وقد تم اختبار الجهاز DIY استرجاع المبردة في سياق مشاريع &quot;prenylation نمذجة البروتين البكتيري في الخلايا حقيقية النواة استخدام المعلوماتية الحيوية والنهج الجزيئي&quot; التي ترعاها جائزة ماري لويز أندروز لبرنامج أبحاث السرطان، فرجينيا أكاديمية العلوم &quot;، مما يعني الفسيولوجية لتحرير الحمض النووي الريبي في البلازما شجيري خلايا &quot;برعاية Jeffress F. توماس وكيت ميلر Jeffress الثقة التذكارية وعقد 16.740.11.0364 الدولة (وزارة العلوم والتربية، وروسيا). نود أن نشكر بيت بعثة مراقبة الانتخابات للحصول على المساعدة مع تجربة سلامة الحمض النووي الريبي.

1. تجميع الأجهزة متحمل البرد لاسترجاع Cryoboxes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام كماشة، تصويب جانب واحد من 3 جانب قوي التعادل (الشكل 1A) لتقديم مذكرة L قوي التعادل على شكل مبين في الشكل 1B: يمكن تحديد أبعاد تحالف قوي اعتمادا على قطر العنق من ديوار . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 تأمين مثل هذه العلاقات القوية مع حزام تي قوي التعادل (الشكل 2) باستخدام التاج الترباس الجوز، غسالة والمسمار لتشكيل قاعدة Cryoscoop كما هو مبين في الشكل (3) (أ ب) ملاحظة: تستخدم اثنين من العلاقات القوية للسماح للاسترجاع 5 ½ بوصة × 5 بوصة ونصف cryoboxes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام لوحة فترة زمنية محددة (الشكل 4)، محاذاة فتحات على حزام قوي التعادل مع تي فتحات في واحدة من نهاية فترة زمنية محددة، وتأمين لوحة اثنين معا مع مساعدة من الجوز هيلمان وبراغي (الشكل 5) ملاحظة: إذا كان لوحة فترة زمنية محددة وقوية في مباراة لا يشاركلي مع الثقوب ما قبل حفر، وسوف يكون لديك ثقوب باستخدام مثقاب كربيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثني الطرف الآخر من لوحة فترة زمنية محددة وذلك بمساعدة من كماشة كما هو مبين في الشكل (6). (هذه الخطوة اختيارية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لف مقبض مع رغوة إلى فهم أفضل للجهاز عندما تكون في النيتروجين السائل كما هو مبين في الشكل (6). (اختياري) ملاحظة: إزالة الرغوة قبل جهاز الأوتوكليف. </li></ol> 2. تجميع الأجهزة متحمل البرد لاسترجاع Cryovials ويمكن أيضا استرداد DIY متحمل البرد جهاز تكييفها لاسترجاع cryovials. وهذا ينطوي على استبدال قاعدة مسطحة مع مصفاة الفولاذ المقاوم للصدأ كما هو موضح غيرت لشفط خارج قارورة من النيتروجين السائل (الشكل 7). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فك التاج الصواميل والمسامير ربط حزام تي قوي التعادل على لوحة فترة زمنية محددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل ربط مصفاة الفولاذ المقاوم للصدأ لوحة فترة زمنية محددة، تثبت بلطف عنقومصفاة بمساعدة كماشة الى قاعدة في زاوية توجيه لتشبه مغرفة (الشكل 8) ملاحظة: إذا كانت مصفاة يأتي مع شفة، استخدم كماشة لثني الشفاه لأسفل، وهذا سيجعل من السهل المناورة مع الجهاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة حفرة على مقبض مصفاة جنبا إلى جنب مع الفتحات الموجودة على لوحة فترة زمنية محددة وتأمين مصفاة بمساعدة من المكسرات هيلمان والمسامير كما هو موضح في الشكل 8 ملاحظة: إذا كان لا يأتي في مصفاة ذات ثقوب قبل حفر، وسوف تحتاج إلى الترتيبات اللازمة لحفر ثقوب مع مثقاب كربيد. </li></ol> 3. استرجاع Cryoboxes وCryovials من ديوار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتبدأ، وضعت على قفازات المبردة وإزالة رفوف الثلاجة 1 أو 2 من ديوار للسماح للغرفة للمناورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشط بلطف على طول الجزء السفلي من ديوار مع تستقيم متحمل البرد جهاز استرجاع DIY مزودة قوي التعادل قاعدة حزام تي (الشكل 5) وجمع falle مربعn إلى أسفل خزان ديوار ملاحظة: غليان النيتروجين السائل على الفور على اتصال مع كائن أكثر دفئا، يغلف الكائن في عزل غاز النيتروجين (Leidenfrost المفعول). لتبريد جهاز قبل استرجاعها من العينات، وتزج ببطء الجهاز في ديوار والسماح النيتروجين السائل لتبريد جهاز بما فيه الكفاية قبل الشروع في الخطوة أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الجهاز تستقيم على طول الجدران لديوار لحلج القطن مربع المجمد للخروج من دبابة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستيلاء على مربع التي تم استردادها من الجزء السفلي من ديوار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاسترجاع cryovials، كشط بلطف أسفل ديوار مع cryoscoop مزودة مصفاة (الشكل 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مماثلة لاسترجاع cryobox، سحب الجهاز تستقيم وانتزاع قوارير التي تم جمعها في مصفاة. </li></ol> 4. ممثل النتائج ويتمثل التحدي الرئيسي في دراسات التعبير الجيني هو أن نوعية الحمض النووي الريبي يعتمد على ظروف التخزينلكل من عينات الأنسجة المجمدة والشكل استخراج الحمض النووي الريبي 4. 10 يظهر تأثير على سلامة التعامل مع عينة من الحمض النووي الريبي مجموع. تعرض الحمض النووي الريبي مجموع من المصدر نفسه الأنسجة (الدهنية لجسم الإنسان) إلى التعامل مع عينة مختلفة. قبل التجربة، سليمة مجموع الحمض النووي الريبي preparate يظهر واضحا 28S و 18S الريباسي العصابات مع الفرقة الريباسي 28S تقريبا ضعف شديد كما الفرقة الريباسي 18S (الشكل 10، لين 1). هذه النسبة 2:1 (28S: 18S) هو إشارة إلى أن الحمض النووي الريبي غير سليمة، في حين أن الحمض النووي الريبي المتدهورة جزئيا يظهر تشويه، أو 28S لها: 18S نسبة كثافة يبتعد 02:01 5. الممرات 3-4 يصور عينات الحمض النووي الريبي مع تدهور كبير. وتعرض هذه العينات على الحمض النووي الريبي defreezing الجزئية المتكررة على المدى القصير الاسترجاع من ديوار (الطريقة أ)، والنمذجة وبالتالي تخزين على المدى الطويل مع الدوري الصب نظرا لضرورة استرجاع من قنينة الذين سقطوا ومربعات (الشكل 10، لين 3-4 ). ومع ذلك، والعينات المخزنة في خدمتها ديوارباستخدام DIY الجهاز (الطريقة ب)، وبالتالي، لا defreezing جزئي، تحتوي على الحمض النووي الريبي سليمة (الشكل 10، لين 2). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig1.jpg" /> الشكل 1. A) وقاعدة تتألف من اثنين من 3 أبعاد قوي من جانب والتعادل هو مبين. كل علاقة وثيقة، يحتوي على واحد كبير قبل حفر حفرة (السهم الصلبة) والعديد من الثقوب الصغيرة (السهم الصغير) على كل وجه. ويوفر هذا الخيار للسماح الربط مع الجوز ومسامير. أيضا أصغر الثقوب تسمح الصرف السريع من النيتروجين السائل خلال استرجاع العينة. B) يتم تقويمها جانب واحد من كل من مباراة قوية مع مساعدة من كماشة لجعل L شكل قوي التعادل. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig2.jpg" /> الشكل 2. يستخدم قوية التعادل حزام تي لتأمين علاقات قوية معا. مثل تحالف قوي، T-حزام واحد كبير قبل حفر حفرة (السهم الصلبة) واثنين من الثقوب الصغيرة (األصغرل السهم) في كل زاوية. وهذا يسمح بتأمين علاقات قوية على طول تي - الشريط باستخدام المكسرات، والترباس. كما أنها تمكن إبزيم حزام T-إلى لوحة فترة زمنية محددة. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig3.jpg" /> الشكل 3. أ) أن تثبت كل علاقة وثيقة إلى إحدى زوايا حزام-T، على طوله باستخدام المكسرات الترباس تاج ومغالق وغسالات. B) يتم تأمين اثنين من العلاقات القوية المجاورة لبعضها البعض للمساعدة في استرداد 5 ½ بوصة × 5 ونصف cryoboxes فيها. لأصغر cryoboxes مثل 2 بوصة X 2 بوصة، ويمكن تثبيتها واحد قوي التعادل مباشرة إلى لوحة فترة زمنية محددة من دون حزام-T. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig4.jpg" /> الشكل 4. مشقوق يتم استخدام لوحة مسطحة والمقبض. طول فترة زمنية محددة لوحة يعتمد على عمق ديوار. في هذه الحالة، تم استخدام 4 أقدام من لوحة فترة زمنية محددة. سماكة لوحة فترة زمنية محددة هي الصورة الحاسمةاينس لوحات رقيقة فترة زمنية محددة (&lt;14 مقاييس) جعل الجهاز واهية في حين استرجاع عينات من النيتروجين السائل ملء ديوار. <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig5.jpg" /> الشكل 5. ثم يتم تأمين قاعدة شقة تتكون من علاقات قوامها وحزام تي في واحدة من نهاية فترة زمنية محددة لوحة. يتم محاذاة أكبر ثقب في الزاوية المتبقية من حزام تي مع فتحة على لوحة مسطحة وتثبيتها باستخدام عرافة الترباس والجوز. ويمكن استخدام هذا الجهاز الآن لاسترداد cryoboxes من ديوار. <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig6.jpg" /> يعكف الشكل 6. واحدة من نهاية فترة زمنية محددة لوحة الشقة باستخدام كماشة وغطت رغوة مع لتوفير أفضل وخاصة بالنسبة للقبضة Dewars العميقة، كما هو مبين في هذه القضية. <img alt="الشكل 7" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig7.jpg" /> الشكل 7. مصفاة مع اسلاك الصلب والفولاذ المقاوم للمؤشريستخدم لاسترداد cryovials من ديوار. سيكون مطلوبا إذا لم يتم توفير مقبض مع فتحة، مع حفر بت كربيد لحفر حفرة. <img alt="الشكل 8" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig8.jpg" /> الرقم 8. لتخفيف استرجاع cryovials، عازمة مصفاة على طول الرقبة باستخدام كماشة للحصول على شكل مغرفة مصفاة. إذا تم توفير مصفاة مع شفة كما في هذه الحالة، يمكن استخدام كماشة لثنيه. هذا لا يضمن مصفاة ننشغل في ديوار. <img alt="الشكل 9" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig9.jpg" /> يتم تأمين الشكل 9. مصفاة لوحة في شقة واحدة في نهاية فترة زمنية محددة باستخدام عرافة الجوز والترباس. <img alt="الشكل 10" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig10.jpg" /> الرقم 10. سلامة عينة من الحمض النووي الريبي مجموع يتعرضون لمختلف ظروف المناولة عينة. لاستكشاف كيفية تأثر الحمض النووي الريبي الجودة من خلال عينة التعامل مع جonditions، تعرضت مجموعة من عينات الحمض النووي الريبي من نفس المصدر إلى طريقتين من handlings. وتألفت طريقة لتخزين من الحمض النووي الريبي في ديوار تعرض لاسترجاع العينة باستخدام جهاز DIY، وبالتالي لا defreezing جزئي. وتألفت طريقة B من تخزين الحمض النووي الريبي في ديوار التعرض للdefreezing الجزئية المتكررة على المدى القصير الاسترجاع من ديوار، والنمذجة وبالتالي تخزين على المدى الطويل مع الدوري الصب لاسترجاع عينات من سقط. وقد تم تحليل الحمض النووي الريبي ثم مجموع سلامة من قبل الكهربائي للهلام. Lane1: عينة قبل تخزينها في ديوار، لين 2: عينة من ديوار التعرض للاسترجاع من خلال طريقة، لين 3 و 4: عينة من ديوار تعرض لاستردادها من قبل الطريقة ب، M: 100 شركة بريتيش بتروليوم سلم.

<ol>
	<li>Kittel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cryogenic Engineering. , 41 (1996).</li><li>Edeskuty, F. J., Walter, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stewart Safety in the handling of cryogenic fluids. , (1996).</li><li>Council, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Management of Chemical Hazards. , (2011).</li><li>Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+RNA+extraction+techniques+from+frozen+and+fresh+lung+tissues:+checkpoint+towards+gene+expression+studies.">Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies.</a> Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2001).</li><li>Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+sample+collection+and+processing+for+molecular+epidemiological+studies.">Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543, 217-234 (2003).</li><li>Lynch, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CELL,+TISSUE+AND+ORGAN+CULTURE+|+Storage+and+Cryopreservation.">CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE | Storage and Cryopreservation.</a> Encyclopedia of Rose Science. , 106-111 (2003).</li><li>Crawford, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plastics Engineering. , (1998).</li><li>Gorenc, B., Tinyou, R., Syam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Steel designers' handbook. , (1996).</li><li>Harper, C. A., Petrie, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastics+materials+and+processes:+a+concise+encyclopedia.">Plastics materials and processes: a concise encyclopedia.</a> Wiley-Interscience. , (2003).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

إحدى الطرق الأكثر شيوعا لاسترداد cryoboxes وcryovials من قاع الخزان ديوار هو صب النتروجين السائل في وعاء الغيار وسحب العينات المتبقية في قارورة أو طافية في النيتروجين السائل يصب. هذا، مع ذلك، من الممارسات غير الآمنة التي يمكن أن تسبب حروقا المبردة أو الاختناق بسبب التعرض لفت...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> هيلمان المجموعة مشقوق شقة مطلي 1-3/8 × 4 أقدام، 14 المقياس </td><td> الأجهزة المحلية متجر </td><td> N / A </td><td> 1 وحدة مطلوبة </td></tr><tr><td> تاج بولت الفولاذ المقاوم للصدأ # 6 - 32 × 3/8 بوصة البيضاوي المسمار فيليبس رئيس حملة آلة </td><td> الأجهزة المحلية متجر </td><td> نموذج # 42281 </td><td> 4 وحدات مطلوب </td></tr><tr><td> تاج بولت 3/8 بوصة X 1-1/2 فيها الزنك مطلي غسالات الحاجز الصلب </td><td> الأجهزة المحلية متجر </td><td> نموذج # 20122 </td><td> 4 وحدات مطلوب </td></tr><tr><td> تاج بولت الزنك مطلي # 8-32 آلة البندق برغي </td><td> الأجهزة المحلية متجر </td><td> نموذج # 18512 </td><td> 4 وحدات مطلوب </td></tr><tr><td> سيمبسون قوي التعادل BC40Z 4 In.x4 فيها نصف قاعدة </td><td> الأجهزة المحليةتسوق </td><td> نموذج # BC40Z </td><td> 2 وحدة مطلوبة </td></tr><tr><td> سيمبسون قوي التعادل بعد 6 بوصات × 6 بوصات الشريط T </td><td> الأجهزة المحلية متجر </td><td> نموذج # 66T </td><td> 1 وحدة مطلوبة </td></tr><tr><td> أونيدا 6 مصفاة شبكة &quot; </td><td> المحلية متجر بقالة </td><td> نموذج # 7859W </td><td> 1 وحدة مطلوبة </td></tr><tr><td> حفزت الفريق هيلمان المكسرات عرافة 3/8-16 </td><td> الأجهزة المحلية متجر </td><td> # نموذج: 810509 </td><td> 6 وحدات مطلوب </td></tr><tr><td> حفزت الفريق هيلمان الترابيس هيكس 3/8- 16 </td><td> الأجهزة المحلية متجر </td><td></td><td> 4 وحدات مطلوب </td></tr><tr><td> رغوة للعزل </td><td> الأجهزة المحلية متجر </td><td></td><td> 1 وحدة مطلوبة </td></tr><tr><td> برغي سائق </td><td> الأجهزة المحلية متجر </td><td></td><td> 1 وحدة مطلوبة </td></tr><tr><td> كماشة </td><td> الأجهزة المحلية متجر </td><td></td><td> 1 وحدة مطلوبة </td></tr></tbody></table>

do-it-yourself device for recovery of cryopreserved samples accidentally dropped into cryogenic storage tanks

النيتروجين السائل هو عديم اللون، عديم الرائحة، بارد جدا (-196 درجة مئوية) السائلة أبقى تحت الضغط. ويشيع استخدام هذا كسائل المبردة لتخزين على المدى الطويل من مواد بيولوجية مثل خلايا الدم والأنسجة 1،2. طبيعة المبردة من النيتروجين السائل، في حين المثالي لحفظ عينة، يمكن أن يسبب التجميد السريع للأنسجة الحية في الاتصال - المعروفة باسم &#39;حرق المبردة &quot;2، والذي قد يؤدي إلى قضمة الصقيع الشديد في الأشخاص الذين يشاركون عن كثب في تخزين واسترجاع عينات من Dewars. وبالإضافة إلى ذلك، والنيتروجين السائل يتبخر أنه يقلل من تركيز الأوكسجين في الهواء، وربما يسبب الاختناق، وخاصة في الأماكن الضيقة 2. في المختبرات، وغالبا ما يتم تخزين العينات البيولوجية في cryovials أو cryoboxes مكدسة في الرفوف الفولاذ المقاوم للصدأ داخل الدبابات ديوار 1. وتقدم هذه رفوف التخزين مع رمح طويل لمنع مربعات من الانزلاق الخروج من الرفوف والى الجزء السفلي منDewars خلال التعامل مع الروتين. في كثير من الأحيان، ومع ذلك، وعلب أو قوارير مع العينات الثمينة تفلت وتنزل الى القاع من خزان النتروجين السائل شغلها. في مثل هذه الحالات، يمكن أن عينات استرجاع مضجر بعد نقل النيتروجين السائل في وعاء الغيار أو رميه. يمكن للصناديق وقارورة ثم تكون بأمان نسبيا تعافى من ديوار تفرغ. ومع ذلك، فإن طبيعة المبردة من النيتروجين السائل ومعدل توسع يجعل الغارقة الخطرة استرجاع العينة. ويوصى عادة من قبل مكاتب السلامة أن يتم أبدا تنفيذ استرجاع عينة من قبل شخص واحد. وثمة بديل آخر يتمثل في استخدام الأيادي بارد المتاحة تجاريا أو ملقط لسحب قوارير 3. ومع ذلك، الرؤية محدودة داخل Dewars سائل مظلم شغل يشكل عائقا كبيرا في استخدامها. في هذه المقالة، ونحن تصف بناء جهاز متحمل البرد استرجاع DIY، الأمر الذي يجعل استرجاع عينة من السوائل المبردة ديوار التي تحتوي على كل من آمن 1الثانية وسهل.

Watch this Scientific Journal Video about Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks at JoVE.com

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

هنا نقدم منخفضة التكلفة، ومتحمل البرد جهاز دائم لاسترجاع عينة من خزانات مليئة ديوار النيتروجين السائل. سهولة البناء وتصميم وحدات الجهاز يجعل من عملية استرجاع عينة من الدبابات المبردة آمنة وسهلة.

افعل ذلك بنفسك جهاز لاستخراج العينات Cryopreserved سقطت سهوا في صهاريج التخزين المبردة

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

do-it-yourself-device-for-recovery-cryopreserved-samples-accidentally

Research

JoVE Journal

Biology

25.1K Views.  George Mason University. هنا نقدم منخفضة التكلفة، ومتحمل البرد جهاز دائم لاسترجاع عينة من خزانات مليئة ديوار النيتروجين السائل. سهولة البناء وتصميم وحدات الجهاز يجعل من عملية استرجاع عينة من الدبابات المبردة آمنة وسهلة.

Video: Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

تصنيع جهاز ميكروفلويديك للتجزئة سوما الخلية العصبية والمحاوير

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

جهاز لتوليد التدرج ميكروفلويديك لبيولوجيا الخلية

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

زرع الخلايا مباشرة في الكلى من اسماك الزرد الكبار

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

عينات الاختبار لتحسين STORM فائقة الدقة المجهر

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

التعافي من اسماك الزرد الكبار قلوب للتطبيقات عالية الإنتاجية

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;

تحليل شبه الجينومية السالمونيلا من غذاء والعينات البيئية

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive behaviors and the acquisition of gametes and embryos for physiological or molecular research. Amphibians contribute to one-quarter to one-third of vertebrate research, and of interest in this context is their contribution to the scientific community&#39;s knowledge of reproductive processes and embryological development. However, most of this knowledge is derived from a small number of species. In recent times, the decimation of amphibians across the globe has required increasing intervention by conservationists. The captive recovery and assurance colonies that continue to emerge in response to the extinction risk make existing research and clinical applications invaluable to the survival and reproduction of amphibians held under human care. The success of any captive population is founded on its health and reproduction and the ability to develop viable offspring that carry forward the most diverse genetic representation of their species. For researchers and veterinarians, the ability to monitor and control ovarian development and health is, therefore, imperative. The focus of this article is to highlight the different assisted reproductive techniques that can be used to monitor and, where appropriate or necessary, control ovarian function in amphibians. Ideally, any reproductive and health issues should be reduced through proper captive husbandry, but, as with any animal, issues of health and reproductive pathologies are inevitable. Non-invasive techniques include behavioral assessments, visual inspection and palpation and morphometric measurements for the calculation of body condition indices and ultrasound. Invasive techniques include hormonal injections, blood sampling, and surgery. Ovarian control can be exercised in a number of ways depending on the application required and species of interest.

The study of amphibian biology provides valuable information on the reproductive, physiological, embryological and developmental processes that drive organisms of many taxonomic groups. Here, we present a comprehensive guide on different methodologies that can be used to study ovarian control and monitoring in amphibians.

التقنيات الإنجابية لرصد المبيض والسيطرة عليه في البرمائيات

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

تحميل عينة المبردة في زاوية سحرية الغزل مطياف الرنين المغناطيسي النووي الذي يحافظ على الجدوى الخلوية

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

التصوير الخالي من التسميات لديناميكيات تخزين الدهون في Elegans Caenorhabditis باستخدام المجهر التشتت رامان المحفزة

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.