עשה זאת בעצמך מכשיר קריוגני אחזור נבדקו במהלך הפרויקטים &quot;חלבון חיידקי דוגמנות prenylation בתאים האיקריוטים באמצעות ביואינפורמטיקה גישות מולקולריות&quot; בחסות פרס מרי לואיז אנדרוז תוכנית לחקר הסרטן, וירג&#39;יניה האקדמיה למדעים &quot;, כלומר הפיזיולוגי של עריכת רנ&quot;א בפלסמה תאים דנדריטים &quot;בחסות פ תומאס Jeffress וקייט מילר Jeffress הזיכרון אמון חוזה המדינה 16.740.11.0364 (משרד המדע החינוך, רוסיה). אנו רוצים להודות בית המשקיפים על הסיוע בניסוי שלמות RNA.

1. הרכבה של התקן Cryotolerant לאחזור של Cryoboxes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות צבת, ליישר את צד אחד של 3 צדדית חזקה, עניבה (איור 1 א) כדי להפוך הערה בצורת L חזק עניבה שמוצג באיור 1 ב. ממדים של תיקו חזקה ניתן לבחור תלוי בקוטר של הצוואר של דיואר . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאבטח את שני אלה חזק הקשר עם רצועת עזה T-עניבה (איור 2) באמצעות כתר בורג, אגוז מכונת כביסה בורג כדי ליצור את הבסיס Cryoscoop כפי שמוצג באיור 3 (AB). הערה: שני קשרים חזקים משמשים כדי לאפשר אחזור של 5 ½ פנימה X 5 וחצי פנימה cryoboxes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות צלחת מחוררת (איור 4), יישר את חריצי על רצועת עזה, עניבה T עם החריצים בצד אחד של הצלחת מחוררת לאבטח את השניים יחד עם עזרה של אגוז הילמן ברגים (איור 5). הערה: אם צלחת מחוררת חזקה של עניבה לא שותףלי עם חורים שנקדחו מראש, תצטרך יש חורים שנקדחו באמצעות קצת קרביד תרגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכופף את הקצה השני של צלחת מחוררת ובעזרת צבת כפי שמוצג באיור 6. (שלב זה הוא אופציונלי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף את הידית עם קצף טוב יותר לתפוס את המכשיר כאשר בחנקן נוזלי כפי שמוצג באיור 6. (לא חובה) הערה: הסר את הקצף לפני מעוקר. </li></ol> 2. הרכבה של התקן Cryotolerant לאחזור של Cryovials מכשיר אחזור Cryotolerant DIY יכול גם להיות מותאם לשליפה של cryovials. זה כולל החלפת בסיס שטוח עם מסננת נירוסטה כפי שמוצג שינו את גורפת את צלוחיות של חנקן נוזלי (איור 7). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראון להתיר ברגים ואומים מצרף את רצועת עזה, עניבה T לצלחת מחוררת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הצמדת מסננת נירוסטה לצלחת מחוררת, בעדינות לכופף את הצוואר שלמסננת בעזרת צבת לבסיס המזרח בזווית דומה מצקת (איור 8) הערה: אם מסננת מגיע עם השפה, השתמש צבת לכופף את השפה למטה, זה יעשה את התמרון עם המכשיר קלה יותר.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את חור על הידית של המסננת עם החורים על צלחת מחוררת ולהבטיח מסננת עם עזרה של אגוזים הילמן ברגים כפי שמוצג באיור 8. הערה: אם לא בא מסננת עם חורים שנקדחו מראש, יהיה עליך לסדר יש חורים שנקדחו עם המקדח קרביד. </li></ol> 3. אחזור Cryoboxes ו Cryovials מ דיואר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל, לשים את הכפפות קריוגני ולהסיר 1 או 2 מדפי הקפאה של דיואר לאפשר מקום תמרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לגרד בחלק התחתון של דיואר עם מכשיר זקוף DIY Cryotolerant אחזור מצויד עם בסיס חזק T-עניבה הרצועה (איור 5) ולאסוף falle תיבתn כדי בתחתית הערה דיואר מיכל:. רותח חנקן נוזלי באופן מיידי על קשר עם חפץ חם, עוטף את האובייקט בידוד גז חנקן (אפקט Leidenfrost). כדי לצנן את המכשיר לפני שליפה של דגימות, לאט לטבול את המכשיר לתוך דיואר ולאפשר חנקן נוזלי כדי לצנן את המכשיר מספיק לפני שתמשיך לשלב לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את המכשיר זקוף לאורך הקירות של דיואר כדי לגרוף את תיבת במקפיא מתוך הטנק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את תיבת לאחזר מהחלק התחתון של דיואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחזור cryovials, בעדינות לגרד את תחתית דיואר עם cryoscoop מצויד עם מסננת (איור 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדומה cryobox אחזור, למשוך את המכשיר זקוף לתפוס את מבחנות שנאספו מסננת. </li></ol> 4. נציג תוצאות אתגר מרכזי במחקרים התבטאות גנים היא שאיכות RNA תלוי בתנאי האחסוןהן דגימות רקמה קפואים איור חילוץ RNA 4. 10 מראה את ההשפעה של הטיפול על שלמות מדגם של רנ&quot;א הכל. סך הכל RNA ממקור רקמות זהה (השומן האנושי) היה נתון בטיפול מדגם שונה. לפני הניסוי, ללא שינוי סך RNA פרפרט מראה ברורים 28S ו 18s rRNA להקות עם הלהקה 28S rRNA בערך פי שניים אינטנסיבי כלהקה 18s rRNA (איור 10, מסלול 1). זה ביחס של 2:1 (28S: 18s) הוא אינדיקציה לכך RNA לא נפגע, ואילו RNA מושפל חלקית מופיע כתם, או 28S שלה: 18s יחס יוצא מן העוצמה 02:01 5. מסלולים 3-4 מתאר דגימות רנ&quot;א עם ירידה משמעותית. דגימות אלה רנ&quot;א היו נתונים defreezing חלקי חזר ידי לטווח קצר retrievals של דיואר (שיטה), ובכך דוגמנות אחסון ארוך טווח עם תקופתי decanting בשל הצורך אחזור של צלוחיות וקופסאות (איור 10, ליין 3-4 ). עם זאת, דגימות מאוחסנים דיואר שירותבאמצעות המכשיר עשה זאת בעצמך (שיטה ב &#39;), ולכן, לא defreezing חלקית, מכילים RNA תמימים (איור 10, ליין 2). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig1.jpg" /> באיור 1. א) הבסיס מורכב משני 3 חזק עניבה של ממדים צדדית המוצגים. כל העניבה חזק מכיל חור אחד גדול מראש קדח (החץ מוצק) ו חורים קטנים רבים (חץ קטן) על פני כל אחד. זה מספק אפשרות לאפשר לחיזוק עם אגוזים ברגים. גם את החורים הקטנים לאפשר ניקוז מהיר של חנקן נוזלי במשך אחזור לדוגמה. ב) צד אחד של כל אחד העניבה חזק הוא יישר בעזרת פלייר כדי להפוך ל &#39;בצורת חזק, עניבה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig2.jpg" /> איור 2. חזק עניבה רצועת T משמש להבטחת חזק הקשר יחד. כמו חזק, עניבה, T-רצועת יש חור אחד גדול קדח מראש (החץ מוצק) ושני חורים קטנים יותר (smalאני חץ) בכל פינה. זה מאפשר להבטיח חזק קשרים לאורכו של טי - רצועה באמצעות אגוזים הבריח. הוא גם מאפשר הידוק T-הרצועה לצלחת מחוררת. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig3.jpg" /> איור 3. א) הקשר חזק כל נצמדת בפינה אחת של רצועת-T, לאורכו באמצעות הבריח הכתר אגוזים, ברגים מכונות כביסה. ב &#39;) שני חזק קשרים מאובטחים סמוכים זה לזה כדי לאחזר 5 ½ 5 ½ פנימה X cryoboxes פנימה. עבור cryoboxes קטנים יותר כגון 2 X 2 פנימה פנימה, אחד חזק הקשר יכול להתהדק ישירות צלחת מחוררת ללא רצועת-T. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig4.jpg" /> איור 4. מחוררת צלחת שטוחה משמשת הידית. אורך צלחת מחוררת תלוי בעומק של דיואר. במקרה זה, 4 כפות של צלחת מחוררת היה בשימוש. עובי צלחת מחוררת הוא קריטיאינס צלחות חריץ דק (&lt;14 מדדים) להפוך את המכשיר דקיק תוך אחזור דגימות חנקן נוזלי מלא דיואר. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig5.jpg" /> איור 5. בסיס שטוח המורכב חזק עניבות רצועת T מאובטח אז בקצה אחד של צלחת מחוררת. חור גדול בפינת הנותר של הרצועה T מיושר עם החריץ בצלחת שטוחה הידק באמצעות בורג אגוז hex ו. מכשיר זה יכול לשמש כעת לאחזר cryoboxes של דיואר. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig6.jpg" /> איור 6. קצה אחד של צלחת שטוחה מחוררת כפופה באמצעות צבת, מכוסה קצף כדי לספק אחיזה טובה במיוחד Dewars עמוקים, כפי שמוצג במקרה זה. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig7.jpg" /> איור 7. מסננת עם רשת התיל ידית נירוסטההמשמש לאחזור cryovials של דיואר. אם הידית לא מסופק עם חריץ, לקדוח עם קצת קרביד יידרש קידוח חור. <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig8.jpg" /> איור 8. כדי להקל על שליפת cryovials, מסננת כפופה לאורך הצוואר באמצעות צבת לקבל מצקת מסננת בצורת. אם מסננת מסופק עם השפה כמו במקרה זה, צבת ניתן לכופף אותו. זה מבטיח מסננת לא להיתפס בתוך דיואר. <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig9.jpg" /> איור 9. מסננת מאובטח על צלחת שטוחה מחוררת בקצה אחד באמצעות אגוז hex ו הבריח. <img alt="איור 10" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig10.jpg" /> איור 10. שלמות המדגם של רנ&quot;א הכל נתון בתנאים טיפול שונים לדוגמה. לחקור כיצד איכות RNA מושפע מדגם טיפול גonditions, סט של דגימות רנ&quot;א מאותו המקור היה נתון שתי שיטות handlings. השיטה כללה אחסון של RNA ב דיואר נתון retrievals מדגם באמצעות המכשיר עשה זאת בעצמך, ובכך לא defreezing חלקי. שיטה ב &#39;כוללת אחסון של RNA של דיואר נתון defreezing חלקי חזר על ידי לטווח קצר retrievals של דיואר, ובכך דוגמנות אחסון ארוך טווח עם תקופתי decanting לאחזור דגימות שנפלו. סה&quot;כ שלמות RNA נותח ולאחר מכן על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה. Lane1: לדוגמא לפני אחסון דיואר, ליין 2: דוגמה של דיואר נתון אחזור בשיטה, ליין 3, 4: דוגמה של דיואר נתון אחזור על ידי שיטה ב, ז: 100 סולם BP.

<ol>
	<li>Kittel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cryogenic Engineering. , 41 (1996).</li><li>Edeskuty, F. J., Walter, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stewart Safety in the handling of cryogenic fluids. , (1996).</li><li>Council, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Management of Chemical Hazards. , (2011).</li><li>Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+RNA+extraction+techniques+from+frozen+and+fresh+lung+tissues:+checkpoint+towards+gene+expression+studies.">Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies.</a> Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2001).</li><li>Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+sample+collection+and+processing+for+molecular+epidemiological+studies.">Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543, 217-234 (2003).</li><li>Lynch, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CELL,+TISSUE+AND+ORGAN+CULTURE+|+Storage+and+Cryopreservation.">CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE | Storage and Cryopreservation.</a> Encyclopedia of Rose Science. , 106-111 (2003).</li><li>Crawford, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plastics Engineering. , (1998).</li><li>Gorenc, B., Tinyou, R., Syam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Steel designers' handbook. , (1996).</li><li>Harper, C. A., Petrie, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastics+materials+and+processes:+a+concise+encyclopedia.">Plastics materials and processes: a concise encyclopedia.</a> Wiley-Interscience. , (2003).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

אחת השיטות הנפוצות ביותר של אחזור cryoboxes ו cryovials מהחלק התחתון של הטנק דיואר היא למזוג חנקן נוזלי לתוך מיכל רזרבי ולשלוף את הדגימות שנותרו בבקבוק או צף חנקן נוזלי יצק. זהו, עם זאת, בפועל לא בטוח שעלול לגרום לכוויות קריוגני או מחנק עקב חשיפה ממושכת אדי חנקן נוזלי 2. ד?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> הילמן קבוצה מצופים מחוררת שטוח 1-3/8 x 4 מטר, 14 מד </td><td> חומרה מקומי החנות </td><td> N / A </td><td> 1 יחידת חובה </td></tr><tr><td> קראון בורג נירוסטה מס &#39;6 - 32 x 3/8 פנימה הסגלגל בורג פיליפס ראש כונן המחשב </td><td> חומרה מקומי החנות </td><td> דגם # 42281 </td><td> 4 יחידות הנדרשים </td></tr><tr><td> קראון בורג 3/8 x 1-1/2 פנימה פנימה אבץ מצופה Washers פנדר פלדה </td><td> חומרה מקומי החנות </td><td> דגם # 20122 </td><td> 4 יחידות הנדרשים </td></tr><tr><td> קראון בורג מצופה אבץ # 8-32 בורג אגוז Machine </td><td> חומרה מקומי החנות </td><td> דגם # 18512 </td><td> 4 יחידות הנדרשים </td></tr><tr><td> סימפסון חזק עניבה BC40Z 4 In.x4 פנימה בסיס חצי </td><td> מקומי חומרהקניות </td><td> דגם # BC40Z </td><td> 2 יחידות הנדרשים </td></tr><tr><td> סימפסון חזק עניבה 6 אינץ&#39; x 6 אינץ&#39; רצועה T </td><td> חומרה מקומי החנות </td><td> דגם 66T # </td><td> 1 יחידת חובה </td></tr><tr><td> Oneida 6 &quot;קווי מסננת </td><td> חנות המכולת המקומית </td><td> דגם # 7859W </td><td> 1 יחידת חובה </td></tr><tr><td> קבוצת הילמן מגולוון אגוזים Hex 3/8-16 </td><td> חומרה מקומי החנות </td><td> מק&quot;ט: 810509 </td><td> 6 יחידות הנדרשים </td></tr><tr><td> קבוצת הילמן מגולוון ברגים Hex 3/8- 16 </td><td> חומרה מקומי החנות </td><td></td><td> 4 יחידות הנדרשים </td></tr><tr><td> קצף לבידוד </td><td> חומרה מקומי החנות </td><td></td><td> 1 יחידת חובה </td></tr><tr><td> לדפוק Driver </td><td> חומרה מקומי החנות </td><td></td><td> 1 יחידת חובה </td></tr><tr><td> צבת </td><td> חומרה מקומי החנות </td><td></td><td> 1 יחידת חובה </td></tr></tbody></table>

do-it-yourself device for recovery of cryopreserved samples accidentally dropped into cryogenic storage tanks

חנקן נוזלי הוא חסר צבע, חסר ריח, קר מאוד (-196 ° C) נוזלי כל הזמן תחת לחץ. זה הוא נפוץ כמו נוזל קירור לאחסון לטווח ארוך של חומרים ביולוגיים, כגון כדוריות הדם 1,2 רקמות. הטבע קריוגני של חנקן נוזלי, בעוד אידיאלי לשימור הדגימה, יכול לגרום הקפאה מהירה של רקמות חיות על קשר - המכונה &quot;קריוגני לשרוף &#39;2, אשר עשוי להוביל כוויות קור קשות בבני אדם מעורב מקרוב אחסון ואחזור של דגימות Dewars. בנוסף, כמו חנקן נוזלי מתאדה היא מפחיתה את ריכוז החמצן באוויר ועלולים לגרום חנק, במיוחד בחללים סגורים 2. במעבדות, דגימות ביולוגיות מאוחסנות בדרך כלל cryovials או cryoboxes מוערמים על מדפי נירוסטה בתוך הטנקים דיואר 1. מתלים אלו אחסון מסופקים עם מוט ארוך על מנת למנוע החלקת תיבות מן המדפים את בתחתיתDewars במהלך טיפול שגרתי. לעתים קרובות מדי, עם זאת, תיבות או צלוחיות עם דגימות יקרות להחליק החוצה לשקוע בתחתית המכל מלא חנקן נוזלי. במקרים כאלה, דוגמאות אפשר היה לאחזר לעייפה לאחר העברת חנקן נוזלי לתוך מיכל רזרבי או ביטול זה. את קופסאות צלוחיות אז יכול להיות התאושש יחסית בשלום דיואר התרוקן. עם זאת, אופי קריוגני של חנקן נוזלי קצב ההתפשטות שלה עושה את מסוכנים שקועות אחזור לדוגמה. מומלץ בדרך כלל על ידי משרד הבטיחות מדגם אף פעם לא אחזור להתבצע על ידי אדם אחד. חלופה נוספת היא להשתמש grabbers מגניב זמינים מסחרית או מלקחיים כדי לשלוף את צלוחיות 3. עם זאת, הראות מוגבלת בתוך Dewars כהים מלאים נוזל מהווה מגבלה משמעותית את השימוש בהם. במאמר זה, אנו מתארים את הבנייה של המכשיר DIY Cryotolerant אחזור, מה שהופך אחזור מדגם דיואר המכיל נוזלים קריוגני הן בטוחותND קלים.

Watch this Scientific Journal Video about Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks at JoVE.com

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

כאן אנו מציגים בעלות נמוכה, המכשיר עמיד cryotolerant לאחזור מדגם טנקים דיואר מלא חנקן נוזלי. קלות הבנייה העיצוב המודולרי של המכשיר הופך את תהליך אחזור מדגם ומכלי קירור קלה ובטוחה.

עשה זאת בעצמך התקן להבראת דוגמאות Cryopreserved בטעות ירד לתוך טנקים אחסון קריוגני

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

do-it-yourself-device-for-recovery-cryopreserved-samples-accidentally

Research

JoVE Journal

Biology

25.0K Views.  George Mason University. כאן אנו מציגים בעלות נמוכה, המכשיר עמיד cryotolerant לאחזור מדגם טנקים דיואר מלא חנקן נוזלי. קלות הבנייה העיצוב המודולרי של המכשיר הופך את תהליך אחזור מדגם ומכלי קירור קלה ובטוחה.

Video: Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

המצאה של המכשיר microfluidic עבור מידור של Neuron סומה האקסונים

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

התקן Gradient מניבות Microfluidic עבור ביולוגיה של התא

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

השתלה של תאים ישירות לתוך הכליה של דג הזברה למבוגרים

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

דוגמאות מבחן לייעול STORM סופר רזולוציה מיקרוסקופית

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;

ניתוח קוואזי-metagenomic של סלמונלה מזון, סביבתית דגימות

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive behaviors and the acquisition of gametes and embryos for physiological or molecular research. Amphibians contribute to one-quarter to one-third of vertebrate research, and of interest in this context is their contribution to the scientific community&#39;s knowledge of reproductive processes and embryological development. However, most of this knowledge is derived from a small number of species. In recent times, the decimation of amphibians across the globe has required increasing intervention by conservationists. The captive recovery and assurance colonies that continue to emerge in response to the extinction risk make existing research and clinical applications invaluable to the survival and reproduction of amphibians held under human care. The success of any captive population is founded on its health and reproduction and the ability to develop viable offspring that carry forward the most diverse genetic representation of their species. For researchers and veterinarians, the ability to monitor and control ovarian development and health is, therefore, imperative. The focus of this article is to highlight the different assisted reproductive techniques that can be used to monitor and, where appropriate or necessary, control ovarian function in amphibians. Ideally, any reproductive and health issues should be reduced through proper captive husbandry, but, as with any animal, issues of health and reproductive pathologies are inevitable. Non-invasive techniques include behavioral assessments, visual inspection and palpation and morphometric measurements for the calculation of body condition indices and ultrasound. Invasive techniques include hormonal injections, blood sampling, and surgery. Ovarian control can be exercised in a number of ways depending on the application required and species of interest.

The study of amphibian biology provides valuable information on the reproductive, physiological, embryological and developmental processes that drive organisms of many taxonomic groups. Here, we present a comprehensive guide on different methodologies that can be used to study ovarian control and monitoring in amphibians.

טכניקות הרבייה ניטור ובקרה של השחלות

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

דגימה קריוגנית נטענת לתוך זווית קסם ספינינג ספקטרומטר תהודה מגנטית גרעינית המשמרת את הכדאיות התאית

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

הדמיה ללא תווית של דינמיקת אחסון השומנים באלגנים של Caenorhabditis באמצעות מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.