نشكر ستيفن كوتش على دعمه التقني وشانون لي Layland (سواء فراونهوفر مجلس الحبوب العراقي شتوتغارت) على اقتراحاته مفيدة على المخطوطة. تم دعم هذا العمل ماليا من قبل برنامج جذب للفراونهوفر غزلشافت وBMBF ل(على حد سواء إلى KS-L).

<ol>
	<li>Chan, J. W., Lieu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biochemical+characterization+of+stem+cells+using+vibrational+spectroscopy.">Label-free biochemical characterization of stem cells using vibrational spectroscopy.</a> J. Biophotonics. 2, 656-668 (2009).</li><li>Downes, A., Mouras, R., Elfick, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+spectroscopy+for+noninvasive+monitoring+of+stem+cell+differentiation.">Optical spectroscopy for noninvasive monitoring of stem cell differentiation.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2010, 101864-101864 (2010).</li><li>Gentleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+materials+differences+revealed+in+engineered+bone+as+a+function+of+cell-specific+differentiation.">Comparative materials differences revealed in engineered bone as a function of cell-specific differentiation.</a> Nat. Mater. 8, 763-770 (2009).</li><li>Notingher, I., Hench, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+microspectroscopy:+a+noninvasive+tool+for+studies+of+individual+living+cells+in+vitro.">Raman microspectroscopy: a noninvasive tool for studies of individual living cells in vitro.</a> Expert. Rev. Med. Devices. 3, 215-234 (2006).</li><li>Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+preservation+of+extracellular+matrix+in+cardiac+tissues:+implications+for+long-term+graft+durability.">Optimized preservation of extracellular matrix in cardiac tissues: implications for long-term graft durability.</a> Ann. Thorac. Surg. 83, 1641-1650 (2007).</li><li>Raman, C. V., Krishnan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+type+of+secondary+radiation.">A new type of secondary radiation.</a> Nature. 122, 12 (1928).</li><li>Frushour, B. G., Koenig, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+scattering+of+collagen,+gelatin,+and+elastin.">Raman scattering of collagen, gelatin, and elastin.</a> Biopolymers. 14, 379-391 (1975).</li><li>Pudlas, M., Koch, S., Bolwien, C., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+as+a+tool+for+quality+and+sterility+analysis+for+tissue+engineering+applications+like+cartilage+transplants.">Raman spectroscopy as a tool for quality and sterility analysis for tissue engineering applications like cartilage transplants.</a> Int. J. Artif. Organs. 33, 228-237 (2010).</li><li>Votteler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+for+the+non-contact+and+non-destructive+monitoring+of+collagen+damage+within+tissues.">Raman spectroscopy for the non-contact and non-destructive monitoring of collagen damage within tissues.</a> J. Biophotonics. , (2011).</li><li>Wold, S., Esbensen, K., Geladi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principal+component+analysis.">Principal component analysis.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 2, 37-52 (1987).</li><li>Pudlas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+Spectroscopy:+A+Noninvasive+Analysis+Tool+For+The+Discrimination+of+Human+Skin+Cells.">Raman Spectroscopy: A Noninvasive Analysis Tool For The Discrimination of Human Skin Cells.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 10, (2011).</li><li>Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Raman Spectroscopy of Biological Tissues. Applied Spectroscopy Reviews. 42, 493-541 (1080).</li><li>Pudlas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-contact+discrimination+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+and+fibroblasts+using+Raman+spectroscopy.">Non-contact discrimination of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and fibroblasts using Raman spectroscopy.</a> Medical Laser Application. 26, 119-125 (2011).</li><li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+elastic+tissue+biology:+elastin+isolation+and+purification.">Methods in elastic tissue biology: elastin isolation and purification.</a> Methods. 45, 32-41 (2008).</li><li>Downes, A., Mouras, R., Bagnaninchi, P., Elfick, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+and+CARS+microscopy+of+stem+cells+and+their+derivatives.">Raman spectroscopy and CARS microscopy of stem cells and their derivatives.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 42, 1864-1870 (2011).</li><li>Krafft, C., Dietzek, B., Popp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+and+CARS+microspectroscopy+of+cells+and+tissues.">Raman and CARS microspectroscopy of cells and tissues.</a> Analyst. 134, 1046-1057 (2009).</li><li>Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+multiphoton+imaging+of+extracellular+matrix+structures.">Non-invasive multiphoton imaging of extracellular matrix structures.</a> J. Biophotonics. 1, 451-462 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

رامان الطيفي هو أداة مناسبة لتحليل العينات البيولوجية، مثل في المختبر، مثقف الخلايا والبروتينات ECM وكذلك خلايا داخل أنسجة الأم. 11،15،16 هنا، أثبتنا أن هذا الاتصال غير، والتسمية خالية من تقنية تسمح لل تمييز أنواع مختلفة من الخلايا والكشف عن تدهور البروتين ECM التي تستند فقط على تكوين الجزيئية البيولوجية لا يتجزأ من هذه العينات البيولوجية. والميزة الرئيسية لرامان التحليل الطيفي هو القدرة على غير جراحية تحديد البصمة الحيوية لعينة من أطياف رامان الناتجة لها. وعلى النقيض من التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء، التي تعطي معلومات مماثلة، ويمكن جمع أطياف رامان من العينات المائية، كما تبعثر رامان من المياه ضعيفة. وبالإضافة إلى ذلك، يستند فقط رامان الطيفي على الكشف عن ارتداد مبعثر من ضوء أحادي اللون، وبالتالي، لم يكن يحتاج إلى تجهيز العينات قبل القياس. هذه الصفات تجعل رعالتحليل الطيفي رجل بديلا واعدا لإمكانية في تطبيقات التصوير الحي. في هذا الإطار، متماسك رامان الطيفي المضادة للستوكس (السيارات) هي تقنية مثيرة للاهتمام للغاية نظرا لأنه يتيح أسرع واكتساب أكثر حساسية من البيانات استنادا إلى إشارات الذبذبات نفسه الاستفادة منها في تجاربنا. 15،16 طرق بديلة أخرى بما في ذلك multiphoton بفعل تألق ذاتي وتم التصوير 2 جيل متناسق ثبت سابقا أن تكون مناسبة لرصد العينات البيولوجية جراحية غير أو أدنى (17). ومع ذلك، وترتبط هذه الطرائق التصوير مع التكاليف المرتفعة جدا وتقتصر على تألق ذاتي لتوليد الجزيئات. وبالإضافة إلى ذلك، مطياف رامان من السهل أن تتحد مع المجاهر البصرية التقليدية. هذه الخصائص تجعل رامان الطيفي أداة قيمة لدراسة العينات البيولوجية في البيئة الفسيولوجية. تعيين واحد من القيود الحالية المفروضة على التحليل الطيفي لدينا هو ما يصل رامانالتركيز ليزر صغير نسبيا (250 نانومتر نصف عرض كامل كحد أقصى (FWHM) الوحشي و 700 نانومتر محوري FWHM) التي يتم إنشاؤها بواسطة هدف الفتحة العددية عالية (NA = 1.2). وعلى الرغم من ارتفاع الفتحة العددية يسمح لتغطية كمية لا بأس بها من الضوء المنبعث رامان الرضوخ في نسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية، وارتفاع NA لا تنتج سوى التركيز مجموعة صغيرة داخل العينة التي عادة ما يكون أصغر بكثير من خلية. من أجل المقارنة بين أطياف رامان من الخلايا المختلفة، وجمع طائفة وممثل أمر ضروري، والتي يصعب الحصول عليها مع التركيز منطقة صغيرة. لمعالجة هذه المسألة، ونحن نعمل على عملية لأتمتة جمع إشارة عند نقاط مختلفة داخل الخلية (= رسم الخرائط الطيفية رامان)، مما أدى إلى الطيفية في المتوسط، والرضوخ لطيف وممثل. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه التقنية توفر لمحة عامة عن توزيع الفرق رامان محددة، على سبيل المثال لتوزيع البروتينات داخل الخلية. بيولعينات ogical معقدة للغاية، وتتألف من خليط غير متجانس من الجزيئات الحيوية التي تساهم في أطياف رامان والتي تم جمعها. ولذلك، فإن نمط طيفية معقدة إلى حد كبير، ورصد من نوع واحد من جزيء داخل الطيف رامان من الصعب تحقيقه مع تداخل الاشارات جزيء مختلفة. بالإضافة إلى ذلك، قد مضان الذاتية للعينة يخفي معلومات قيمة من الإشارات الضعيفة رامان. ومن المثير للاهتمام، في بعض دراساتنا السابقة، حددنا تألق ذاتي في أطياف رامان هو العامل الرئيسي الذي يفرق بين أنواع الخلايا (MSCS والخلايا الليفية) باستخدام أداة التحليل المناسبة. 13 تعرفنا أيضا أن التغيرات في كثافة إشارة رامان عموما يمكن أن تكون بمثابة مؤشرا لحالة الكولاجين وألياف الكولاجين داخل ECM منشورات صمام الشريان الأبهر. 9 ومع ذلك، كنا عند تحليل حالة الإيلاستين في هذه الأنسجة، وليس قادرا على الكشف عن نتائج مماثلة. كما ورد في النتيجةق الباب، كنا فقط قادرة على الكشف عن التعديلات من عصابات رامان محددة في عينات إيلاستاز المعالجة بالمقارنة مع الضوابط الوطنية. لم نكن نرى انخفاضا من الإشارة رامان العام في عينات إنزيمي المعالجة كما هو متوقع. أدت هذه الملاحظات في مؤامرة النقاط التي لم يكشف عن تشكيل كتلة واضح كما رأينا في الدراسة السابقة. (9) وفي المقابل، فإن تأثير المعالجة الأنزيمية كان من الممكن اكتشاف ضمن نتائج اتفاقية الشراكة والتعاون. نحن نفترض أن تقوم هذه التناقضات بين البروتينات ECM اثنين، والإيلاستين والكولاجين، وعلى الاختلافات الشكلية ومختلف عمليات تدهور الأنزيمية: ضمن نشرة صمام الشريان الأبهر، والمنطقة غنية الكولاجين (ليفي) هو طبقة المستمر الذي يصبح خففت نتيجة لل علاج الأنزيمية، حيث الإيلاستين التي تحتوي على منطقة (البطين) يحتوي على تكوين شبكة الاتصال الذي يظهر بعد التعرض للتجزئة إيلاستاز (الشكل 4). وكانت القياسات بقعة واحدة ولذلك لا اعتماداتأكلت لاكتشاف تصدعات صغيرة من هذا القبيل ضمن شبكة الإيلاستين. هنا، فإن تعيين رامان من النسيج يساعد في تحديد أعطال الشبكة. وثمة تحد آخر في رامان التحليل الطيفي للعينات البيولوجية للحد من الأوقات قياس. حل واحد هو زيادة قوة الليزر، الذي هو مناسبة طالما لا تتأثر العينات البيولوجية بواسطة ضرر الصورة. كل من تجاربنا الحالية هي إثبات صحة المبدأ الدراسات التي تركز على البحوث الأساسية، ولكن هدفنا العام هو تنفيذ رامان التحليل الطيفي للتطبيقات السريرية بما في ذلك الطب التجديدي (مثل مراقبة الجودة من الأنسجة المهندسة المنتجات)، قبل زرع مراقبة الكسب غير المشروع و سرطان التشخيص.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> إيلاستاز </td><td> ورثينجتون </td><td> LS006363 </td><td></td></tr><tr><td> المضادة للأجسام المضادة الإيلاستين </td><td> سيغما </td><td> HPA018111 </td><td> 1:75؛ العازلة سيترات </td></tr><tr><td> برنامج تلفزيوني </td><td> Lonza </td><td> 17-512F </td><td></td></tr><tr><td> أطباق زجاجية القاع </td><td> غرينر BioOne </td><td> 627860 </td><td></td></tr><tr><td> وUnscrambler </td><td> المموهة بظلال </td><td></td><td></td></tr><tr><td> أبوس </td><td> بروكر </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-contact, label-free monitoring of cells and extracellular matrix using raman spectroscopy

وهناك حاجة إلى تقنيات غير مدمرة، وعدم الاتصال والتسمية خالية من رصد الخلايا والأنسجة الثقافات في مجال البحوث الطبية الحيوية. 1-5 الأساليب الروتينية ولكن المتاحة حاليا تتطلب خطوات تجهيز وتغير سلامة العينة. رامان الطيفي هو وسيلة سريعة تمكن من قياس العينات البيولوجية من دون الحاجة لاتخاذ خطوات مزيد من المعالجة. . هذه التكنولوجيا ليزر مقرها بالكشف عن نثر غير مرن للضوء أحادي اللون 6 كما تم تعيين كل اهتزاز الكيميائية إلى الفرقة رامان محددة (متجه مموج موجه في سم -1)، كل عينة بيولوجية تحتوي على نمط نموذجي الطيفية نظرا لتركيبتها الكيميائية الحيوية الكامنة 7 - 9 ضمن أطياف رامان، وشدة ذروة ترتبط كمية من السندات الجزيئية الحالي. ويمكن الكشف عن 1 أوجه التشابه والاختلاف من مجموعات البيانات الطيفية من خلال استخدام التحليل المتعدد المتغيرات (مثل تحليل المكون الرئيسي (PCA)) 10 </suP&gt; هنا، ونحن أداء رامان الطيفي من الخلايا الحية والأنسجة الأصلية. والمصنف إما الخلايا على أطباق أسفل الزجاج أو الاحتفاظ بها في تعليق تحت ظروف طبيعية ثقافة خلية (37 درجة مئوية، ونسبة 5٪ CO 2) قبل القياس. يتم تشريح الأنسجة الأصلية وتخزينها في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في تمام الساعة 4 قياسات درجة مئوية قبل. اعتمادا على مجموعة تجريبية لدينا، فنحن ثم تركز إما على نواة الخلية أو خارج الخلية المصفوفة (ECM) البروتينات مثل الإيلاستين والكولاجين. لجميع الدراسات، ويتم قياس لا يقل عن 30 خلايا أو 30 نقطة عشوائية من الاهتمام داخل ECM. وشملت البيانات خطوات معالجة الخلفية الطرح والتطبيع.

Watch this Scientific Journal Video about Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy at JoVE.com

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

رامان الطيفي هو تقنية مناسبة للاتصال غير، تسمية خالية من تحليل الخلايا الحية، بنيات الأنسجة المهندسة وأنسجة الأم. مصدر محدد يمكن أن تتولد البصمات الطيفية وتحليلها باستخدام التحليل متعدد المتغيرات.

عدم الاتصال، تسمية خالية من رصد خلايا المصفوفة خارج الخلية، وباستخدام التحليل الطيفي رامان

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

non-contact-label-free-monitoring-cells-extracellular-matrix-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.8K Views.  Eberhard Karls University, Tübingen. رامان الطيفي هو تقنية مناسبة للاتصال غير، تسمية خالية من تحليل الخلايا الحية، بنيات الأنسجة المهندسة وأنسجة الأم. مصدر محدد يمكن أن تتولد البصمات الطيفية وتحليلها باستخدام التحليل متعدد المتغيرات.

Video: Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

قياس طولية من خارج الخلية مصفوفة جمود في 3D نماذج ورم عن طريق تتبع الجسيمات Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

وبيوشيب الكهروكيميائية استنادا ميكروفلويديك لتسمية خالية تحليل الحمض النووي التهجين

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

تقنية تسمية خالية لتصوير المكانية والزمانية لإفرازات خلية واحدة

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

تسمية خالية واحدة كشف الجزيئة عن طريق Microtoroid البصرية الرنين

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

الأنسجة الطلائية الهندسة ثلاثي الأبعاد جزءا لا يتجزأ من داخل خارج الخلية مصفوفة

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

إعداد ألياف البروتين خارج الخلية مصفوفة لBrillouin الطيفي

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

بيب على رقاقة: دراسة خالية من التسمية من التفاعلات البروتين فسفوانوسيتيد

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

اختﻻق الكلي لحاء خارج الخلية المستمدة من مصفوفة المائية

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used method, but has the drawback that it requires fluorescent labeling, which can interfere with the activity of the molecules. Also, photobleaching and photodamage are concerns. In the case of microtubules, we have found that images of similar quality to TIRF can be obtained using interference reflection microscopy (IRM). This suggests that IRM might be a general technique for visualizing the dynamics of large biomolecules and oligomers in vitro. In this paper, we show how a fluorescence microscope can be modified simply to obtain IRM images. IRM is easier and considerably cheaper to implement than other contrast techniques such as differential interference contrast microcopy or interferometric scattering microscopy. It is also less susceptible to surface defects and solution impurities than darkfield microscopy. Using IRM, together with the image analysis software described in this paper, the field of view and the frame rate is limited only by the camera; with a sCMOS camera and&#160;wide-field&#160;illumination&#160;microtubule length can be measured with precision up to 20 nm with a bandwidth of 10 Hz.&#160;

This protocol is a guide for implementing interference reflection microscopy on a standard fluorescence microscope for label-free, high-contrast, high-speed imaging of microtubules using in vitro surfaces assays.

تنفيذ مجهريانعكاس التداخل للتصوير عالي السرعة وخالٍ من الملصقات من الأنابيب الدقيقة

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Optical Trapping of Plasmonic Nanoparticles for In Situ Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Characterizations

Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) enables the ultrasensitive detection of analyte molecules in various applications due to the enhanced electric field of metallic nanostructures. Salt-induced silver nanoparticle aggregation is the most popular method for generating SERS-active substrates; however, it is limited by poor reproducibility, stability, and biocompatibility. The present protocol integrates optical manipulation and SERS detection to develop an efficient analytical platform to address this. A 1064 nm trapping laser and a 532 nm Raman probe laser are combined in a microscope to assemble silver nanoparticles, which generate plasmonic hotspots for in situ SERS measurements in aqueous environments. Without aggregating agents, this dynamic plasmonic silver nanoparticle assembly enables an approximately 50-fold enhancement of the analyte molecule signal. Moreover, it provides spatial and temporal control to form the SERS-active assembly in as low as 0.05 nM analyte-coated silver nanoparticle solution, which minimizes the potential perturbation for in vivo analysis. Hence, this optical trapping-integrated SERS platform holds great potential for efficient, reproducible, and stable molecular analyses in liquids, especially in aqueous physiological environments.

Optical Trapping of Plasmonic Nanoparticles for In Situ Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Characterizations

The present protocol describes a convenient approach to integrating optical trapping and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) to manipulate plasmonic nanoparticles for sensitive molecular detection. Without aggregating agents, the trapping laser assembles plasmonic nanoparticles to enhance the SERS signals of target analytes for in situ spectroscopic measurements.

المحاصرة البصرية للجسيمات النانوية البلازمونية لتوصيف التحليل الطيفي رامان المحسن للسطح في الموقع

Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) enables the ultrasensitive detection of analyte molecules in various applications due to the enhanced electric ...