Biz el yazması üzerine yararlı önerileri için kendi teknik destek ve Shannon Lee Layland (Fraunhofer IGB hem Stuttgart) için Steffen Koch teşekkür ederim. Bu çalışma finansal Fraunhofer-Gesellschaft ve BMBF (KS-L hem de.) Ile Çekmek programı tarafından desteklenmiştir.

1. Biyolojik Numune Hazırlanması <ol><li> Yaşayan hücrelerin hazırlanması <ol><li> Yapışmış olan hücrelerin hazırlanması <ol><li> Cam bir alt çanak (Greiner BioOne / Almanya) ve 37 bunları tasarlamak üzerine in vitro-kültür veya taze izole hücrelerinde Tohum ° C ve% 5 CO 2 hücre eki tamamlanana kadar. </li><li> Kültür ortamı çıkartın ve PBS önce ölçümü ile yavaşça üç kere yıkayın. Bütün ölçüm işlemi boyunca PBS veya hücre kültür aracı ya kaplı hücreleri tutmak. </li></ol></li><li> Süspansiyon hücrelerin hazırlanması <ol><li> Ortak bir protokol (örn. tripsin-EDTA, hücre kazıma) &#39;ye göre vitro-kültürlenmiş hücrelerde ayırmak, hücreler santrifüj edilir ve elde edilen PBS içerisinde hücre peleti veya hücre kültür ortamı yeniden askıya. </li><li> Bir cam alt çanak için: hücre süspansiyonu 100 ul (max 100.000 hücre / ml. Konsantrasyon) aktarın. </li></ol></li></ol></li><li> Nat hazırlanmasıive dokuların <ol><li> Dokuların hasat edildikten sonra, 4 ° C&#39;de veya buz önce ölçümü 12 saatten daha steril, buz gibi soğuk PBS aktarmak ve artık onları tutun. Önceki deneyler uzun bir depolama süresi (4 ° C&#39;de soğuk iskemi zamanı&gt; 12 saat) doğal bozunma süreçleri nedeniyle spektral değişikliklere sebep olduğunu göstermiştir. </li><li> Ölçümler doku kurutma sonucu ECM proteinleri ve hücre hasarı önlemek için PBS veya orta kaplı doku ile gerçekleştirilmesi gerekir. </li></ol></li></ol> 2. Raman Spektrometresi Bizim özel Raman spektroskopisi Raman parlak alan ve floresan görüntülerin doğrudan karşılaştırma sağlayan bir Raman spektrometresi ile standart bir floresan mikroskop (Olympus IX 71) birleştirir. Temel set up 784 nm diyot laser (Toptica fotonik AG / Almanya), eksitasyon ışıktan Raman-dağınık ışık ayrılması için bir çentik filtresi, bir mikroskop, bir oluşurnd bir spektral bilgi (Yumuşak Görüntüleme Sistemleri / Almanya F-görüntülemek) tespiti için optimize edilmiş bir şarj bağlı cihaz (CCD kamera) ile spektrograf (Kaiser Optik Sistemleri A.Ş., Ann Arbor / Amerika). 3. Lazer Fonksiyon Kontrolü <ol><li> Yazılım Andor Solis (Andor / Birleşik Krallık) başlatın ve -60 CCD kamera sıcaklığını ayarlamak ° C kamera ısının neden akımların neden olduğu gürültüyü en aza indirmek için. </li><li> Kalibrasyon işlemi için mikroskop sahnede bir silikon yerleştirin. </li><li> Üzerine lazer açın ve gücü 85 mW ayarlanır. </li><li> XY görünene kadar gofret üzerine lazer odaklanmak için yazılım Hücre B (Olympus / Almanya) kullanın. </li><li> Bir 60x hava objektif kullanarak 1 sn tek bir entegrasyon süresi ile silikon ölçün. </li><li> Piksel sayısından Andor Solis yazılım Raman shift (cm -1) x-ekseninin birimini değiştirin. </li><li> 520 cm -1 silikon tepe lazer odak VaryBu Raman bandı için mümkün olan maksimum yoğunluğu bulmak için spektrum toplanır. Sayıları minimum tutar başarılı bir kalibrasyon için 11.000 &#39;den yüksek olmalıdır. </li></ol> 4. Raman Spektroskopik Ölçümler Tüm ölçümler oda sıcaklığında yapılır. <ol><li> Temel ayarlar <ol><li> Örneklerin spektrum toplamak için 1.2 sayısal bir diyafram ile 60x suya daldırma nesnel (Olympus / Almanya) kullanın. </li><li> Ölçümleri başına 100 saniye olmak üzere toplam 10 entegrasyonlar / 10 saniye satın ayarlarını değiştirin. </li></ol></li><li> Yapışkan hücreler ölçümü <ol><li> Hücreleri ile cam alt çanak alın ve mikroskop sahne üzerine yerleştirin. </li><li> Daha iyi bir sinyal almak ve tekrarlanabilirliği sağlamak, hücre çekirdeğinin üzerine lazer odaklanmak için, mikroskop ışık kapatın ve spektrum toplamaya başlar. </li><li> Arka e bir referans spektrumu ölçünHücrenin yanında lazer odak hareket ettirerek çok 10 spektrumları. Bu odak değiştirirken yeni bir arka plan her odak derinliği için toplanan gerektiğini dikkate almak önemlidir. </li></ol></li><li> Süspansiyon hücreleri Ölçümü <ol><li> Cam alt kabına hücre süspansiyonu 100 ul aktarın ve mikroskop sahneye yerleştirin. </li><li> Hücrenin merkezinde lazer odaklanın, mikroskop ışık kapatın ve spektrum toplamaya başlar. </li><li> Hücrenin yanında lazer odak hareket ettirerek arka planda bir referans spektrumu her 10 spektrumları ölçün. Odak değiştirirken, yeni bir arka plan yeni odak derinliği için toplanan gerekir. </li></ol></li><li> Yerli dokuların Ölçümü <ol><li> Örnek al ve cam bir alt tabak içine yerleştirin. Faiz getirisi (ROI) bölgesi tabağın tabanına dönük odaklı olmalıdır. </li><li> Örnek karşılamak için yeterli PBS ile çanak doldurun. </li><li> Herhangi mov önlemek için numune üzerinde cam bir kapakla yerleştirinölçümler sırasında numunenin ement. </li><li> Faiz yapısına lazer odağı ayarlayın (derinlik çözünürlüğü lazer ve doku bağımlı) ve spektrumları toplamaya başlar. </li><li> Bütün doku alanının lazer dışarı odaklanmak hareket ettirerek arka planda bir referans spektrumu her 10 spektrumları toplayın. Odak değiştirirken, yeni bir arka plan yeni odak derinliği için toplanan gerekir. </li></ol></li><li> Immünfloresan ölçümü (IF) etiketli cryosections <ol><li> Standart bir cryotom ve silis kaplı kapak gözlük takar kullanarak Bölüm taze, ek dondurulmuş doku örnekleri. </li><li> Sadece kısa bir fiksasyon adım (% 4 paraformaldehit ile en fazla 10 dakika) istihdam ve faiz protein tespiti için uygun antikorları kullanarak, IF için rutin bir protokolü takip cryosections Leke. </li><li> Floresans meydana alanda odaklanarak Raman ölçümleri gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Elastin bozulması deneyler <ol><li> Place cam alt tabağın tabanına dönük disseke domuz aort kapakçık (elastin açısından zengin, kalp kapak broşürün kan akışını tarafı katmanı) ventricularis. </li><li> Fibril yapıları odaklanarak bütün doku yüzeyi boyunca 30 rastgele noktalarda bir &#39;non-İnkübe kontrolü&#39; olarak doğal dokuya ölçün. </li><li> 3 bölüme örnek bölün ve bir elastaz çözüm (5 U / ml, Worthington / Almanya) 2 ml ile dolu ayrı 2,5 ml Eppendorf tüpler içine koyun. </li><li> 37, 15 ya da 30 dakika ya için doku inkübe ° C. </li><li> 15 ya da 30 dakika inkübasyondan sonra ya için, Eppendorf tüpüne gelen doku kaldırmak ve tamamen enzimatik reaksiyonu durdurmak için PBS ile dikkatle yıkanır. </li><li> Fibril yapıları odaklanarak, 30 rastgele noktalarda her bir örnek ölçün. </li></ol></li></ol> 5.. Veri İşleme ve Analizi <ol><li> Raman işleme Bir ön-muameleoluşturulan spektrumları OPUS yazılım (Bruker Optik GmbH / Almanya) kullanılarak yapıldı. <ol><li> Ölçümler sırasında odak değişikliklere neden olduğu farklılıklar önlemek için cam ve orta yanı sıra ile müdahale sinyalleri azaltmak amacıyla, alınan spektrumları karşılık gelen arka tayfı çıkarılır. </li><li> Bilgi en yüksek miktar sunuyor 400-1800 cm -1 arasında wavenumber bölgeye spektrumları azaltın. </li><li> Gerekirse, maksimum pik için spektrumları normalleştirmek. Örnek spektrumu yapısal değişikliklerin saptanması basitleştirilmesi yoğunluk dalgalanmaları ve sistematik arızaları, dışarı Normalizasyon faktörler. </li><li> Farklı deneyler arasındaki karşılaştırılabilirlik artırmak için temel bir düzeltme yapın. </li></ol></li><li> Raman analizi Raman Unscrambler (CAMO / Norveç) yazılımı ile PCA kullanılarak analiz edildi. Bu değişkenli analizde spektral verilerin içinde benzerlik ve farklılıkları algılarsetleri. Her spektrum her Raman vardiya toplanan sayıları dayalı çok boyutlu bir uzayda tek bir nokta olarak çizilir. Her bir temel bileşen (PC), orijinal veri içerdiği toplam bilgi belli bir miktar açıklanmaktadır. Birinci bilgisayar varyasyon yüksek kaynağı içeren biridir. Her aşağıdaki PC, sırayla, bir öncekine göre daha az bilgi içerir. Her değişkenin her PC&#39;de bir puan ve bir yükleme var. PC&#39;ler (= puan) çizerek, önemli bir örnek korelasyon gösterilebilir. Yüklemeler PCA her analiz değişkenin katkıları açıklayınız. <ol><li> Her örneklem grubu için satır aralıkları oluşturarak ölçümler her grup etiketleyin. </li><li> PCA için aşağıdaki temel ayarları kullanın: çapraz doğrulama, NIPALS algoritması, hiçbir rotasyon ve analizi başlatın. Bu ayarlar spektrumları bağlıdır. </li><li> PCA gerçekleştirin. </li></ol></li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Raman spyapışık hücrelerinden oluşturulan ectra genellikle düşük sinyal-gürültü oranı ve düşük bir genel sinyal yoğunluğu (Şekil 1) lazer odak cam altında, müdahale etkisi yakın duzenlenmeli olması nedeniyle. 11 ortaya cam sinyali gerçek örnek sinyal maskeleme neden oldukça yüksektir. Bir sonraki geri çıkarma sırasında Bu nedenle, örneğin sinyal minimize olabilir veya hatta ortadan kaldırılmıştır. Onlar daha detaylı spektral bilgi algılanmasına izin olarak Böylece, biz, bizim Raman spektroskopik analiz için süspansiyon hücreleri kullanmayı tercih eder. Bununla birlikte, yapışık ve süspansiyon hücreleri spektrumları, sadece kendi yoğunluklarındaki farklı aynı temel zirveleri sergilerler. Bir süspansiyon içinde farklı hücre tiplerinin karakterizasyonu için, herhangi bir ön-muamele gereklidir. Süspansiyon ölçülen ortalama Raman ve insan fibroblastlar, mezenkimal kök hücreler (MKH), kondrosit ve keratinositlerin standart sapma olarakŞekil 2 içinde gösterildiği. Bütün Raman benzer zirveleri (bkz. Tablo 1) protein, nükleik asit ve lipidler gibi tipik biyomoleküllerin menşeyli, yapılandırılmıştır. Bu hücre türleri için 12, 600 ve 1800 cm -1 en ilgili spektral bilgi içeren arasındaki spektral bölgede tarafından hangi belirgin farklılıklar farklı hücre tipleri (Şekil 2A) arasında algılanabilen edilir. Örnek, biz kollajen ve lipid moleküler titreşimler atanabilir olduğunu açıkça yapısal farklılıklar sergileyen bir spektral bölgede (1280-1350 cm -1) vurgulanır. Buna karşılık, morfolojik analizler çoğu hücrelerin tanımlanması ve ayrım (Şekil 2B-I) için uygun değildir. Kondrosit ve cilt hücreleri arasındaki fark (Şekil 2B, H karşı B, F ve E, I) gözlemlenebilir edilirken, fibroblast ve MKH sadece parlak alan micrsoc kullanarak ayırmak zorduropyala (Şek. 2B, F karşılık C, G). 13 Özellikle ECM proteinleri doğal dokuya, Raman spektroskopik analizi ROI ilgili yapısına odaklanmak edebilmek için, parlak alan görüntüleme ile görülebilmesi gerektirir. Belirli bir parmak izi spektrumu için bir proteinin atama için, piyasada bulunan saf protein ve immunohistologically lekeli cryosections arasında Raman oluşturulur. Burada, liyofilize elastin ve elastin karşı bir antikor istihdam immünfloresan lekeli cryosections karşılaştıran doğal dokuların içinde elastik liflerin parmak izi spektrumları belirledi. Elastin Raman yansıyan bir yüksek otofloresansı, özellikleri beri Ancak, veri analizi (Şekil 3A) zordur. Nedeniyle bu tür otofloresansı, veri kümelerinin uygun bir işleme gibi örnek özgü özellikleri sistematik başarısızlığı azaltmak için önemlidir. Bizim veriler biralyses, biz saf elastin protein anlamlı olarak daha yüksek sinyal yoğunluğu ortadan kaldırmak için normalleşme kullanılır ve bu nedenle, biz (Şekil 3B) karşılaştırılabilir Raman oluşturmak başardık. Elastin vücutta en istikrarlı ECM ​​proteinleri biridir ve aşağılamak için bu nedenle çok zordur. Bizim deneysel set up yılında 14, biz bir enzimatik sindirimi gerçekleştirerek sağlıklı domuz aort kapakçık elastin bozulmaya bağlı. Çok değişkenli analiz PCA uygulamak, biz enzimatik tedavi edilen örnekleri ve yerel denetimleri (Şekil 3C) ve Raman arasında önemli farklılıklar tespit edilmiştir. Bu spektral farklar 861, 1003 ve 1664 cm -1 yükleme spektrumda gözlendi. Elastaz için uzun pozlama süreleri nedeniyle elastin lifleri içeren Beklenen yapısal değişiklikler de daha belirgin ayrılabilir skoru kümeler yansıdı HART Kullanıcı boyama (Şekil 4), (Şekil 3C) tarafından gösterildi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig1.jpg" /> Şekil 1. Müstakil ve yapışık fibroblastların Raman ortalama. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig2.jpg" /> Şekil 2. (A) Raman ve dört farklı ilköğretim izole hücre tipleri (fibroblastlar, MKH, kondrosit ve keratinositler) ve standart sapmalar. Yapısal farklılıklar ile 1350 cm -1 - çerçeve 1280 spektral bölgede vurgulamaktadır. Müstakil (B) fibroblast (BE) Parlak alan görüntüleri, (C) MKH, (D) kondrosit ve (E) keratinositler. Ölçek bar 20 mikron eşittir. Yapışık (F) fibroblast (FI) Parlak alan görüntüleri, (G) MKH, (H) kondrosit ve (I) keratinositler. Ölçek bar 200 mikron eşittir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig3.jpg" /> Şekil 3. Lyophili normalleşme olmadan (A) Ramanzed elastin (mavi çizgi), immünofloresan (IF) etiketli cryosections (turuncu çizgi) ve nativ aort kapakçık içinde ölçülen elastik lifler (kırmızı çizgi). Liyofilize elastin yüksek sinyal yoğunluğu otofloresans kaynaklanır. Normalleştirme sonrası (B) Raman sistemik hataları ortadan kaldırmak için. (C) skorları ve arıtılmamış kontrolü (kırmızı) ve enzimatik-bozulmuş (mavi ve yeşil) doğal doku içinde elastik lifler arasında karşılaştırma yükleri. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3977/3977fig4.jpg" /> Şekil 4. HART&#39;s lekeli domuz aort kapakçık. Elastik lifler siyah canlandırırlar. (A) ve (B) arıtılmamış kontrolü ve (C) ve (D) 30 dakika boyunca elastin-bozundurucu enzimi elastaz maruz bırakıldı doku örnekleri tasvir göstermektedir. <table border="1"><tbody><tr><td> Cm -1 wavenumber </strong&gt; </td><td colspan="2"> Atama 12 </td></tr><tr><td> 717-719 </td><td> CN </td><td> Fosfolipidler </td></tr><tr><td> 785-788 </td><td> DNA / RNA bazları, OPO omurgası </td><td> DNA / RNA </td></tr><tr><td> 1003 - 1005 </td><td> Fenilalanin </td><td> Protein </td></tr><tr><td> 1220-1280 </td><td> Amid III </td><td> Protein </td></tr><tr><td> 1445-1447 </td><td> CH2 </td><td> Protein / Lipid </td></tr><tr><td> 1655-1680 </td><td> Amid IC = C </td><td> Protein Lipid </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Bütün hücre tipleri (fibroblastlar, MKH, kondrosit ve keratinositler) spektrumu içinde algılanır Raman bantları.

<ol>
	<li>Chan, J. W., Lieu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biochemical+characterization+of+stem+cells+using+vibrational+spectroscopy.">Label-free biochemical characterization of stem cells using vibrational spectroscopy.</a> J. Biophotonics. 2, 656-668 (2009).</li><li>Downes, A., Mouras, R., Elfick, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+spectroscopy+for+noninvasive+monitoring+of+stem+cell+differentiation.">Optical spectroscopy for noninvasive monitoring of stem cell differentiation.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2010, 101864-101864 (2010).</li><li>Gentleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+materials+differences+revealed+in+engineered+bone+as+a+function+of+cell-specific+differentiation.">Comparative materials differences revealed in engineered bone as a function of cell-specific differentiation.</a> Nat. Mater. 8, 763-770 (2009).</li><li>Notingher, I., Hench, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+microspectroscopy:+a+noninvasive+tool+for+studies+of+individual+living+cells+in+vitro.">Raman microspectroscopy: a noninvasive tool for studies of individual living cells in vitro.</a> Expert. Rev. Med. Devices. 3, 215-234 (2006).</li><li>Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+preservation+of+extracellular+matrix+in+cardiac+tissues:+implications+for+long-term+graft+durability.">Optimized preservation of extracellular matrix in cardiac tissues: implications for long-term graft durability.</a> Ann. Thorac. Surg. 83, 1641-1650 (2007).</li><li>Raman, C. V., Krishnan, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+type+of+secondary+radiation.">A new type of secondary radiation.</a> Nature. 122, 12 (1928).</li><li>Frushour, B. G., Koenig, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+scattering+of+collagen,+gelatin,+and+elastin.">Raman scattering of collagen, gelatin, and elastin.</a> Biopolymers. 14, 379-391 (1975).</li><li>Pudlas, M., Koch, S., Bolwien, C., Walles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+as+a+tool+for+quality+and+sterility+analysis+for+tissue+engineering+applications+like+cartilage+transplants.">Raman spectroscopy as a tool for quality and sterility analysis for tissue engineering applications like cartilage transplants.</a> Int. J. Artif. Organs. 33, 228-237 (2010).</li><li>Votteler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+for+the+non-contact+and+non-destructive+monitoring+of+collagen+damage+within+tissues.">Raman spectroscopy for the non-contact and non-destructive monitoring of collagen damage within tissues.</a> J. Biophotonics. , (2011).</li><li>Wold, S., Esbensen, K., Geladi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principal+component+analysis.">Principal component analysis.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 2, 37-52 (1987).</li><li>Pudlas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+Spectroscopy:+A+Noninvasive+Analysis+Tool+For+The+Discrimination+of+Human+Skin+Cells.">Raman Spectroscopy: A Noninvasive Analysis Tool For The Discrimination of Human Skin Cells.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 10, (2011).</li><li>Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Raman Spectroscopy of Biological Tissues. Applied Spectroscopy Reviews. 42, 493-541 (1080).</li><li>Pudlas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-contact+discrimination+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+and+fibroblasts+using+Raman+spectroscopy.">Non-contact discrimination of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and fibroblasts using Raman spectroscopy.</a> Medical Laser Application. 26, 119-125 (2011).</li><li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+elastic+tissue+biology:+elastin+isolation+and+purification.">Methods in elastic tissue biology: elastin isolation and purification.</a> Methods. 45, 32-41 (2008).</li><li>Downes, A., Mouras, R., Bagnaninchi, P., Elfick, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopy+and+CARS+microscopy+of+stem+cells+and+their+derivatives.">Raman spectroscopy and CARS microscopy of stem cells and their derivatives.</a> Journal of Raman Spectroscopy. 42, 1864-1870 (2011).</li><li>Krafft, C., Dietzek, B., Popp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+and+CARS+microspectroscopy+of+cells+and+tissues.">Raman and CARS microspectroscopy of cells and tissues.</a> Analyst. 134, 1046-1057 (2009).</li><li>Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+multiphoton+imaging+of+extracellular+matrix+structures.">Non-invasive multiphoton imaging of extracellular matrix structures.</a> J. Biophotonics. 1, 451-462 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Raman spektroskopisi doğal dokuların içinde in vitro-kültür hücreleri ve ECM proteinleri gibi hücrelerde gibi biyolojik örnekler, analiz için uygun bir araçtır. Burada 11,15,16, biz bu temassız, etiket serbest teknik olanak gösterdi farklı hücre tipleri ayrımcılık ve sadece bu biyolojik örneklerin içsel biyomoleküler bileşimine dayalı ECM protein yıkımı tespiti. Raman spektroskopisi büyük avantajı, non-invaziv bundan kaynaklanan Raman tarafından örnek bir biyokimyasal parmak izi ölçmek yeteneğidir. Benzer bilgiler verir kızılötesi spektroskopi, aksine, Raman zayıf su Raman saçılma olarak, sulu örneklerinden derlenen edilebilir. Buna ek olarak, Raman spektroskopisi, sadece tek renkli ışık saçılma tespit dayanmaktadır, bu nedenle, herhangi bir örnek işleme önceden ölçülmesi gereklidir. Bu nitelikler Ra yapmakin vivo görüntüleme uygulamaları potansiyel man spektroskopisi umut verici bir alternatif. Daha hızlı ve deneylerde kullanılan aynı titreşim sinyalleri dayalı verilerin daha duyarlı toplanmasını sağlayan beri bu gelince, tutarlı bir anti-Stokes Raman spektroskopisi (CARS) çok ilginç bir tekniktir. Multiphoton bağlı otofloresans dahil 15,16 Diğer alternatif yöntemler ve ikinci harmonik üretimi görüntüleme daha önce 17 Bununla birlikte, bu görüntüleme yöntemlerinin çok yüksek maliyetler ile ilişkilidir. olmayan veya minimal invazif biyolojik örneklerin izlenmesi için uygun olduğu kanıtlanmıştır ve otofloresans üreten molekülleri ile sınırlıdır. Buna ek olarak, Raman spektrometresi konvansiyonel optik mikroskop ile birleştirmek için kolaydır. Bu özellikler Raman spektroskopisi fizyolojik ortamlarda biyolojik örnekleri çalışmak için değerli bir araç haline getiriyor. Bizim Raman spektroskopisi mevcut kısıtlamalara biri kurmakyüksek sayısal açıklık objektif (NA = 1.2) tarafından oluşturulan nispeten küçük lazer odak (250 nm tam genişlikte yarı maksimum (FWHM) lateral ve 700 nm FWHM eksenel). Yüksek sayısal açıklık yüksek sinyal-gürültü oranı veren yayılan Raman ışık iyi bir miktar kapsayacak olanak sağlasa da, yüksek NA tipik bir hücre daha küçük örneklem içinde sadece küçük bir toplama odak üretir. Farklı hücre Raman karşılaştırmak amacıyla, temsili bir spektrum toplama küçük bir odak alanı ile elde edilmesi zor olan, esastır. Bu sorunu gidermek için, ortalama ve temsili bir spektrum veren bir spektral sonuçlanan hücre içerisinde farklı noktalarda (= Raman spektroskopisi haritalama), az sinyal toplama otomatikleştirmek için bir süreç üzerinde çalışıyoruz. Buna ek olarak, bu yöntem, bir hücre içinde proteinin dağılımının, örneğin belirli Raman gruplarından dağılımının bir özetini temin edecektir. Biological örnekleri derece karmaşıktır ve toplanan Raman katkı biyomoleküllerin heterojen bir karışım oluşur. Bu nedenle, spektral desen derece karmaşıktır ve bir Raman spektrumu içinde bir molekülün bir tek tip izleme farklı molekül sinyalleri ile birlikte üst üste binen başarmak zordur. Ayrıca, örnek intrinsik floresans zayıf Raman sinyallerinin değerli bilgiler maskeleyebilir. İlginçtir, önceki bazı çalışmalarda, biz uygun bir analiz aracı kullanarak hücre tipleri (MKH ve fibroblastlar) arasındaki en önemli ayırıcı faktör olarak Raman otofloresan belirlendi. 13 Biz de genel Raman sinyal yoğunluğundaki değişiklikler olarak hizmet verebildiğini tespit kollajen ve aort kapak broşür ECM içinde kollajen liflerinin durumu için bir gösterge. 9 Ancak, bu dokularda elastin devlet değerlendirirken, benzer sonuçlar tespit edemedik. Sonuç olarak bahsedilens bölümünde, sadece yerli kontrollerle karşılaştırıldığında elastazı verilen örneklerinde spesifik Raman bantların değişiklikler tespit edebildi. Biz beklendiği gibi enzimatik tedavi örneklerinde genel Raman sinyalinin bir azalma görmedim. Bu gözlemler, önceki çalışmada görüldüğü gibi net bir kümelenme oluşumu vermedi.Bu bir puan komplo sonuçlandı. Aksine 9, enzimatik tedavi etkisi PCA sonuçları içinde algılanabilen edildi. Biz iki ECM proteinleri, elastin ve kolajen arasındaki bu farklılıklar morfolojik farklılıklar ve farklı enzimatik yıkım süreçleri dayalı olduğunu varsayalım: aort kapak broşürün içinde, kollajen zengin bölgesi (fibröz) nedeniyle gevşeyen için olur sürekli bir tabakadır enzimatik tedavisinde, bu sayede bölgesi (ventricularis) içeren elastin elastaz maruz (Şekil 4) sonra parçalanır görünen bir ağ konfigürasyona sahiptir. Tek nokta ölçümleri bu appropri değildielastin ağı içinde böyle küçük kopmalar tespit yedik. Burada, bir doku Raman haritalama ağ arıza belirlenmesine yardımcı olacaktır. Biyolojik örneklerin Raman spektroskopisi bir başka zorluk ölçüm zamanlarında azaltmaktır. Bir çözüm biyolojik örnekler foto-hasarı etkilenmediği sürece uygun lazer gücü, artırmaktır. Mevcut deneylerin tüm temel araştırma odaklanan proof-of-prensibi çalışmalar olmakla birlikte, bizim genel amacı, rejeneratif tıp (doku mühendisliği ürünlerinin örneğin kalite kontrolü), ön nakli greft izleme ve dahil olmak üzere klinik uygulamalar için Raman spektroskopisi uygulamaktır kanser teşhisi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> elastaz </td><td> Worthington </td><td> LS006363 </td><td></td></tr><tr><td> anti-elastin antikor </td><td> Sigma </td><td> HPA018111 </td><td> 1:75, sitrat tamponu </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Lonza </td><td> 17-512F </td><td></td></tr><tr><td> Cam alt yemekleri </td><td> Greiner BioOne </td><td> 627860 </td><td></td></tr><tr><td> Unscrambler </td><td> CAMO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Opus </td><td> Bruker </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-contact, label-free monitoring of cells and extracellular matrix using raman spectroscopy

Hücre ve doku kültürleri izlemek için tahribatsız, temassız ve etiket içermeyen teknolojilerin biyomedikal araştırma alanında ihtiyaç vardır. 1-5 Ancak, şu anda rutin işleme yöntemleri gerektiren adımları ve örnek bütünlüğünü değiştirebilir. Raman spektroskopisi daha fazla işlem adımı için gerek olmaksızın biyolojik örneklerde ölçüm sağlar hızlı bir yöntemdir. . Bu lazer tabanlı teknoloji monokromatik ışık inelastik saçılma algılar 6 her kimyasal titreşim belirli bir Raman bant (cm -1 dalga sayısı) atanan gibi, her biyolojik örnek kendi içsel biyokimyasal bileşimi nedeniyle tipik bir spektral desen özellikleri 7. - Raman içinde 9, pik şiddetlerini mevcut moleküler bağlar miktarı ile ilişkilidir. 1 Benzerlikler ve spektral veri kümelerinin farklılıkları çok değişkenli bir analiz (örneğin temel bileşenler analizi (PCA)) kullanılarak tespit edilebilir. 10 </sup&gt; Burada, canlı hücreler ve doğal dokuların Raman spektroskopisi gerçekleştirin. Hücreler iki cam alt tabaklarının üzerine ekildi veya normal hücre kültürü koşulları altında süspansiyon muhafaza (37 ° C&#39;de,% 5 CO2) ölçümü önce uygulanır. Doğal dokular 4 ° C de önceden ölçümleri (PBS) tamponlu tuzlu kesilir ve fosfat içinde depolanır. Bizim deney seti kadar bağlı, biz sonra da hücre çekirdeğinde veya elastin ve kollajen gibi ekstrasellüler matriks (ECM) proteinleri üzerine odaklanmıştır. Tüm çalışmaları için, 30 hücreleri veya ECM içinde ilgi 30 rastgele noktaları en az ölçülür. Veri işleme adımları arka plan çıkarma ve normalleşme dahildir.

Watch this Scientific Journal Video about Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy at JoVE.com

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Raman spektroskopisi temassız için uygun bir tekniktir, canlı hücreler, doku mühendisliği yapıları ve doğal dokuların etiket ücretsiz analizidir. Kaynak özgü spektral parmak izi oluşturulur ve çok değişkenli analiz kullanılarak analiz edilebilir.

Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

non-contact-label-free-monitoring-cells-extracellular-matrix-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.8K Görüntüleme.  Eberhard Karls University, Tübingen. Raman spektroskopisi temassız için uygun bir tekniktir, canlı hücreler, doku mühendisliği yapıları ve doğal dokuların etiket ücretsiz analizidir. Kaynak özgü spektral parmak izi oluşturulur ve çok değişkenli analiz kullanılarak analiz edilebilir.

Video: Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

Partikül izleme Microrheology kullanarak 3D Tümör Modelleri Ekstrasellüler Matriks Rijitliğinin Boyuna Ölçümü

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Biyomühendislik

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Etiket-serbest DNA Hibridizasyon Analiz için mikroakışkan tabanlı Elektrokimyasal Biochip

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

Tek Hücre Salgıları uzay-zamansal Görüntüleme için bir etiket içermeyen Tekniği

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Microtoroid Optik Rezonatörler Kullanarak Etiket serbest Tek Molekül Algılama

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.

Brillouin Spektroskopisi için Ekstraselüler Matriks Proteini Elyaf Hazırlama

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Bir böbrek korteks ekstraselüler matrisi elde edilen hidrojel imalatı

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used method, but has the drawback that it requires fluorescent labeling, which can interfere with the activity of the molecules. Also, photobleaching and photodamage are concerns. In the case of microtubules, we have found that images of similar quality to TIRF can be obtained using interference reflection microscopy (IRM). This suggests that IRM might be a general technique for visualizing the dynamics of large biomolecules and oligomers in vitro. In this paper, we show how a fluorescence microscope can be modified simply to obtain IRM images. IRM is easier and considerably cheaper to implement than other contrast techniques such as differential interference contrast microcopy or interferometric scattering microscopy. It is also less susceptible to surface defects and solution impurities than darkfield microscopy. Using IRM, together with the image analysis software described in this paper, the field of view and the frame rate is limited only by the camera; with a sCMOS camera and&#160;wide-field&#160;illumination&#160;microtubule length can be measured with precision up to 20 nm with a bandwidth of 10 Hz.&#160;

This protocol is a guide for implementing interference reflection microscopy on a standard fluorescence microscope for label-free, high-contrast, high-speed imaging of microtubules using in vitro surfaces assays.

Microtubules etiketi içermeyen, yüksek hızlı görüntüleme için girişim Reflection Microkopi uygulanması

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Optical Trapping of Plasmonic Nanoparticles for In Situ Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Characterizations

Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) enables the ultrasensitive detection of analyte molecules in various applications due to the enhanced electric field of metallic nanostructures. Salt-induced silver nanoparticle aggregation is the most popular method for generating SERS-active substrates; however, it is limited by poor reproducibility, stability, and biocompatibility. The present protocol integrates optical manipulation and SERS detection to develop an efficient analytical platform to address this. A 1064 nm trapping laser and a 532 nm Raman probe laser are combined in a microscope to assemble silver nanoparticles, which generate plasmonic hotspots for in situ SERS measurements in aqueous environments. Without aggregating agents, this dynamic plasmonic silver nanoparticle assembly enables an approximately 50-fold enhancement of the analyte molecule signal. Moreover, it provides spatial and temporal control to form the SERS-active assembly in as low as 0.05 nM analyte-coated silver nanoparticle solution, which minimizes the potential perturbation for in vivo analysis. Hence, this optical trapping-integrated SERS platform holds great potential for efficient, reproducible, and stable molecular analyses in liquids, especially in aqueous physiological environments.

Optical Trapping of Plasmonic Nanoparticles for In Situ Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Characterizations

The present protocol describes a convenient approach to integrating optical trapping and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) to manipulate plasmonic nanoparticles for sensitive molecular detection. Without aggregating agents, the trapping laser assembles plasmonic nanoparticles to enhance the SERS signals of target analytes for in situ spectroscopic measurements.

In Situ Yüzey Geliştirilmiş Raman Spektroskopisi Karakterizasyonları için Plazmonik Nanopartiküllerin Optik Yakalanması

Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) enables the ultrasensitive detection of analyte molecules in various applications due to the enhanced electric ...