עבודה זו נתמכה על ידי מרכז פלורידה לחקר סרטן המוח, פרסטון א ולס ג&#39;וניור המרכז לריפוי סרטן המוח והמכונים הלאומיים לבריאות (1R21CA141020-01).

1. הכנת השעית תא בודדה Glioblastoma <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות Gliomasphere הוא הוקם ומתוחזק באמצעות assay neurosphere (NSA) כ2,11,12 תוארו קודם לכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן המתאים לpassaging את gliomaspheres, מדיום המכיל את תחומי מוסר, הונח בצינור מתאים גודל רקמת סטרילית תרבות, וcentrifuged ב 800 סל&quot;ד (110 גר &#39;) למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Supernatant נמחק והגלולה של ספירות היא resuspended ב 1 מ&quot;ל של 0.05% טריפסין-EDTA וטופחה על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 3-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח שווה של מעכבי טריפסין סויה לאחר מכן נעשה שימוש כדי לעצור את פעילות טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעית תא pipetted בעדינות מעלה ומטה כדי להבטיח אחידות ונטרול מוחלט של פעילות טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעית התא היא centrifuged שוב ב800 סל&quot;ד למשך 5 דקות. Supernatant מוסר ותאי resuspended ב1ml של NeuroCultבינוני אסאל המל&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10μl של השעית התא בודד הוא מעורבב עם 90μl של trypan כחול לבצע ספירת תאים. </li></ol> 2. הכתמה עם תא Trace Carboxyfluorescein Succinimidyl גרין דיי פלורסנט אסתר (CFSE) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל 1 מיליון תאים להיות מוכתם, 1 מ&quot;ל של ריאגנט המכתים הוא הוכן על ידי הוספת μl 1 מתוך 5 מ&quot;מ לצבוע סלולרי Trace CFSE (בדיקות מולקולריות, Invitrogen) ל1 מ&quot;ל של מדיום אסאל NeuroCult המל&quot;ל לתת ריכוז סופי מכתים של 5 מיקרומטר . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגיב מכתימה המכילים את התאים מתערבב היטב עד הומוגניות ודגר בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, בינוני קר כקרח NeuroCult המל&quot;ל אסאל מוכן כפתרון המרווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעצור את תהליך הצביעה, כרכים כ 5-10 של פתרון מרווה קרה כקרח מתווספים לתאי CFSE הטעונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז הפתרון הוא centrifuged ב800 סל&quot;ד למשך 5 דקות וsupernatant נמחק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב הנקודה היא, לא אמור להופיע גלולה של תאים בחלק התחתון של הצינור עם גוון ירוק בוהק של צבע, המציין המכתים הייתה מוצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים נשטפים על ידי resuspending גלול ב 1-2 מ&quot;ל של מדיום טרי NeuroCult המל&quot;ל אסאל, צנטריפוגה ב 800 סל&quot;ד לדקות, והבריח את supernatant 5. הליך זה חוזר על עצמו עבור סכום כולל של שלוש כביסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה השלישית, התאים resuspended ב 1 מ&quot;ל של מדיום NeuroCult המל&quot;ל אסאל וספירת תאים מתבצעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי CFSE המוכתמים אז מצופים בצלוחיות תרבות רקמות סטריליים בצפיפות מתאימה [50,000 תאים / מ&quot;ל] והניחו ב37 מעלות צלזיוס / 5% חממת humidified CO2. </li></ol> 3. אימות טוען CFSE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים המצופים בתרבות NSA ניתן לנטר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאמת מכתים CFSE. בשלב זה, את כל התאים מפגינים צבע ירוק בהיר (איור 1). לחלופין, ירידה של השעית התא מתאים מוכתמים CFSE יכולים להיות ממוקמים בשקופית מיקרוסקופ ומכוסה בcoverslip כדי לחזות תאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג CFSE מוצלח מאושר נוסף באמצעות cytometry זרימה. רבים כמו 1-5 x 10 5 תאים מכל קבוצה יספיקו לאימות מכתימה CFSE. CFSE נטען תאי תאי בקרה שליליים פרקו הם resuspended בהתאמה ב1 x-PBS או בינוני אסאל NeuroCult המל&quot;ל להיקף כולל של 500 μl והניחו בצינורות FACS נפרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cytometer הזרימה מותאם מתבסס על הוראות המדריך למשתמש שלה עבור פרמטרים קשורים. CFSE יש מקסימום עירור אורך גל של 492 ננומטר ומקסימום פליטה של ​​517 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, תאי הבקרה פרקו מנוהלים והאירועים שנרכשו נרשמים בפיזור קדימה וצד (FSC לעומת SSC) וחלקות היסטוגרמה, והאוכלוסייה העיקרית היא התא מגודרת (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדומה לכך, תאי CFSE הטעונים מנותחים באמצעות אותו הפרמטרשל תאים המשמש לבקרה (התרשים 2B). </li></ol> 4. בידוד של חלוקה איטית-[CFSE כלומר שימור] אוכלוסייה ניידת באמצעות מיון תא הופעל פלורסנט (FACS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החלוקה, עוצמת CFSE היא ירד ותאי hGBM יוצרים gliomaspheres שמורכבים מתאים מציגים רמות שונות של עוצמת קרינה ירוקה (איור 3). כאשר הגיע gliomaspheres גודל ממוצע של כ 150-200 מיקרומטר קוטר (כ 5 עד 10 ימי טעינת CFSE הודעה בהתאם לקצב גידול שורת התאים), המדיום המכיל את תחומי מוסר, הוצב בתרבית רקמה סטרילית מתאימה גודל צינור, וcentrifuged ב800 סל&quot;ד למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעית תא בודד מוכנה כמתואר בשלבים קודמים ותאי resuspended ב PBS לספירת תאים על מנת להכין את השעית תא עם צפיפות של עד 10 7 תאים למ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בירכתי הספינהאה resuspending התאים בנפח מתאים של PBS, יודיד Propidium (PI, סיגמא, 500 מיקרוגרם / מ&quot;ל) הוא הוסיף בריכוז של μl 1 / מ&quot;ל ​​של השעית תא להוציא תאים מתים כאשר ממוין / נותח על ידי cytometry זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני צינורות 15 מ&quot;ל סטריליים רקמות תרבות כל 1ml של מדיום המכיל מלא NeuroCult המל&quot;ל משמשים לאיסוף תאים ממוינים מתחלקים איטי-(תאי התמך CFSE) והתאים המתחלקים מהר (תאי CFSE דילול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, השעית התא מקבוצת התא פרקה מנוהלת באמצעות cytometer הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים (אירועים) הם זממו מבוססים על פיזור (SSC) פיזור קדימה (FSC) לעומת צד ופרמטרי מתח עבור שני הפרמטרים מותאמים כך שרוב התאים כלולים בעלילת הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להוציא את התאים מתים או פגומים, התאים זממו מבוסס על תגובתיות SSC לעומת PI ואוכלוסיית התא החייה הבודדה (PI שלילי) היא מגודרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז, אוכלוסיית תאים הומוגנית נבחרה על סמך fפיזור orward (FSC) לעומת פיזור צד (SSC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז אוכלוסיית התאים הומוגנית האחת החיה זממה בהיסטוגרמה המבוססת על תדרים סלולריים לעומת עוצמת CFSE להגדיר בסולם לוגריתמים. עוצמת ליזר CFSE מותאמת על מנת למקם את האות השלילית בין 0 ל 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באותם פרמטרים ואסטרטגית gating דומה, תאי CFSE הכותרת מופעלים באמצעות cytometer הזרימה ונתחו (4C איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתוצאה מכך, אוכלוסייה איטית חלוקה של תאים ואוכלוסייה כוללת (תאים המתחלקים מהר יותר) המזוהית מבוססת על היכולת שלהם לשמור על CFSE (CFSE 5% גבוהים ועליונים 85% CFSE נמוך תחתונים, בהתאמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוכלוסיות תאים שונים האלה אז מסודרות ל15 צינורות נפרדים מ&quot;ל סטריליים רקמות תרבות המכילים 1ml של מדיום המל&quot;ל להשלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים ממוינים מכן centrifuged ב800 סל&quot;ד למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Supernatant נמחק והגלול הוא resuspended בapproנפח priate של מדיום (תלוי במספר האירועים מבודדים או גודל כדורי) וספירת תאים מתבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים מהאוכלוסיות השונות הממוינות אז מצופים ב50,000 תאים למ&quot;ל בבקבוקון התרבות מתאימה סטרילי רקמות והניחו ב37 מעלות צלזיוס / 5% CO2 חממת humidified עבור 5-10 ימים לפני שpassaged סדרתי או המשמש לניסויים במורד זרם. </li></ol> 5. נציג תוצאות לאחר טעינת CFSE, כל התאים להציג פלואורסצנטי ירוקה אינטנסיבית כמו דמיינו תחת המיקרוסקופ (איור 1). צבע ירקרק ניתן לראות זאת גם בעין בלתי מזוינת (ראה וידאו). ניתוח תאים אלה עם cytometry הזרימה גם מראה פלואורסצנטי ירוק מאוד אינטנסיבי בהשוואה לתאי ביקורת (איור 2). עם התאים טעונים CFSE ציפוי בתרבות neurosphere, תאים אלה מתרבים ויוצרים 150-200 gliomaspheres מיקרומטר בתוך 5-10 ימים. כאשר התאים מתרבים, לא<html> הוא צבע זרחני מופץ באופן שווה בין תאי בת על חטיבות, שמוביל את halving של עוצמת הקרינה בכל חלוקת תא. Glioblastomas פונקציונלי הוא הטרוגנית ומורכבת מתאים מתרבים על סולמות זמן שונים. השיטה שתוארה בפרוטוקול זה מאפשרת לזהות ולבודד תאים מהירים ואיטיים המתחלקים מכוח יכולתם לדלל או לשמור CFSE, בהתאמה (איור 3, גם לראות את הווידאו). ניתוח cytometry זרימה של gliomaspheres ניתק שנוצר מהתאים CFSE טעונים בהשוואה לתאים פרקו מפגין תכונות שימור CFSE שונות (איור 4). תאים המתחלקים במהירות (85% למטה) או תאים המתחלקים איטיים (5% העליונים - CFSE הגבוהים) gliomapshere התערוכה יצרה יכולת כאשר בתרבית בתנאי assay neurosphere (איור 5). 1 gure &quot;/&gt; איור 1. תאים סרטניים ניתקים מייד לאחר טעינה עם צבע CFSE. התאים מפגינים צבע ירוק בהיר מפגין תיוג מוצלח. גדלה מקורית, 10 x. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. אישור הטעינה CFSE באמצעות cytometry זרימה.) תאים נפרקו, ב) CFSE טעון תאים ו-C) השוואה בין עוצמת קרינת CFSE בתאים טעונים מול פרקו. שים לב שיש כמה סדרי גודל ההבדל בעוצמת הקרינה בין התאים שהכותרת וללא תווית. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. Gliomasphere נציג נגזר מתא CFSE טעון 6 ימים לאחר ציפוי. תאים מסוימים מפגינים מכתימים CFSE בהיר מאוד. הגדלה מקורית; 63 x. <imגרם src = &quot;/ files/ftp_upload/3918/3918fig4.jpg&quot; alt = &quot;איור 4&quot; /&gt; איור 4. נציג זרימה cytometry חלקות / histograms לבידודה של חלוקת תאים מהירים ואיטיים 6 ימים לאחר צביעת CFSE.) FSC לעומת SSC להראות אוכלוסיית התא כולו, B) תגובתיות SSC לעומת PI להוציא תאים מתים או פגומים, ג) FSC לעומת SSC לשער חית אוכלוסייה הומוגנית תא, ד) מדגים נוכחות של תאי התמך CFSE 6 ימים לאחר תיוג CFSE כפי שמעיד עוצמת קרינה גבוהה יותר בהשוואה לשליטה השלילית. היסטוגרמה גם מראה כי עוצמת CFSE נרקבה לאורך הזמן. E) היסטוגרמה מציגה אסטרטגית gating לזהות תאי CFSE התמך (5% עליונים) ותאי דילול CFSE (85% למטה). <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. Gliomaspheres נציג שנוצר <stronז&gt;) תאים המתחלקים במהירות-(CFSE נמוך) ותאי B) חלוקה איטית-(CFSE גבוה). הגדלה מקורית:. 10x ו 20x בהתאמה C) ספירת תאי נציג מתקבלת מהתרבות מהירה או איטית חלוקת תא המופק בשלב מעבר. P &lt;0.05, מבחן t. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3918/3918fig5large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

<ol>
	<li>Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+of+cancer+robustness+and+evolvability.">The origins of cancer robustness and evolvability.</a> Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).</li><li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma.">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).</li><li>Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deoxycholate+promotes+survival+of+breast+cancer+cells+by+reducing+the+level+of+pro-apoptotic+ceramide.">Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide.</a> Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).</li><li>Pece, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+molecular+heterogeneity+of+breast+cancers+correlates+with+their+cancer+stem+cell+content.">Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li><li>Roesch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temporarily+distinct+subpopulation+of+slow-cycling+melanoma+cells+is+required+for+continuous+tumor+growth.">A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth.</a> Cell. 141, 583-594 (2010).</li><li>Dembinski, J. L., Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+functional+analysis+of+a+slow+cycling+stem+cell-like+subpopulation+in+pancreas+adenocarcinoma.">Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).</li><li>Graham, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive,+quiescent,+Philadelphia-positive+stem+cells+from+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+are+insensitive+to+STI571+in+vitro.">Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro.</a> Blood. 99, 319-325 (2002).</li><li>Holyoake, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+quiescent+leukemic+cells+from+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+spontaneously+initiate+factor-independent+growth+in+vitro+in+association+with+up-regulation+of+expression+of+interleukin-3.">Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3.</a> Blood. 97, 720-728 (2001).</li><li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies.">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).</li><li>Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+cell+division+in+vivo+and+in+vitro+using+flow+cytometric+measurement+of+CFSE+dye+dilution.">Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution.</a> J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).</li><li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+Human+Glioblastoma+Multiforme+Tumor+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).</li><li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

מספר גדל והולך של מחקרים הוכיח את החשיבות של-תא תת איטי חלוקה-תאים בסרטן אשר תורמים להיווצרות גידול ועמידות לטיפול 2-8. לכן זה קריטי לתיאור ולתקנן שיטות ניסיוניות המאפשרות מחקר של תת אוכלוסיות ספציפיות זה של תאים או באופן כללי יותר להשוואת אוכלוסיות עם שיעורי צמ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> סוג </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> בינוני אסאל המל&quot;ל NeuroCult (אדם) </td><td> בינוני </td><td> טכנולוגיות תאי גזע </td><td> 05750 </td></tr><tr><td> תוספי הפצת נשק מל&quot;ל NeuroCult (אדם) </td><td> תוסף בינוני </td><td> טכנולוגיות תאי גזע </td><td> 05753 </td></tr><tr><td> 0.05% טריפסין-EDTA </td><td> מגיב </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td></tr><tr><td> מעכב טריפסין סויה </td><td> מגיב </td><td> סיגמא </td><td> T6522 </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> מגיב </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> T25 בקבוק </td><td> תרבות כלי </td><td> Nalge Nunc בינלאומי </td><td> 136196 </td></tr><tr><td> T80 בקבוק </td><td> תרבות כלי </td><td> Nalge Nunc בינלאומי </td><td> 178905 </td></tr><tr><td> 15 צינורות מ&quot;ל </td><td> תרבות כלי </td><td> BD פלקון </td><td> 352096 </td></tr><tr><td> 50 צינורות מ&quot;ל </td><td> תרבות כלי </td><td> BD פלקון </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> גורם גדילה </td><td> מו&quot;פ </td><td> 2028-EG </td></tr><tr><td> קיט התפשטות תאי CFSE CellTrace </td><td> חלוקת תאי פלורסנט מעקב דיי </td><td> בדיקות מולקולריות, Invitrogen </td><td> C34554 </td></tr></tbody></table>

identification and isolation of slow-dividing cells in human glioblastoma using carboxy fluorescein succinimidyl ester (cfse)

ההטרוגניות גידול מייצגת תכונה מהותית תמיכת חוסן גידול ומהווה מכשול מרכזי לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות 1. כדי להתגבר על הבעיה של ההטרוגניות גידול, הוא חיוני לפיתוח מבחנים וכלים המאפשרים זיהוי פנוטיפית, (EPI) גנטי ופונקציונלי ואפיון של אוכלוסיות סרטניות המניעות פתולוגיות מחלות ספציפיות ומייצגים יעדים רלוונטיים קליני. עכשיו זה מבוסס היטב כי גידולי התערוכה ייחודיים משנה שברים של תאים עם תדרים שונים של חלוקת תא, וכי הקריטריונים התפקודיים של רכיבה איטית להיות קשורים באופן חיובי עם יכולת היווצרות גידול במספר סוגי סרטן, כוללים אלה של המוח, שד, העור ו לבלב כמו גם ללוקמיה 2-8. פלורסנט לצבוע carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE) שמשה למעקב אחר חלוקת התדרים של תאים במבחנה ובחי בt דם נישאumors וגידולים מוצקים, כגון גליובלסטומה 2,7,8. פרו תרופת התא permeant הלא הניאון של CFSE מומרת על ידי esterases התאי לתוך מתחם ניאון, שנשמר בתוך תאים על ידי קוולנטית מחייבת לחלבונים באמצעות תגובה של מחצית succinimidyl עם קבוצות אמינות תאיות ליצור קשרים אמידים יציבים 9. הצבע הזרחני מופץ באופן שווה בין תאי בת על חטיבות, שמוביל את halving של עוצמת הקרינה בכל חלוקת תא. הדבר זה מאפשר מעקב של תדר מחזור התא עד 8-10 סיבובים של חטיבה 10. קיבולת אצירת CFSE שמשה עם תאים סרטניים במוח כדי לזהות ולבודד subpopulation רכיבה איטית (5% עליונים תאי צבע התמך-) הוכיח להיות מועשרים בפעילות תאי גזע הסרטן 2. פרוטוקול זה מתאר את הטכניקה של הכתמת תאים עם CFSE והבידוד של אוכלוסיות בודדות בתוך תרבות של glio האנושיblastoma (GBM)-ליטול תאים בעלי שיעורי חלוקה שונה באמצעות cytometry הזרימה 2. הטכניקה משמשת כדי לזהות ולבודד אוכלוסיית רכיבה איטית גידול במוח של תאים בזכות היכולת שלהם לשמור על תיוג CFSE.

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE at JoVE.com

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

פרוטוקול וידאו זה מדגים את היישום של צבע carboxyfluorescein succinimidyl אסתר הניאון (CFSE) לזיהוי וההפרדה של תת אוכלוסיות שונות של תאים בגליובלסטומה האנושית המבוססות על תדר של חלוקת תא.

זיהוי ובידוד של תאים מתחלקים לאט בGlioblastoma האנושי באמצעות Carboxy fluorescein Succinimidyl אסתר (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

identification-isolation-slow-dividing-cells-human-glioblastoma-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

14.0K Views.  The University of Florida. פרוטוקול וידאו זה מדגים את היישום של צבע carboxyfluorescein succinimidyl אסתר הניאון (CFSE) לזיהוי וההפרדה של תת אוכלוסיות שונות של תאים בגליובלסטומה האנושית המבוססות על תדר של חלוקת תא.

Video: Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

בידוד של תאי גזע סרטני מדגימות אדם סרטן הערמונית

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

בידוד, Cryopreservation ותרבות של תאי אפיתל amnion אדם ליישומים קליניים

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל Multi-פרמטר

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

דור של Microtumors שימוש 3D אדם Biogel תרבות מערכת תאי Glioblastoma נגזרות חולות להרכבת פרופיל Kinomic ובדיקת תגובה לתרופה

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

אספקה ​​אינטראנסלית של תאים בתאי גזע כדי גליובלסטומה במודל עכבר

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

אפיון של תאים חיסוניים בתוך רקמת שומן אנושי באמצעות Cytometry זרימה

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

בידוד של ראשי תאים Decidual האנושי בקרום עוברי של המונח Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...