이 작품은 뇌 종양 연구, 뇌 종양 치료 및 건강의 국립 연구소 (1R21CA141020-01)의 프레스턴 A. 웰스 주니어 센터 플로리다 센터에 의해 지원되었다.

1. Glioblastoma 단일 세포 현탁액을 준비 <ol><li> Gliomasphere 문화는 설립 이전에 설명 2,11,12로 neurosphere 분석 (NSA)을 사용하여 유지됩니다. </li><li> gliomaspheres을 passaging에 해당하는 시간에, 분야를 포함하는 매체는 적절한 크기 무균 조직 배양 관에 배치, 제거하고, 실온에서 5 분 800 RPM (110g)에 centrifuged. </li><li> 표면에 뜨는는 삭제되고 영역의 펠렛은 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML에 resuspended 37의 ° C 3-5 분을위한 물 목욕에 incubated 수 있습니다. </li><li> 콩 트립신 억제제의 동일한 볼륨은 다음 트립신의 활동을 중지하는 데 사용됩니다. </li><li> 세포 현탁액은 부드럽게 동질성과 트립신의 활동을 완전히 중화을 보장하기 위해 아래로 pipetted하고 있습니다. </li><li> 세포 현탁액 다시 5 분 800 rpm으로 centrifuged 있습니다. NeuroCult의 1ml에 표면에 뜨는이 제거되고 셀은 resuspended 아르NSC 자연적으로 흐르는 것과 중간. </li><li> 단일 셀 정지 10μl는 셀 카운트를 수행 할 trypan 블루의 90μl과 혼합되어 있습니다. </li></ol> 2. 셀 추적 Carboxyfluorescein Succinimidyl 에스터 (CFSE) 그린 형광 염료로 착색 <ol><li> 스테인드 할 때마다 백만 세포를 들어, 염색 시약의 1 ML은 5 μm의 최종 착색 농도를 제공 NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과 보통 1 ML에 5 MM 셀 추적 CFSE 염색 (분자 프로브, Invitrogen) 1 μl를 추가하여 준비가되어 있습니다 . </li><li> 세포를 포함하는 착색 시약은 동질성 때까지 잘 섞어 10 분 동안 실온에서 incubated입니다. </li><li> 부화하는 동안, 얼음처럼 차가운 NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과 매체는 담금질 솔루션으로 준비가되어 있습니다. </li><li> 염색 프로세스를 중지하려면 얼음처럼 차가운 담금질 솔루션의 약 5-10 권 CFSE -로드 셀에 추가됩니다. </li><li> 솔루션은 다음 5 분 800 rpm으로 centrifuged되고 표면에 뜨는는 삭제됩니다. </li><li> 일시요점은, 착색이 성공적 나타내는 색의 밝은 녹색 색조와 튜브의 하단에있는 세포 펠렛을가 나타납니다. </li><li> 세포는 5 분 및 폐기 표면에 뜨는 800 rpm으로 centrifuging, 신선한 NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과 보통 1-2 ML에서 펠렛을 resuspending하여 세척합니다. 이 절차는 세 세차의 총 반복됩니다. </li><li> 세 번째 세척 한 후 세포가 NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과 중간과 셀 수이 수행되는 1 ML에 resuspended 있습니다. </li><li> CFSE 스테인드 세포는 다음 적절한 밀도 [50000 세포 / ML]에서 무균 조직 문화 플라스크에 도금 및 37 ° C / 5퍼센트 CO2 humidified 인큐베이터에 배치됩니다. </li></ol> 3. CFSE로드 확인 <ol><li> NSA 문화에 도금 셀은 CFSE의 착색을 확인하기 위해 형광 현미경으로 모니터링 할 수 있습니다. 이 단계에서, 세포의 모든 밝은 녹색 색상 (그림 1)을 나타냅니다. 의 세포 현탁액의 또는 드롭CFSE의 스테인드 세포는 현미경 슬라이드에 배치하고 형광 현미경으로 세포를 시각화하는 coverslip으로 덮여 될 수 있습니다. </li><li> 성공적인 CFSE 라벨은 또한 유동 세포 계측법을 통해 확인된다. 각 그룹에서 많은 1-5으로 X 10 5 세포가 CFSE의 착색 확인을 위해 충분합니다. CFSE는 세포와 무부하 대조군 세포가 1 개 - PBS 500 μl의 총 볼륨에 대한 NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과 중간에 각각 resuspended와 별도의 FACS 튜브에 배치됩니다로드. </li><li> 흐름 cytometer는 관련 매개 변수의 사용 설명서의 지침에 따라 조정됩니다. CFSE는 492 nm의와 517 nm의 방출 최대 파장 여기 최대가 있습니다. </li><li> 첫째, 무부하 제어 세포가 실행되고 획득 이벤트 순방향 및 측면 분산 (FSC 대 SSC)와 히스토그램 플롯에 기록되며, 주요 세포 인구는 (그림 2A) 출입을 금지합니다. </li><li> 마찬가지로, CFSE로드 셀은 동일한 매개 변수를 사용하여 분석s은 (는) 제어 세포 (그림 2B)에 사용됩니다. </li></ol> 4. 느린 - 분리 형광 활성 세포 정렬 (FACS)를 사용 세포 인구 [예 CFSE는 보관]을의 절연 <ol><li> 부문시, CFSE 강도는 감소하고 hGBM 전지는 녹색 형광 강도의 다른 수준 (그림 3) 전시 세포로 구성되어 gliomaspheres를 형성하고 있습니다. gliomaspheres는 직경 약 150-200 μm (약 5-10일 세포주의 성장 속도에 따라 포스트 CFSE 로딩)의 평균 크기에 도달 한 경우, 영역을 포함하는 매체는 적절한 크기 무균 조직 배양에 배치, 제거 관, 그리고 실온에서 5 분 800 rpm으로 centrifuged. </li><li> 이전 단계에서 설명하고 세포까지 밀리리터 당 10 7 셀 밀도와 세포 현탁액을 준비하기 위해 셀 수에 대한 PBS에 resuspended하기 때문에 단일 셀 정지이 준비되어 있습니다. </li><li> 고물에응급실은 PBS의 적절한 볼륨에서 셀을 resuspending, Propidium의 요오드화물은 (PI, 시그마, 500 μg / ML) 1 μl / 정렬 / 유동 세포 계측법에 의해 분석하면 죽은 세포를 제외 세포 현탁액의 ML의 농도에 추가됩니다. </li><li> 전체 NeuroCult NSC 매체의 각 포함 1ml 두 15 ML 멸균 조직 배양 튜브는 정렬 천천히 나누어 세포 (CFSE 유지 세포)와 빠른 나누어 세포를 (CFSE diluting 세포)를 수집하는 데 사용됩니다. </li><li> 첫째, 무부하 셀 그룹에서 세포 현탁액은 흐름 cytometer를 통해 실행됩니다. </li><li> 세포는 (이벤트) 세포의 대부분이 유동 계획에 포함되도록 조정됩니다 앞으로 분산 (FSC) 대 측 분산 (SSC)와 두 매개 변수에 대한 전압 매개 변수를 기반으로 꾸몄다됩니다. </li><li> 죽었거나 손상된 세포를 제외하려면 셀 SSC 대 PI 반응성에 따라 해본와 하나의 라이브 세포 인구는 (PI 음수) 출입을 금지하고 있습니다. </li><li> 그런 다음 단일 셀 인구는 F에 따라 선택됩니다orward 분산 (FSC) 대 측 분산 (SSC). </li><li> 균일 한 라이브 세포 인구는 다음 로그 스케일에 자리 잡고 셀 주파수 대 CFSE 강도에 따라 막대 그래프에 도시된다. CFSE 레이저 강도는 0과 100 사이의 부정적인 신호를 배치하기 위해 조정됩니다. </li><li> 동일한 매개 변수와 유사한 게이팅 전략을 사용하여 CFSE 표시된 셀은 흐름 cytometer를 통해 실행되며 (그림 4C) 분석했다. </li><li> 그 후, 셀 및 전체 인구의 느린 나누어 인구는 (빠른 나누어 세포) CFSE을 (각각 CFSE 높은 상위 5 %와 CFSE 저 아래 85%), 유지하는 능력에 따라 식별됩니다. </li><li> 이러한 서로 다른 세포 인구 그런 다음 전체 NSC 매체의 1ml를 포함하는 별도의 15 ML 멸균 조직 배양 튜브에 정렬됩니다. </li><li> 정렬 셀은 다음 5 분 800 rpm으로 centrifuged 있습니다. </li><li> appro에 표면에 뜨는는 삭제되고 펠릿은 resuspended 있습니다중간 (절연 행사 또는 펠릿 크기의 수에 따라)와 세포 수의 priate 볼륨이 수행됩니다. </li><li> 다른 정렬 인구의 세포는 그 다음 적절한 무균 조직 배양 플라스크에 밀리리터 50,000 세포에서 도금 및 직렬 passaged 또는 하류 실험에 사용되기 전에 5~10일에 대해 37 ° C / 5퍼센트 CO2 humidified 인큐베이터에 배치됩니다. </li></ol> 5. 대표 결과 현미경 (그림 1)에서 시각화로 CFSE을로드 한 후, 모든 세포는 강렬한 녹색 형광을 제시한다. 이 녹색 착색 색상도 육안 (동영상 참조)와 함께 볼 수 있습니다. 유동 세포 계측법과 함께 세포를 분석하면 제어 세포 (그림 2)에 비해 매우 강렬한 녹색 형광을 보여줍니다. neurosphere 문화에 도금 CFSE로드 셀되면,이 세포는 세포 분열 따위에 의해 번식하고 5-10일에서 150-200 μm gliomaspheres를 형성하고 있습니다. 세포는 t를 분아 따위에 의해 중식으로<html> 그는 형광 염료가 아침마다 세포 분열과 형광 강도의 반턱로 이어지는, 부서에 따라 딸 세포 사이에 분포되어있다. Glioblastomas는 기능적으로 이기종하고 다른 시간의 척도에 proliferating 세포로 구성되어 있습니다. 이 프로토콜에 설명 된 방법은 각각 CFSE을 희석하거나 유지하는 능력 (그림 3도 동영상을 참조)의 미덕에 의해 신속하고 느린 나누어 세포를 식별하고 분리 한 수 있습니다. 무부하 세포에 비해 CFSE -로드 셀에서 생성 dissociated gliomaspheres의 유동 세포 계측법 분석은 다양한 CFSE 보존 특성 (그림 4)을 보여줍니다. 빠른 나누어 세포 (아래 85 %) 또는 속도가 느린 나누어 전지 (상위 5 % - CFSE 높은) neurosphere 분석 조건 (그림 5)에서 배양하면 능력을 형성 전시 gliomapshere. gure 1 &quot;/&gt; 그림 1. 즉시 CFSE 색소를로드 한 후 Dissociated 종양 세포. 세포 성공적으로 라벨을 보여주는 밝은 녹색 색상을 나타냅니다. 원래 배율, 10 ×. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 유동 세포 계측법을 사용하여 CFSE 로딩 확인. A) 언로드 세포, B) CFSE는로드 대 무부하 셀에 CFSE 형광 강도를 비교) 세포와 C를로드. 라벨과 라벨이없는 세포 사이의 형광 강도의 크기 차이의 여러 명령이 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 육일 도금 후 CFSE -로드 셀에서 파생 된 대표 gliomasphere. 일부 셀은 매우 밝은 CFSE의 착색을 나타냅니다. 원래 배율, 63​​ X. <img SRC = &quot;/ files/ftp_upload/3918/3918fig4.jpg&quot;ALT = &quot;그림 4&quot;/&gt; 그림 4. 대표 유동 세포 계측법 플롯 / 육일 CFSE의 착색 후 빠르고 느린 나누어 세포의 분리에 대한 histograms. 죽었거나 손상된 세포를 제외 할 전체 세포 인구를 표시) FSC 대 SSC, B) SSC 대 PI 반응성, C) 게이트 FSC 대 SSC 동질적인 라이브 셀 인구, D는) 6 일 대조군에 비해 큰 형광 강도에 의해 입증으로 CFSE 라벨 후 CFSE 유지 세포의 존재를 보여줍니다. 히스토그램은 또한 CFSE 강도)이 시간. E를 통해 CFSE 유지 전지 (상위 5 %)와 CFSE diluting 세포 (하단 85 %)를 식별 할 수있는 게이팅 전략을 표시 히스토그램을 부패한 것으로 나타났습니다. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig5.jpg" alt="그림 5" /> 에서 생성 그림 5. 대표 gliomaspheres <strong&gt; A) 빠른 속도로 나누어 전지 (CFSE 낮은)와 B) 천천히 나누어 세포 (CFSE 높은). 원본 배율 :. 각각 10 배와 20x C)은 대표 세포 수는 통과 할 때 빠르게 또는 느리게 나누어 세포 유래의 문화에서 얻은. P &lt;0.05, t-테스트합니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3918/3918fig5large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

연구의 증가는 종양 형성과 치료 저항 2-8에 기여하는 암의 세포의 느린 나누어 하위 칸의 중요성을 보여주고 있습니다. 따라서 서로 다른 성장 속도로 subpopulations을 비교하는 것이 더 일반적으로 세포 또는 특정 subpopulation의 연구를 가능하게 실험 방법을 설명하고 표준화하는 것이 중요합니다. 세포 분열 자신의 속도에 따라 세포의 하위 분수를 식별하고 분리 할 수​​ CFSE를 사용하면 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 유형 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC 자연적으로 흐르는 것과 중간 (인간) </td><td> 중 </td><td> 셀 기술을 줄기 </td><td> 05,750 </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC 확산 보조 식품 (인간) </td><td> 중간 보충 </td><td> 셀 기술을 줄기 </td><td> 05,753 </td></tr><tr><td> % 0.05 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 시약 </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td></tr><tr><td> 콩 트립신 억제제 </td><td> 시약 </td><td> 시그마 </td><td> T6522 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> 시약 </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> T25 플라스크 </td><td> 문화 도자기 </td><td> Nalge Nunc 국제 </td><td> 136196 </td></tr><tr><td> T80 플라스크 </td><td> 문화 도자기 </td><td> Nalge Nunc 국제 </td><td> 178905 </td></tr><tr><td> 15 ML 튜브 </td><td> 문화 도자기 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352096 </td></tr><tr><td> 50 ML 튜브 </td><td> 문화 도자기 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> 성장 인자 </td><td> R &amp; D </td><td> 2028-EG </td></tr><tr><td> CellTrace의 CFSE의 세포 증식 키트 </td><td> 형광등 전지 부문은 추적 염료 </td><td> 분자 프로브, Invitrogen </td><td> C34554 </td></tr></tbody></table>

identification and isolation of slow-dividing cells in human glioblastoma using carboxy fluorescein succinimidyl ester (cfse)

종양 이질성은 종양 견고성을 지원하는 기본 기능을 나타냅니다 및 치료 전략 1의 발전에 중심 장애물를 제공합니다. 종양 이질성의 문제를 극복하려면, 특정 질병 pathologies을 유도하고 임상 적으로 관련성이 높은 목표를 대표하는 종양 subpopulations의 phenotypic (에피네프린) 유전 및 기능 식별 및 특성을 사용 assays과 도구를 개발하는 것이 필수적입니다. 그것은 지금은 잘 종양이 느린 자전거가되는 기능 기준을 적극적으로 종양이 형성 뇌, 유방, 피부를 포함한 여러 암의 능력과 연결되어 세포 분열의 다른 주파수로 세포의 하위 분수 독특한 전시입니다, 그리고 설립 췌장뿐만 아니라 백혈병 2-8. 형광 염료 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르 (CFSE)이 혈액 관련 t의 체외에서 세포의 분열 주파수를 추적하고 생체에 사용되었습니다umors 및 glioblastoma 2,7,8 등의 고체 종양. CFSE의 세포 permeant 비 형광 프로 약물은 안정적인 아미드 결합 할 구를 형성하는 세포 아민 그룹과의 succinimidyl 잔기의 반응을 통해 단백질 covalently 구속력이 세포 내에서 유지되는 형광 화합물로 세포 esterases으로 변환됩니다. 형광 염료가 아침마다 세포 분열과 형광 강도의 반턱로 이어지는, 부서에 따라 딸 세포 사이에 분포되어있다. 이 부문 10 8-10 발까지 세포주기 주파수를 추적 할 수 있습니다. CFSE 유지 용량은 암 줄기 세포 활동 2 풍부 할 보여준 속도가 느린 자전거 subpopulation을 (위 5퍼센트 염료 유지 세포)를 식별하고 격리하는 뇌 종양 세포와 함께 사용되었습니다. 이 프로토콜은 인간 glio의 문화에서 CFSE로 세포를 얼룩의 기술과 개인 인구의 격리를 설명blastoma (GBM) - 파생 유동 세포 계측법 2를 사용 서로 다른 부문 가격을 가진 세포. 기술은 식별하고 CFSE 라벨을 유지하는 능력을 가진 세포의 뇌 종양이 천천히 자전거 인구를 분리하기 위해 제공하고 있습니다.

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Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

이 비디오 프로토콜은 세포 분열의 주파수에 따라 인간 glioblastoma의 셀의 다른 하위 집단의 식별 및 분리를위한 형광 염료 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르 (CFSE)의 응용 프로그램을 보여줍니다.

카르복시 Fluorescein Succinimidyl 에스터 (CFSE)를 사용 인간 Glioblastoma의 속도가 느린 - 나누면 전지의 식별 및 분리

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

identification-isolation-slow-dividing-cells-human-glioblastoma-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

14.0K 조회수.  The University of Florida. 이 비디오 프로토콜은 세포 분열의 주파수에 따라 인간 glioblastoma의 셀의 다른 하위 집단의 식별 및 분리를위한 형광 염료 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르 (CFSE)의 응용 프로그램을 보여줍니다.