עבודה זו מומנה בחלקה על ידי תרומות של דרום טקסס טכנולוגיה ניהול (POCrr 2009.041), מכון שילוב של רפואה ומדע מהמרכז הלאומי למחקר משאבים (UL 1RR025767), ומן המכון הלאומי למחקר דנטלי &amp; Craniofacial ( 5R21DE017294).

1. הכנת שקופיות פונקציונליות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שקופיות מיקרוסקופ במעמד שקופית נשלף, ולשטוף פעמיים ידי טבילה בצנצנת מכתים המכיל אתנול 99% (כיתה היסטולוגית). נגב השקופיות לנקות בעזרת מגבות נייר (הבטחת לא ליצור אבק נייר), ויבש באמצעות סילון של גז חנקן דחוס. </li></ol> הערה: אין להשתמש קים, מגבונים כדי לנגב את השקופיות כפי שהוא יעורר אבק נייר משובח. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את מתלה השקופית המכילה את השקופיות בצנצנת מכתים מלא חומצה גופרתית דגירה מרוכז בטמפרטורת החדר למשך הלילה. </li></ol> הערה: כדי להימנע ממגע עם העור, השתמש כימיים עמידים כפפות ומשקפי בטיחות תוך כדי עבודה עם חומצות מרוכזות וכימיקלים רעילים מאכל. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate השקופיות למשך 30 דקות ולאחר לשטוף עם מילי-Q (18 MΩ) במים למשך 30 דקות, פעל עם לשטוף אחרcetone במשך 5 דקות. טיפול זה חושף את קבוצות silanol על משטח זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל השקופיות נקיים עם 2.5% (כרך א &#39;/ כרך במים) של 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) הפתרון, על ידי טבילה המדף שקופית APTES למשך 30 דקות, לשטוף 3 פעמים במים מילי-Q במשך 15 דקות כל שטיפה, ואפייה את השקופיות בתנור ב 110 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. אפייה מאפשר cross-linking של APTES, וכתוצאה מכך functionalization-NH2 של פני השטח. </li></ol> הערה: הפוך את הפתרון APTES במיכל פלסטיק מאז פיקדונות APTES מועדף על קירות מיכל זכוכית. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות coater ספין, מעיל השקופיות עם% 1 (WT / כרך ב טולואן) פוליסטירן-Co-maleic אנהידריד (PS-MA) (Sigma) כדי להשיג מונו שכבת ציפוי הידרופובי 6. הוסף 2.0 מ&quot;ל של PS-MA על גבי זכוכית נושאת נקייה רכוב על coater ספין ומעיל בסל&quot;ד 3000 למשך 30 שניות. תנאים אלה עשויים להשתנות בהתאם ציפוי ספין פרמטרים כגון ציפוי כל כך, המצע lution, עובי של ציפוי נשלטת על ידי המשוואה הבאה 7 </li></ol><img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/3845/3845eq1.jpg" /> כאשר h הוא עובי ציפוי הסרט, דואר הוא שיעור התאדות, η, C ו ρ הם, צמיגות ריכוז וצפיפות של פתרון ציפוי, בהתאמה, ω היא המהירות הזוויתית. הערה: טולואן מזיק כאשר בשאיפה זמן שימוש ארוך של במנדף מומלץ. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השקופיות ניתן לאחסן במעמד שקופיות של עד חודש אחד יבש, נקי מאבק, התנאים בבית 2-8 ° C. </li></ol> 2. הכנת Inocula שמרים ו Encapsulation קולגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תרבות הלילה של ג אלביקנס זן SC5314, ב שמרים Peptone דקסטרוז [YPD: 10 גר &#39;/ שמרים תמצית L, 20 גר&#39; / ל &#39;peptone ו 20 גר&#39; / ל דקסטרוז] בינוני נוזל ידי יחסנו מושבה אחת של ג אלbicans תוך 10-20 מ&quot;ל של YPD 8. דגירה תרבות שייקר מסלולית (כ 150-200 סל&quot;ד) על 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה. קציר 1 מ&quot;ל קנדידה אלביקנס שמרים תאים מתרבויות YPD לילה (על ידי צנטריפוגה בסל&quot;ד 5000 למשך 5-10 דקות) ושוטפים פעמיים 10 דקות ב 1 מ&quot;ל של פוספט סטרילית בופר סליין (PBS: 10 פוספט mM חיץ, 2.7 mM אשלגן כלורי, 137 נתרן כלורי מ&quot;מ, ה-pH 7.4) (Sigma) לכל כביסה. קציר שטף תאים גם על ידי צנטריפוגה בסל&quot;ד 1900 למשך 10 דקות. Resuspend התאים שטף במאגר 1 שיקום מ&quot;ל (0.2 N NaOH פתרון עם סודה לשתייה 2.2% (wt / כרך א &#39;) ו - 4.8% (wt / כרך א&#39;) HEPES, pH 7.2). </li></ol> הערה: ג אלביקנס היא קבוצת סיכון מיקרואורגניזם 1/BSL1. זכרו תמיד להשתמש בטכניקות אספטיים / סטרילי טובים לעבודה עם מיקרואורגניזם זה ופעל נהלים מוסדיים לסילוק נאות של חומרים ביולוגית מסוכנת. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer על מיקרוסקופ שדה בהיר להתאים את צפיפות התאים של 5 × 10 7 תאים למ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן לדלל את ההשעיה פי עשרה על ידי תוספת של 10 × RPMI-1640 השלימו עם גלוטמין-L ו שנאגרו עם morpholinepropanesulfonic (מגבים) חומצה (pH 7.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתמצת את התאים השמרים קולגן על ידי ערבוב ההשעיה תא RPMI-1640 עם קולגן (1.8 מ&quot;ג / מ&quot;ל) (סוג 1 מזנב החולדה, BD Biosciences, בדפורד, מסצ&#39;וסטס), כדי לקבל ריכוז סופי של 4 × 10 6 תאים / מ&quot;ל. שמור על ההשעיה קולגן תאים על הקרח כדי למנוע gelation של קולגן לפני ההדפסה. </li></ol> 3. הכנת Ca BChip <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות ולחטא את כל פני השטח של microarrayer, כולל לשטוף צלחת המקור, ואת תחנת החלל, השקופית צלחת ואקום קאמרית ההדפסה, על ידי מנגב עם 70% isopropanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים על ידי לחיצה ארוכה ואקום המספר הרצוי של PS-MA מצופים שקופיות זכוכית על הסיפון שקופיות של מיקרופוןroarrayer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המערבולת ההשעיה תא קולגן במרץ לשאוב 100 μL ההשעיה היטב מעורבת לבאר צלחת 96-טוב, ממש לפני ההדפסה. מניחים את הצלחת המקור בתחנת הטעינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מכשיר האדים כדי לשמור על לחות יחסית של 100% בחדר microarray לאורך כל תהליך ההדפסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדפס 50 NL ההשעיה תא במערך של 48 שורות ו -16 עמודות עם נקודות במרווחים 1.2 מ&quot;מ זה מזה באמצעות הצופה microarray (Omnigrid Micro, Digilab בע&quot;מ, Holliston, MA) של בתצהיר ללא מגע באמצעות מחודדות conically מיקרומטר טיפים -190 פתח קרמיקה (Digilab). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש הממשלה, לשטוף ואקום לייבש את הטיפים פעמיים אחרי כל סיבוב של ההדפסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר ההדפסה, למקם את השקופית בחדר, מיזוג חזק humidified (קלטת הכלאה, ArrayIt Corporation, Sunnyvale, CA) ואת דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי לאפשר היווצרות biofilm. </li></ol> 4. בדיקת הרגישות של יחסי ציבורeformed Biofilms בע&quot;א BChip נגד סוכנים נגד פטריות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפתרונות מניות או אבקה של תרופות נגד פטריות, להכין פתרון עובד בינוני 1640 RPMI. ריכוזים היותר אופייניות של הפתרון עובד הם 1,024 מיקרוגרם / מ&quot;ל עבור fluconazole ו 16 מיקרוגרם / מ&quot;ל של amphotericin B 5. ריכוזים אחרים עשויים לשמש סוכנים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שמונה ריכוזים שונים של המתחם על ידי דילול פתרון המניות כפולה דילולים, פורש טווח עם IC מוערך של 50 במתחם באמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 24 שעות של צמיחה biofilm, השתמש microarrayer להדפיס 50 NL שמונה ריכוזים שונים של תרופות, יחד עם חיובי (כלומר, אין סמים תאים בתקשורת בלבד) והשלילי (שטופלו hypochlorite נתרן במשך 20 דקות) שולטת, לפחות 6 משכפל על גבי biofilms את. </li></ol> הערה: יש לשמור על לחות יחסית של 100% כדי למנוע ייבוש של כתמים תוך הרחבהמחודשת של תרופות. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן קצר לאחר מכן להוסיף את התרופות, דגירה שבב עם הסמים בתא humidified על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הסמים הנחה על ידי טבילת CaBChip 3-5 פעמים 2 דקות בכל פעם ב PBS וכתם על ידי דוגרים BChip CA עם 0.5 מיקרומטר FUN1 על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הכתם מעל ידי טבילת BChip Ca 3-5 פעמים PBS 1-3 דקות בכל דאנק, ומייבשים BChip Ca באמצעות זרם חנקן. קרא את עוצמת הקרינה באמצעות סורק microarray (GenePix 4100A, אקסון מכשירים, CA) באורך גל של 532 ננומטר עם רווח של 380 PMT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את עוצמת הקרינה של שליטה חיובית (ללא תרופות) ואת המלח (אקונומיקה) שטופלו נקודות biofilm ב 100% ו - 0%, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את אחוז עיכוב על ידי הפחתת עוצמת הקרינה (F) יחסית לממוצע הנקודות שליטה באמצעות המשוואה הבאה </li></ol><img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/3845/3845eq2.jpg" /> שם F, F Max ו-F o הן עוצמות הקרינה הגלם של טיפול תרופתי, ללא התרופה בקרה אקונומיקה שטופלו נקודות, בהתאמה. הגדרות הסורק הותאמו להשיג מקסימום F ו-F O של 30000 ו 4000 RFU, בהתאמה. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את ריכוז מעכבות 50% או 50 IC ידי התאמת שיפוע משתנה היל משוואה באמצעות תוכנת GraphPad פריזמה (La Jolla, CA). </li></ol> 5. נציג תוצאות Ca נציג BChip, בהיקף של 48 × 16 מערך של ננו biofilms של C. אלביקנס, מוצגת באיור 2. מיקרוסקופ שדה בהיר מראה אדריכלי הכולל של ננו biofilm. התמונות סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים של התוכנית biofilm כי העובש הפטרייתי המוטבעות בתוך המטריצה ​​שלסיבי קולגן, שהם כ 2 מיקרומטר ו -100 ננומטר בקוטר, בהתאמה. את FUN1 המוכתמים סורק תמונות microarray להראות את השמרים וצורות hyphal, האופייניים של biofilms פטרייתיים. התמונות הקרינה 2 ד ו 3D-confocal של FUN1 המוכתמים biofilms ניתן לראות שיש הטרוגניות מרחבית, עם אזורים של תאים פעילים מטבולית וביניהם בתוך המטריצה ​​תאי (מורכב קולגן כחומר בבועה וככל הנראה גם של חומר המיוצר על ידי exopolymeric biofilm תאים), אשר אינו המגואלות צבע מטבולית. עובי של biofilm היה מוערך להיות כ 50 מיקרומטר. BChip Ca שימש כדי להעריך את הרגישות של שתי תרופות נגד פטריות, fluconazole ו amphotericin B, והתוצאות מוצגות באיור 3. עולה בקנה אחד עם דיווחים שפורסמו על תקן התעשייה 96, גם מבחני צלחת, biofilms הם עמידים נגד fluconazole 10 ו IC מחושב 50 עבור<html> amphotericin B הוא 0.3 מיקרוגרם / מ&quot;ל 11. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3845/3845fig1.jpg" /> 1. תרשים זרימה תרשים עבור ייצור של Ca BChip. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3845/3845fig2.jpg" /> איור 2. תמונה של גבוה thoughput Ca BChip, מודפס באמצעות microarrayer רובוטית, אשר מכיל 768 מקומות על PS-MA מצופים שקופיות. כל נקודה חצי כדור הוא 50 NL בהיקף כ 700 מיקרומטר בקוטר, ועם הפרדה 1.2 מ&quot;מ בין נקודות. הראו גם (בכיוון השעון) הם מיקרוסקופ אור, סורק microarray, מיקרוסקופיה 2D ו-3D-הקרינה, וכן סריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של biofilms בודדים על BChip Ca. דמות SEM בהגדלה גבוהה של 25,000 X מראה נימה hyphal של 2 מיקרומטר רוחב. איור 3 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3845/3845fig3.jpg &quot;/&gt; איור 3. תוצאות של בדיקות רגישות ונחישות נגד פטריות וגם של IC 50 ערכים () fluconazole ו (ב) amphotericin B באמצעות Ca BChip. תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של amphotericin B שטופלו biofilms מוצגים (C). התוצאות הן ממוצע ± שגיאת התקן אומר שני שבבים נפרדים המכילים 10 משכפל עבור כל תנאי.

<ol>
	<li>Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+United+States+hospitals:+a+three-year+analysis.">Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis.</a> Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).</li><li>Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+multidrug+efflux+pumps+in+relation+to+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans+biofilms.">Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms.</a> J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).</li><li>Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Throughput+Candida+albicans+Biofilm+Chip.">Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip.</a> PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).</li><li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li><li>Pierce, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reproducible+96-well+plate-based+method+for+the+formation+of+fungal+biofilms+and+its+application+to+antifungal+susceptibility+testing.">A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing.</a> Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).</li><li>Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cellular+microarray+for+high-throughput+toxicology+assays.">Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).</li><li>Meyerhofer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+resist+films+produced+by+spinning.">Characteristics of resist films produced by spinning.</a> Journal of Applied Physics. 49, (1978).</li><li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms.">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li><li>Chandra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+by+the+fungal+pathogen+Candida+albicans:+Development,+architecture,+and+drug+resistance.">Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).</li><li>Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+biofilms+and+drug+resistance.">Fungal biofilms and drug resistance.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).</li><li>Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+activity+of+amphotericin+B,+caspofungin+and+posaconazole+on+Candida+albicans+biofilms+in+intermediate+and+mature+development+phases.">Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases.</a> Mycoses. 53, 208-214 (2010).</li></ol>

חוסה לופז ל-ריבו ואת אנאנד ק ההון Ramasubramanian משלו MicrobeHTS Technologies, Inc, המפתחת תרופות נגד פטריות. MicrobeHTS Technologies, Inc סיפקה כל תמיכה כספית למחקרים אלו.

פיתחנו מבוססי תאים בצפיפות גבוהה microarray, Ca BChip, בהיקף של כרכים nanoliter של biofilms קנדידה אלביקנס. Microarray הודפס על זכוכית שונה מצעים, אשר אפשרו התקשרות איתנה של כתמים ג&#39;ל קולגן, תוך מתן hydrophobicity הכרחי ג&#39;ל, שאינו מתפשט 3D חצי כדור. אחת Ca BChip יכול להחליף כ 8 צלחות 96 ט...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 440140 </td></tr><tr><td> פוליסטירן-Co-maleic אנהידריד (PS-MA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 426946 </td></tr><tr><td> מיקרוסקופיה זכוכית שקופיות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 12-549-3 </td></tr><tr><td> זנב עכברוש סוג קולגן אני </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> רובוטית Microarrayer </td><td> Omnigrid Micro </td><td> MICROSYS4000/4100A </td></tr><tr><td> Microarray סורק </td><td> Genepix אישי 4100A </td><td> GENEPIX4100A </td></tr><tr><td> ההכלאה קלטת </td><td> ArrayIt Corporation </td><td> AHCXD </td></tr><tr><td> FUN1 [2-chloRO-4-(2,3-dihydro-3-methyl-(benzo -1,3-thiazol-2-י.ל.)-methylidene)-1-פניל quinoliniumiodide] </td><td> Invitrogen קורפ </td><td> F-7030 </td></tr><tr><td> Fluconazole </td><td> Sicor Pharmaceuticals, Inc </td><td> J02AC01 </td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> סיגמא </td><td> A2411 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> Mediatech, Inc </td><td> 50-020-PC </td></tr><tr><td> עצה קרמיקה 190 מיקרומטר פתח </td><td> Digilab </td><td> 60020441-00 </td></tr><tr><td> GraphPad תוכנה פריזמה </td><td> GraphPad תוכנה, Inc </td><td></td></tr><tr><td> Genepix Pro v4.1 </td><td> התקנים מולקולריים </td><td></td></tr></tbody></table>

candida albicans biofilm chip (cabchip) for high-throughput antifungal drug screening

קנדידה אלביקנס נשאר סוכן etiological העיקרי של קנדידה, אשר מהווה כיום את הזיהום 4 הנפוץ ביותר בדם nosocomial בבתי חולים בארה&quot;ב 1. אלו זיהומים אופורטוניסטים מהווים איום הולך וגדל עבור מספר הולך וגדל של אנשים שנפגעו, ולבצע שיעורי תמותה גבוהים בלתי מתקבל על הדעת. זאת בין השאר בשל מאגר מוגבל של תרופות נגד פטריות, אלא גם את הופעתה של עמידות נגד תרופות נגד פטריות הנפוצים ביותר. נוסף שמסבך הטיפול היא העובדה כי רוב גילויי קנדידה קשורים להיווצרות של biofilms, והתאים בתוך biofilms אלה מראים רמות גבוהות של התנגדות לסוכנים נגד פטריות ביותר בשימוש קליני 2. כאן אנו מתארים את הפיתוח של microarray בצפיפות גבוהה שמורכבת ג אלביקנס ננו biofilms, אשר יש לנו בשם Ca BChip 3. בקצרה, microarrayer רובוטית משמש לאשמרים פלט הדפסה תאים של ג אלביקנס על מצע מוצק. במהלך ההדפסה, התאים שמרים מוקפים מטריקס תלת מימדי באמצעות בנפח נמוך כמו 50 NL ו משותקת על מצע זכוכית עם ציפוי מתאים. לאחר ההדפסה הראשונה, השקופיות מודגרת על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, כדי לאפשר פיתוח biofilm. במהלך תקופה זו כתמים לגדול לתוך מפותחת &quot;ננו&quot; כי biofilms להציג מאפיינים מבניים פנוטיפי טיפוסיות הקשורות ג בוגרת biofilms אלביקנס (כלומר המורכבות המורפולוגית, 3 אדריכלות ממדי עמידות לתרופות) 4. בסך הכל, BChip Ca מורכב של ~ 750 biofilms מקבילים וברורים מרחבית, עם יתרון נוסף שבבים מרובים ניתן להדפיס ומעובד בו זמנית. כדאיות התא מוערך על ידי מדידת עוצמת ניאון של חילוף החומרים FUN1 כתם באמצעות סורק microarray. שבב זה פטרייתי הוא אידיאלי עבור USE ההקרנה תפוקה גבוהה לגבי גילוי תרופות נגד פטריות. לעומת הסטנדרטים הנוכחיים (קרי: 96-microtiter גם הצלחת המודל של היווצרות biofilm 5), היתרונות העיקריים של השבב biofilm פטרייתי הם אוטומציה, המזעור, חיסכון בסכום עלות של חומרים כימיים וזמן הניתוח, כמו גם ביטול העבודה צעדים נמרצים. אנו מאמינים כי שבבים כאלה באופן משמעותי להאיץ את תהליך גילוי תרופות נגד פטריות.

Watch this Scientific Journal Video about Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening at JoVE.com

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

פיתחנו פלטפורמה בצפיפות גבוהה microarray המורכב 3D ננו biofilms של<em&gt; ג albicans</em&gt; קרא<em&gt; Ca</em&gt; BChip. פרופיל הרגישות של תרופות נוסו על<em&gt; Ca</em&gt; BChip דומה לדגם 96-קונבנציונלי גם צלחת, דבר המצביע על כך שבב פטרייתי הוא אידיאלי עבור הקרנת תפוקה גבוהה נכון של תרופות נגד פטריות.

קנדידה אלביקנס biofilm צ&#39;יפ (ע&quot;א BChip) להקרנה תפוקה גבוהה תרופות נגד פטריות

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

candida-albicans-biofilm-chip-cabchip-for-high-throughput-antifungal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

13.6K Views.  University of Texas at San Antonio. פיתחנו פלטפורמה בצפיפות גבוהה microarray המורכב 3D ננו biofilms של ג albicans קרא Ca BChip. פרופיל הרגישות של תרופות נוסו על Ca BChip דומה לדגם 96-קונבנציונלי גם צלחת, דבר המצביע על כך שבב פטרייתי הוא אידיאלי עבור הקרנת תפוקה גבוהה נכון של תרופות נגד פטריות.

Video: Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

תא מבוססי סידן Assay עבור בינוני עד הקרנת תפוקה גבוהה של פונקציות TRP באמצעות ערוץ FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

מהיר וכמוני Fluorimetric שיטה להקרנת סמים מיקוד-חלבון מולקולה קטנה

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

זיהוי תפוקה גבוהה של חיידקים פולימרים דוחה עבור אביזרים ומכשור רפואי

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these procedures in basic research and preclinical drug development, it is important to develop protocols for automated generation and analysis under standardized conditions. Here, we present a technique to generate engineered heart tissue (EHT) from cardiomyocytes of different species (rat, mouse, human). The technique relies on the assembly of a fibrin-gel containing dissociated cardiomyocytes between elastic polydimethylsiloxane (PDMS) posts in a 24-well format. Three-dimensional, force-generating EHTs constitute within two weeks after casting. This procedure allows for the generation of several hundred EHTs per week and is technically limited only by the availability of cardiomyocytes (0.4-1.0 x 106/EHT). Evaluation of auxotonic muscle contractions is performed in a modified incubation chamber with a mechanical interlock for 24-well plates and a camera placed on top of this chamber. A software controls a camera moved on an XYZ axis system to each EHT. EHT contractions are detected by an automated figure recognition algorithm, and force is calculated based on shortening of the EHT and the elastic propensity and geometry of the PDMS posts. This procedure allows for automated analysis of high numbers of EHT under standardized and sterile conditions. The reliable detection of drug effects on cardiomyocyte contraction is crucial for cardiac drug development and safety pharmacology. We demonstrate, with the example of the hERG channel inhibitor E-4031, that the human EHT system replicates drug responses on contraction kinetics of the human heart, indicating it to be a promising tool for cardiac drug safety screening.

Here, we show the generation of human engineered heart tissue from induced pluripotent stem cells (hiPSC)-derived cardiomyocytes. We present a method to analyze contraction force and exemplary alteration of contraction pattern by the hERG channel inhibitor E-4031. This method shows high level of robustness and suitability for cardiac drug screening.

ניתוח התכווצות האוטומטי של רקמת לב Engineered האנוש להקרנת בטיחות תרופת לב

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

השימוש תפוקה גבוהה אוטומטית Microbioreactor מערכת לייצור של מודל IgG1 בתאים צ'ו

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well as large-scale high-throughput screening (HTS) campaigns. Though laboratory automation has greatly increased the utility of microplates there remain instances where automation-based instrumentation is not feasible, cost-effective or compatible with microplate formatting needs. In these cases, microplates must be manually prepared. Problematic to manual microplate manipulations is that a number of difficulties can arise pertaining to the accurate tracking of sample operations, data record keeping and quality control (QC) inspection for well artifacts or formatting errors. As microplate well densities increase (i.e., 96-well, 384-well, 1536-well) the potential for introducing errors also drastically increases.&#160; Moreover, for small bench-top laboratory operations there exists a need to improve the ease and accuracy of sample handling in a cost-effective fashion. Herein, we describe a system that acts as a semi-automated pipetting guide referred to as the Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.). &#160;M.A.P.L.E. has multiple uses for supporting compound hit-picking and microplate preparation for assay development in high-throughput screening or laboratory benchtop operations, as well as QC/quality assurance (QA) diagnostic evaluation of microplate quality or visualizing well formatting errors.

Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.) is a computer-driven device that systematically illuminates microtiter wells to provide guidance for the manual preparation of microplates.&#160; M.A.P.L.E. improves the accuracy of microplate preparation while automating data recordkeeping. &#160;In addition, it can assist with examining microplate quality or aid in the detection of errors.&#160; &#160;

יישומים ללוחות תאורה בקוד פתוח מיקרופלייט

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...