في شاكر المداري (حوالي 150-200 دورة في الدقيقة) حتى 30 درجة مئوية خلال الليل. مخزنة حصاد 1 مل خميرة المبيضة البيضاء الخلايا المبيضات من ثقافات YPD بين عشية وضحاها (بواسطة الطرد المركزي عند 5000 دورة في الدقيقة لمدة 5-10 دقائق)، وغسل مرتين لمدة 10 دقيقة في 1 مل من الفوسفات العقيمة المالحة (PBS، و 10 العازلة الفوسفات مم، 2.7 ملي مول كلوريد البوتاسيوم، 137 ملم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4) (سيجما) للغسيل. غسلت حصاد الخلايا أيضا بواسطة الطرد المركزي في 1900 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. Resuspend الخلايا غسلها في 1 العازلة إعادة الإعمار مل (0.2 محلول هيدروكسيد الصوديوم N مع بيكربونات الصوديوم 2.2٪ (وزن / المجلد) و 4.8٪ (وزن / المجلد) HEPES، ودرجة الحموضة 7.2). </li></ol> ملاحظة: C. المبيضة البيضاء هي 1/BSL1 مجموعة الكائنات الحية الدقيقة المخاطر. تذكر دائما إلى حسن استخدام تقنيات التطهير / معقم للعمل مع هذه الكائنات الحية الدقيقة واتباع الإجراءات المؤسسية في مجال التخلص السليم من المواد biohazardous. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام hemocytometer على مجهر حقل مشرق والتكيف مع كثافة خلية من 5 × 10 7 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخفيف مزيد من التعليق عشر مرات من قبل اضافة 10 × RPMI-1640 تستكمل مع الجلوتامين-L ومخزنة مع morpholinepropanesulfonic (اجتماعات الأطراف) حامض (درجة الحموضة 7.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغليف خلايا الخميرة في الكولاجين عن طريق خلط تعليق خلية في RPMI-1640 مع الكولاجين (1.8 ملغ / مل) (نوع 1 من ذيل فأر، العلوم البيولوجية دينار بحريني، بيدفورد، ماجستير)، للحصول على تركيز نهائي من 4 × 10 6 خلية / مل. الحفاظ على تعليق الكولاجين خلية على الجليد لمنع دبق الكولاجين قبل الطباعة. </li></ol> 3. إعداد BChip كاليفورنيا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف وتطهير جميع الأسطح من microarrayer، بما في ذلك غسل لوحة مصدر، محطة ومحطة فراغ، فراغ طبق من الشرائح وغرفة الطباعة، من قبل القضاء مع 70٪ الأيزوبروبانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتضع عقد من فراغ العدد المرغوب فيه من الشرائح الزجاجية PS-MA-المغلفة على سطح الشريحة من هيئة التصنيع العسكريroarrayer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة تعليق خلية في الكولاجين بقوة ونضح 100 ميكرولتر من تعليق الجيدة الخلط في بئر من لوحة 96-جيدا، فقط قبل الطباعة. وضع هذه اللوحة مصدر في محطة التحميل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على مرطب للحفاظ على الرطوبة النسبية 100٪ في غرفة ميكروأري في جميع مراحل عملية الطباعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طباعة 50 NL من تعليق خلية في مجموعة من 48 الصفوف والأعمدة 16 مع وجود بقع متباعدة 1.2 مم وبصرف النظر باستخدام نصاب ميكروأري (Omnigrid مايكرو، Digilab شركة، Holliston، MA) من غير اتصال ترسيب باستخدام مدبب بشكل مخروطي فوهة ميكرومتر نصائح السيراميك 190 (Digilab). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رئيس الوزراء، شطف وفراغ الجافة النصائح مرتين بعد كل جولة من الطباعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد الطباعة، ضع الشريحة في غرفة، محكمة الغلق مرطب (كاسيت التهجين، ArrayIt شركة، سانيفيل كاليفورنيا)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة للسماح لتشكيل بيوفيلم. </li></ol> 4. اختبارات الحساسية للعلاقات العامةالأغشية الحيوية eformed BChip في كاليفورنيا ضد وكلاء مضاد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من الحلول الأوراق المالية أو مسحوق من الأدوية المضادة للفطور، وإعداد العاملين في التوصل إلى حل وسط-1640 RPMI. التركيزات القصوى نموذجي من الحل تعمل على 1024 ميكروغرام / مل لفلوكونازول و 16 ميكروغرام / مل لالأمفوتريسين B 5. ويمكن استخدام تركيزات أخرى عن وكلاء مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 8 إعداد تركيزات مختلفة من مركب من تمييع الحل الأوراق المالية في شقين التخفيفات، تغطي مجموعة مع IC يقدر بنحو 50 لمجمع في وسطه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة من نمو بيوفيلم، استخدم microarrayer لطباعة 50 NL ثمانية تركيزات مختلفة من الأدوية، إلى جانب إيجابي (أي خلايا أي دواء في وسائل الاعلام فقط) والسلبية (تعامل مع هيبوكلوريت الصوديوم لمدة 20 دقيقة) وعناصر التحكم، في ما لا يقل عن 6 مكررات على أعلى من الأغشية الحيوية. </li></ol> ملاحظة: المحافظة على الرطوبة النسبية 100٪ لمنع تجفيف من البقع في حين الوظيفةجى المخدرات. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة وجيزة واضاف ان المخدرات، واحتضان الشريحة مع المخدرات في غرفة مرطب على 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل المخدرات قبالة عن طريق التغميس في CaBChip 3-5 مرات لمدة 2 دقيقة في كل مرة في برنامج تلفزيوني وصمة عار من احتضان BChip الكالسيوم مع 0.5 ميكرومتر FUN1 عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل وصمة عار قبالة عن طريق التغميس في BChip الكالسيوم 3-5 مرات في برنامج تلفزيوني لمدة دقيقة كل 1-3 دونك، وتجفيف BChip كاليفورنيا باستخدام تيار النيتروجين. قراءة كثافة مضان باستخدام ماسح ضوئي ميكروأري (GenePix 4100A، أكسون الآلات، كاليفورنيا) في الطول الموجي من 532 نانومتر مع زيادة PMT من 380. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين كثافة مضان من السيطرة الايجابية (لا للمخدرات) وميت (مبيض المعالجة) البقع بيوفيلم بنسبة 100٪ و 0٪، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد نسبة تثبيط بواسطة الانخفاض في كثافة مضان (F) وفقا لمتوسط ​​من النقاط للسيطرة على استخدام المعادلة التالية </li></ol><img alt="المعادلة 2" src="/files/ftp_upload/3845/3845eq2.jpg" /> حيث F، F ماكس وفهرنهايت هي كثافة مضان الخام من معاملة المخدرات، ومكافحة المخدرات وعدم تبييض البقع المعالجة، على التوالي. تم تعديل إعدادات الماسح الضوئي للحصول على أقصى F و F يا من 30000 و 4000 RFU، على التوالي. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب تركيز 50٪ أو المثبطة IC 50 بحلول تركيب تل منحدر متغير باستخدام معادلة GraphPad برامج بريزم (لا جولا، كاليفورنيا). </li></ol> 5. ممثل النتائج مرجع مصدق ممثل BChip، التي تتألف من 48 × 16 مجموعة من النانو الأغشية الحيوية من C. ويرد المبيضة البيضاء، في الشكل 2. في مجال مشرق المجهري يظهر ميزة الشاملة المعماري للنانو بيوفيلم. لمسح الصور المجهرية الإلكترون من العرض بيوفيلم التي هي جزء لا يتجزأ من خيوط فطرية داخل مصفوفةألياف الكولاجين، والتي هي حوالي 2 ميكرومتر و 100 نانومتر في القطر، على التوالي. الماسح الضوئي ميكروأري FUN1 الملطخة تظهر الصور الخميرة وأشكال خوطي، التي هي سمة من الأغشية الحيوية الفطرية. ويمكن رؤية هذه الصور 2D و 3D-مبائر ومضان من FUN1 الملطخة الأغشية الحيوية لديها التنوع المكاني، مع مناطق من خلايا نشطة تتخللها عملية الأيض داخل المصفوفة خارج الخلية (التي تتألف من الكولاجين كمادة التغليف، وعلى الأرجح أيضا من المواد التي تنتجها exopolymeric خلايا بيوفيلم)، والذي لم تلطخ بواسطة الصبغة الأيض. وقدرت سماكة بيوفيلم أن يكون ما يقرب من 50 ميكرون. تم استخدام BChip كاليفورنيا لتقدير قابلية مضاد للعقارين، فلوكونازول وباء الامفوتريسين، وتظهر النتائج في الشكل (3). يتفق مع تقارير نشرت على مستوى صناعة المقايسات لوحة 96-جيدا، والأغشية الحيوية هي مقاومة ضد فلوكونازول (10) وجيم محسوب 50 لل<html> الأمفوتريسين B هو 0.3 ميكروغرام / مل 11. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3845/3845fig1.jpg" /> الرسم البياني رقم التدفق 1. لصنع BChip الكالسيوم. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3845/3845fig2.jpg" /> الشكل 2. صورة لBChip الكالسيوم عالية thoughput، وطبع باستخدام microarrayer الروبوتية والتي تحتوي على 768 نقاط في PS-MA-المغلفة الشرائح. كل بقعة نصف كروي هو 50 NL في الحجم، وحوالي 700 ميكرون في القطر، مع وجود انفصال بين 1،2 ملم البقع. أظهرت أيضا (في اتجاه عقارب الساعة) هي المجهر الضوئي، وماسحة ضوئية ميكروأري، الفحص المجهري 2D، 3D والتألق، ومسح الصور المجهر الإلكتروني من الأغشية الحيوية الفردية على BChip الكالسيوم. الشكل ووزارة شؤون المرأة في التكبير عالية من 25000 س يظهر الخيط خوطي من 2 ميكرومتر عرض. الشكل 3 &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/3845/3845fig3.jpg &quot;/&gt; الشكل 3. نتائج اختبار الحساسية للأدوية المضادة للفطريات، وتحديد القيم 50 IC: (أ) فلوكونازول و (ب) B الأمفوتريسين باستخدام الكالسيوم BChip. تظهر الصور مضان المجهر من الأغشية الحيوية B-المعالجة الأمفوتريسين في (C). فإن النتائج هي متوسط ​​± الخطأ المعياري يعني لاثنين من رقائق منفصلة تحتوي على 10 مكررات لكل حالة.

<ol>
	<li>Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+United+States+hospitals:+a+three-year+analysis.">Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis.</a> Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).</li><li>Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+multidrug+efflux+pumps+in+relation+to+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans+biofilms.">Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms.</a> J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).</li><li>Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Throughput+Candida+albicans+Biofilm+Chip.">Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip.</a> PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).</li><li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li><li>Pierce, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reproducible+96-well+plate-based+method+for+the+formation+of+fungal+biofilms+and+its+application+to+antifungal+susceptibility+testing.">A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing.</a> Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).</li><li>Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cellular+microarray+for+high-throughput+toxicology+assays.">Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).</li><li>Meyerhofer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+resist+films+produced+by+spinning.">Characteristics of resist films produced by spinning.</a> Journal of Applied Physics. 49, (1978).</li><li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms.">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li><li>Chandra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+by+the+fungal+pathogen+Candida+albicans:+Development,+architecture,+and+drug+resistance.">Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).</li><li>Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+biofilms+and+drug+resistance.">Fungal biofilms and drug resistance.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).</li><li>Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+activity+of+amphotericin+B,+caspofungin+and+posaconazole+on+Candida+albicans+biofilms+in+intermediate+and+mature+development+phases.">Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases.</a> Mycoses. 53, 208-214 (2010).</li></ol>

خوسيه لوبيز L. ريبوت وأناند الأسهم Ramasubramanian K. الخاصة في شركة MicrobeHTS، والتكنولوجيات، التي تقوم بتطوير وكلاء مضاد للفطريات. قدمت MicrobeHTS تكنولوجيز، شركة أي دعم مالي لهذه الدراسات.

وقد وضعنا خلية مقرها عالية الكثافة ميكروأري]، كاليفورنيا BChip، ويتألف من وحدات التخزين نانولتر من الأغشية الحيوية المبيضات البيض. تم طباعة ميكروأري على تعديل ركائز الزجاج، والذي سمح لمرفق قوي من بقع جل الكولاجين في الوقت الذي توفر hydrophobicity اللازمة للمادة هل?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 440140 </td></tr><tr><td> البوليسترين-CO-هيدرازيد الاندريد (PS-MA) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 426946 </td></tr><tr><td> الشرائح الزجاجية المجهر </td><td> فيشر العلمية </td><td> 12-549-3 </td></tr><tr><td> نوع الفئران الكولاجين الذيل أنا </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> الروبوتية Microarrayer </td><td> Omnigrid مايكرو </td><td> MICROSYS4000/4100A </td></tr><tr><td> [ميكروأري] ماسحة </td><td> Genepix الشخصية 4100A </td><td> GENEPIX4100A </td></tr><tr><td> تهجين كاسيت </td><td> ArrayIt شركة </td><td> AHCXD </td></tr><tr><td> FUN1 [2-chloRO-4-(2،3-ثنائي هيدرو-3-الميثيل (بنزو -1،3-thiazol-2-YL)-methylidene)-1-فينيل quinoliniumiodide] </td><td> إينفيتروجن كورب </td><td> F-7030 </td></tr><tr><td> فلوكونازول </td><td> Sicor أدوية، وشركة </td><td> J02AC01 </td></tr><tr><td> الأمفوتريسين B </td><td> سيغما </td><td> A2411 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> Mediatech، المؤتمر الوطني العراقي. </td><td> 50-020-PC </td></tr><tr><td> السيراميك فوهة نصيحة ميكرون 190 </td><td> Digilab </td><td> 60020441-00 </td></tr><tr><td> GraphPad برامج بريزم </td><td> GraphPad البرمجيات، المؤتمر الوطني العراقي. </td><td></td></tr><tr><td> Genepix برو v4.1 لل </td><td> الجزيئية الأجهزة </td><td></td></tr></tbody></table>

candida albicans biofilm chip (cabchip) for high-throughput antifungal drug screening

المبيضات البيض يبقى العامل الرئيسي المسبب لداء المبيضات، والتي تمثل في الوقت الراهن رابع أكثر شيوعا عدوى المستشفيات مجرى الدم في مستشفيات الولايات المتحدة 1. هذه العدوى الانتهازية تشكل تهديدا متزايدا بالنسبة لعدد متزايد من الأفراد للخطر، وتحمل معدلات وفيات مرتفعة بشكل غير مقبول. هذا ويرجع ذلك جزئيا إلى ترسانة محدودة من الأدوية المضادة للفطريات، ولكن أيضا إلى ظهور مقاومة ضد وكلاء ومضاد للفطريات الأكثر شيوعا. يزيد من تعقيد العلاج هو حقيقة أن ترتبط غالبية مظاهر المبيضات مع تشكيل الأغشية الحيوية، وخلايا داخل هذه الأغشية الحيوية تظهر زيادة مستويات المقاومة للمضادات الفطور معظم سريريا المستخدمة 2. نحن هنا وصف وضع ميكروأري عالية الكثافة التي تتكون من C. المبيضة البيضاء نانو الأغشية الحيوية، والتي قمنا اسمه كا BChip 3. لفترة وجيزة، يتم استخدام microarrayer الروبوتية تيس خلايا الخميرة الطباعة من C. المبيضة البيضاء على ركيزة صلبة. أثناء الطباعة، يتم تضمين خلايا الخميرة في مصفوفة ثلاثية الأبعاد باستخدام حجم ما يصل الى 50 NL ويجمد على ركيزة الزجاج بطلاء مناسب. بعد الطباعة الأولية، وحضنت الشرائح على 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة للسماح للتنمية بيوفيلم. خلال هذه الفترة بقع تنمو لتصبح كاملة النمو &quot;نانو الأغشية الحيوية&quot; الذي عرض نموذجي الخصائص الهيكلية والمظهري المرتبطة جيم ناضجة المبيضة البيضاء الأغشية الحيوية (أي تعقيد الصرفية، وثلاثة الأبعاد والهندسة المعمارية المقاومة للأدوية) 4. وبشكل عام، يتكون BChip الكالسيوم من الأغشية الحيوية ما يعادل 750 ~ ومميزة مكانيا، مع ميزة إضافية التي يمكن طباعتها رقائق متعددة ومعالجتها في وقت واحد. ويقدر بقاء الخلية عن طريق قياس كثافة فلوري من FUN1 التمثيل الغذائي وصمة باستخدام ماسح ضوئي ميكروأري. يعتبر مثاليا هذه الشريحة الفطرية لأجلك ..سراج الدين في الفرز الفائق الإنتاجية الحقيقية لاكتشاف الأدوية المضادة للفطريات. بالمقارنة مع المعايير الحالية (أي لوحة microtiter 96-جيدا نموذج من تشكيل بيوفيلم 5)، والمزايا الرئيسية للرقاقة بيوفيلم الفطرية والتشغيل الآلي، والتصغير، وفورات في حجم وتكاليف الكواشف ووقت التحليلات، فضلا عن القضاء على عمل خطوات مكثفة. ونحن نعتقد أن مثل هذه رقاقة تسريع كبيرة في اكتشاف دواء مضاد للفطريات عملية.

Watch this Scientific Journal Video about Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening at JoVE.com

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

وقد وضعنا برنامجا ميكروأري عالية الكثافة التي تتألف من 3D نانو الأغشية الحيوية من<em&gt; C. المبيضة البيضاء</em&gt; دعا<em&gt; كاليفورنيا</em&gt; BChip. ملف حساسية من الأدوية اختبار على<em&gt; كاليفورنيا</em&gt; BChip هو مشابه للنموذج التقليدي لوحة 96-جيد، مما يوحي بأن يعتبر مثاليا للرقاقة الفطرية للفحص عالية الإنتاجية الحقيقية من الأدوية المضادة للفطريات.

المبيضات البيض بيوفيلم رقاقة (كاليفورنيا BChip) لالفرز الفائق الإنتاجية مضاد للمخدرات

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

candida-albicans-biofilm-chip-cabchip-for-high-throughput-antifungal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

13.6K Views.  University of Texas at San Antonio. وقد وضعنا برنامجا ميكروأري عالية الكثافة التي تتألف من 3D نانو الأغشية الحيوية من C. المبيضة البيضاء دعا كاليفورنيا BChip. ملف حساسية من الأدوية اختبار على كاليفورنيا BChip هو مشابه للنموذج التقليدي لوحة 96-جيد، مما يوحي بأن يعتبر مثاليا للرقاق...

Video: Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

الخلية المستندة إلى الفحص الكالسيوم لمتوسطة إلى فحص وظائف إنتاجية عالية باستخدام قناة الحزب FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

[ميكروأرس] البوليمر لاكتشاف إنتاجية عالية من المواد الحيوية

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

A السريع والكمية Fluorimetric طريقة لاستهداف البروتين جزيء صغير فحص المخدرات

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

باستخدام Tomoauto: بروتوكول لإنتاجية عالية الآلي البرد الإلكترون التصوير المقطعي

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

ومنصة ميكروفلويديك لعزل وحيدة الخلية عالية الإنتاجية والثقافة

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

عالية الإنتاجية تحديد البكتيريا البوليمرات طارد للمستلزمات الطبية

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these procedures in basic research and preclinical drug development, it is important to develop protocols for automated generation and analysis under standardized conditions. Here, we present a technique to generate engineered heart tissue (EHT) from cardiomyocytes of different species (rat, mouse, human). The technique relies on the assembly of a fibrin-gel containing dissociated cardiomyocytes between elastic polydimethylsiloxane (PDMS) posts in a 24-well format. Three-dimensional, force-generating EHTs constitute within two weeks after casting. This procedure allows for the generation of several hundred EHTs per week and is technically limited only by the availability of cardiomyocytes (0.4-1.0 x 106/EHT). Evaluation of auxotonic muscle contractions is performed in a modified incubation chamber with a mechanical interlock for 24-well plates and a camera placed on top of this chamber. A software controls a camera moved on an XYZ axis system to each EHT. EHT contractions are detected by an automated figure recognition algorithm, and force is calculated based on shortening of the EHT and the elastic propensity and geometry of the PDMS posts. This procedure allows for automated analysis of high numbers of EHT under standardized and sterile conditions. The reliable detection of drug effects on cardiomyocyte contraction is crucial for cardiac drug development and safety pharmacology. We demonstrate, with the example of the hERG channel inhibitor E-4031, that the human EHT system replicates drug responses on contraction kinetics of the human heart, indicating it to be a promising tool for cardiac drug safety screening.

Here, we show the generation of human engineered heart tissue from induced pluripotent stem cells (hiPSC)-derived cardiomyocytes. We present a method to analyze contraction force and exemplary alteration of contraction pattern by the hERG channel inhibitor E-4031. This method shows high level of robustness and suitability for cardiac drug screening.

تحليل الآلي تقلص الإنسان المهندسة القلب الأنسجة للفحص القلب سلامة الأدوية

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

ميكروتيسويس 3D للعلاج عن طريق الحقن بالتجدد وفحص المخدرات الفائق

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

نظام ميكروبيوريكتور لإنتاج IgG1 النموذجي في الخلايا شو الآلي استخدام الفائق

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well as large-scale high-throughput screening (HTS) campaigns. Though laboratory automation has greatly increased the utility of microplates there remain instances where automation-based instrumentation is not feasible, cost-effective or compatible with microplate formatting needs. In these cases, microplates must be manually prepared. Problematic to manual microplate manipulations is that a number of difficulties can arise pertaining to the accurate tracking of sample operations, data record keeping and quality control (QC) inspection for well artifacts or formatting errors. As microplate well densities increase (i.e., 96-well, 384-well, 1536-well) the potential for introducing errors also drastically increases.&#160; Moreover, for small bench-top laboratory operations there exists a need to improve the ease and accuracy of sample handling in a cost-effective fashion. Herein, we describe a system that acts as a semi-automated pipetting guide referred to as the Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.). &#160;M.A.P.L.E. has multiple uses for supporting compound hit-picking and microplate preparation for assay development in high-throughput screening or laboratory benchtop operations, as well as QC/quality assurance (QA) diagnostic evaluation of microplate quality or visualizing well formatting errors.

Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.) is a computer-driven device that systematically illuminates microtiter wells to provide guidance for the manual preparation of microplates.&#160; M.A.P.L.E. improves the accuracy of microplate preparation while automating data recordkeeping. &#160;In addition, it can assist with examining microplate quality or aid in the detection of errors.&#160; &#160;

تطبيقات للواح الاضاءه المتوافقة مع اللوحة المفتوحة المصدر

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...