نحن نعترف بامتنان جميع أعضاء مختبرنا ومركز علم الأحياء النظام المتكامل للشيخوخة والتغذية (CISBAN) للحصول على الدعم ومناقشات مفيدة. وأيد هذه الدراسة عن طريق البحث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية المجلس (BBSRC) (BB/C008200/1) ويلكوم ترست (075294، 093088).

<ol>
	<li>Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Fitness+Analysis+shows+that+NMD+proteins+and+many+other+protein+complexes+suppress+or+enhance+distinct+telomere+cap+defects.">Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects.</a> PLoS Genetics. 7 (4), e1001362 (2011).</li><li>Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomewide+suppressor+and+enhancer+analysis+of+cdc13-1+reveals+varied+cellular+processes+influencing+telomere+capping+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 180, 2251-2266 (2008).</li><li>Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonyzer:+automated+quantification+of+micro-organism+growth+characteristics+on+solid+agar.">Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar.</a> BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).</li><li>Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Bellay, J., Kim, Y., Spear, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li><li>Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+growth+rate+in+high-throughput+growth+phenotyping.">Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22 (1), 94-102 (2011).</li><li>Maringele, L., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EXO1-dependent+single-stranded+DNA+at+telomeres+activates+subsets+of+DNA+damage+and+spindle+checkpoint+pathways+in+budding+yeast+yku70&#916;mutants.">EXO1-dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70&#916;mutants.</a> Genes and Dev. 16 (15), 1919-1933 (2002).</li><li>Warringer, J., Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+in+environmental+arrays+allows+analysis+of+quantitative+phenotypic+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20, 53-67 (2003).</li><li>Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320 (5874), 362-365 (2008).</li><li>Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+Genomic+Screens+of+Barcoded+Yeast+Libraries.">Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries.</a> J. Vis. Exp. (54), e2864 (2011).</li><li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants.">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li><li>Queller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+ecology:+The+social+side+of+wild+yeast.">Behavioural ecology: The social side of wild yeast.</a> Nature. 456, 589-590 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

QFA هو في كثير من الحواس مباشرة من نسل ثلاث تقنيات مقاعد البدلاء النطاق أنشئت الميكروبيولوجية: ثقافة الاختبارات بقعة تخفيف سلسلة 9، نمو تحديد منحنى في الثقافات الغازية السائلة (9) وطبق الطلاء 13. وتتلخص هذه الأساليب الثلاثة، وبالمقارنة مع QFA وغيرها من تقنيات عالية الإنتاجية في الجدول رقم 2. في حين أن اختبارات تخفيف بقعة سلسلة تعريف اللياقة البدنية سلالة كما قدرتها على تشكيل مستعمرات في سلسلة من الثقافات نمت من مجموعة من التخفيفات اللقاح، QFA اللياقة البدنية سلالة التدابير الملاحظات المتكررة من ثقافة واحدة لبناء منحنى النمو. قياس اللياقة البدنية من ثقافات واحد يسمح للفحص سلالات كثيرة في وقت واحد، في ظل ظروف مماثلة. صفائف تكرار للثقافات يسمح التجارب المتكررة لمجموعات الضغط، من المفيد للغاية عند اختبار اللياقة البدنية للاختلافات الثقافية في بيئات مختلفة أو خلفيات وراثية. قدم بروتوكول QFAهنا يستخدم معدات آلية مكلفة لتكرار، تطعيم، واحتضان لوحات أجار صورة، مناسبة لمراقبة نمو الآلاف من الثقافات المستقلة (QFA الروبوتية، الجدول 2). ومع ذلك، منذ يستند على QFA الراسخة، وتقنيات مختبر التقليدية، فإنه يمكن أيضا أن تنفذ أكثر من ذلك بكثير بأسعار رخيصة عن طريق الاستعاضة عن مساعدة الروبوت مع الخطوات اليدوية (دليل QFA، الجدول 2). دليل QFA ينطوي على تكرار وتلقيح الثقافات على لوحات أجار باستخدام أداة دبوس دليل ودليل نقل لوحات من وإلى حاضنة للتصوير الفوتوغرافي. ويمكن تطبيق نفس التحليل سير العمل الحسابية لتوليد منحنيات النمو سواء من التصميم التجريبي. QFA تقديرات لياقة بدنية ويبدو أن يكون دقيقا نسبيا. في الشكل (4)، ويسلط الضوء على اللياقات متوسط ​​مجموعات سبيل المثال أربعة من الحذف وظيفيا الجينات ذات الصلة. على مقربة من أعضاء كل فئة الجينات المرتبطة وظيفيا في اثنين من استقلالخلفيات والأنف والحنجرة وراثية (ura3Δ وcdc13 1) يدل على استنساخ من التقديرات لياقة بدنية QFA. على سبيل المثال، والحذف الجين فقط 3 (من أصل 4300 أمكن) فصل ثلاثة من أعضاء مجمع MRX حفظها. الإنتاجية العالية لبدائل QFA لاختبار خصائص نمو السلالات الميكروبية وتشمل SGA 5،6، والشاشات المنافسة في المكتبات barcoded 11،12 وشاشات التقاط حركية الكثافة البصرية في لوحة القراء طيفية 10 التي تتلخص في الجدول رقم 2، ووصف أكثر في مكان آخر تماما 8 . يمكن التعامل معها QFA وألواح SGA، حيث الثقافات تنمو على السطوح الصلبة أجار (الأساليب القائمة على أجار، الجدول 2) بسرعة وسهولة عن طريق الروبوت. يتم تهوية جيدة الصلبة الثقافات سطح أجار طوال النمو والخلايا يمكن أن تنمو في الثقافات ثابت، مما يسمح للميكروبات مؤنس أن تنمو في المجتمع 14. تركت سليمة، والمجتمعات الميكروبية 1ffect الخاصة الصغيرة البيئات، وإفراز مواد سامة مثل الإيثانول، وربما يشير الى ما بين الخلايا. ومع ذلك، مستمرة اختلاط الثقافات السائل، واللازمة لتحقيق تهوية كافية، يعطل بشكل مصطنع المجتمعات الميكروبية والبيئات الصغيرة الخاصة بهم والتي قد تؤثر على وسائط نموها. عبر تلوث هو اقل مدعاة للقلق في طرق أجار الصلبة لأنه ليس هناك أقل فرصة لطخات تحمل خلايا السائل بين الثقافات. إذا تلوث يحدث من قبل الميكروبات المحمولة جوا الأجنبية في المقايسات أجار الصلبة، ويمكن في كثير من الأحيان يمكن الكشف عنها بواسطة الفحص البصري لوحات أجار الصلبة واستأثرت أو إزالتها. QFA الإنتاجية أعلى بكثير من الطرق الموازية السائل بطريقتين. بادئ ذي بدء، على لوحات (وSGA) QFA، معبأة الثقافات تلقيح معا بصورة أكثر كثافة، وإعطاء المزيد من الثقافات مستقلة لكل لوحة. في QFA هناك عادة 308 الثقافات، لا عد الثقافات حافة غير التجريبية (الشكل 1) COMقلص موازية لثقافات السائل مع 96 أو 100 لوحة لكل الثقافات. ثانيا، يمكن تحجيم تجارب QFA إلى عدد أكبر بكثير من لوحات. في حين يقتصر عدد من اللوحات التي تم تحليلها في تجربة واحدة فقط من قبل QFA المساحة المتوفرة في غرفة الحاضنة أو الحارة، إلا أن الحد الأدنى المسموح به تردد التقاط الصور، والحد الأقصى تردد القبض على تحقيقها، وعدد من لوحات في تجربة النمو سائل محدودة بقوة من قدرة القارئ لوحة (عادة واحد أو اثنين لوحات)، أو من مكدس تعلق على قارئ لوحة (عادة 25-50 لوحات). وقد قمنا مؤخرا بإجراء تجربة QFA مؤتمتة بالكامل على 123 لوحات، ولكل منها 308 الثقافات التجريبية، وإعطاء 37884 الثقافات في وقت واحد. نقدر أن العدد الأقصى للتحقيق مستقل من الثقافات المتزايد في السائل هو 96 (ثقافات / لوحة) × 50 (لوحات / مكدس) = 4800، والذي هو حوالي عشرة أضعاف أقل من الإنتاجية QFA لدينا. بديلا عن الشاشات ثقافة السائل هو للاستفادة من العديد الآلي غرووث الأجهزة في نفس الوقت (الجدول 1 من هذا الاستعراض من قبل بلومبرغ 8)، ولكل منها بطاقة واحدة أو اثنتين لوحات. التحكم في درجة الحرارة في كل جهاز مستقل، وهكذا ظروف ليست متطابقة، ولكن على افتراض أنهم، فإن هذا العمل يتطلب ما لا يقل عن 190 مثل هذه الأجهزة لتتناسب مع QFA الإنتاجية (على افتراض 200 الثقافات السائل في الجهاز). وخلاصة القول، QFA هو سير العمل عالية الجودة والتي يمكن تطبيقها على نحو مفيد لجمع الظواهر النمو الكمي في كل من التجارب الصغيرة ركزت وشاشات عالية الإنتاجية. انها مرنة بما فيه الكفاية ليتم تطبيقها على نحو فعال مع اختلاف الاحتياجات من المعدات الآلية. ويستند العنصر الحسابية لسير العمل في QFA متاحة بحرية، وشفرة المصدر المفتوح.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف / معدات </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> طبق الاصل الحصان الرديء </td><td> سيغما </td><td> R-2508 </td><td> 96 دبوس دليل pintool مع 1/8 دبابيس قطر &quot; </td></tr><tr><td> مزيج ماتي </td><td> إيبندورف </td><td> 5353 000.014 </td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX </td><td> بيكمان </td><td> A31842 </td><td></td></tr><tr><td> Teleshake </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 50095890 </td><td> مثبتة على FX Biomek </td></tr><tr><td> BM3-SC </td><td> S &amp; P الروبوتات المؤتمر الوطني العراقي </td><td> BM3-SC </td><td> 192 الجرف الدورية دائري </td></tr><tr><td> spImager </td><td> S &amp; P الروبوتات المؤتمر الوطني العراقي </td><td> spImager </td><td> ارتفاع القرار دليل التصوير </td></tr><tr><td> spImager مع Cytomفي </td><td> S &amp; P الروبوتات المؤتمر الوطني العراقي </td><td> عرف </td><td> التحكم الآلي في درجة الحرارة التصوير عالية الدقة </td></tr><tr><td> Cytomat 6001 مع مبادل حراري </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 51022222 </td><td> تعلق على spImager </td></tr><tr><td> بفضل تكنولوجيا Ecoline RE207 </td><td> لاودا </td><td> RE207 </td><td> تعلق على Cytomat </td></tr><tr><td> spImager مع دائري </td><td> S &amp; P الروبوتات المؤتمر الوطني العراقي </td><td> عرف </td><td> الآلي التصوير عالية الدقة </td></tr><tr><td> روبوت لاعبا اساسيا أداة دبوس لFP12pins </td><td> V &amp; P العلمية </td><td> AFIX96FP12 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 × FP12 دبابيس </td><td> V &amp; P العلمية </td><td> FP12 </td><td> 50.4 مم، 17 مم يتعرض طول دبوس </td></tr><tr><td> محطة لرسو السفن لأداة الدبوس </td><td> V &amp; P العلمية </td><td> VP425 </td><td> قاعدة لرسو السفن محطة إزالتها للسماح للتجفيف مروحة من الدبابيس </td></tr><tr><td>دبوس فرشاة تنظيف </td><td> V &amp; P العلمية </td><td> VP425 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> طبق الاصل الحصان الرديء </td><td> سيغما </td><td> R-2508 </td><td> دليل دبوس أداة </td></tr><tr><td> نونك OmniTray مع غطاء </td><td> نونك </td><td> 734-0490 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 لوحات البوليسترين معقم جيد </td><td> غرينر BioOne </td><td> 655161 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 الأغطية البوليسترين معقم جيد </td><td> غرينر BioOne </td><td> 656171 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> الجدول 3. الكواشف معينة والمعدات.

a quantitative fitness analysis workflow

التحليل الكمي لياقة (QFA) هو سير العمل التجريبية والحسابية لمقارنة اللياقات الثقافات الميكروبية التي تزرع في 1،2،3،4 مواز. ويمكن تطبيق QFA إلى الملاحظات تركز على ثقافات واحد ولكن مفيدة جدا لالجينوم على نطاق التفاعل وراثية أو شاشات المخدرات التحقيق تصل إلى الآلاف من ثقافات مستقلة. الأسلوب المركزي التجريبية هو تلقيح مستقل، والثقافات المخففة الميكروبية السائل على لوحات أجار الصلبة التي حضنت وتصويرها بصورة منتظمة. ويتم تحليل الصور من كل نقطة في الوقت، وإنتاج كمي تقديرات كثافة الخلية، والتي تستخدم لبناء منحنيات النمو، مما يسمح للياقة البدنية المستمدة التدابير الكمية. ويمكن مقارنة اللياقات ثقافة لتحديد نقاط القوة وترتيب تفاعل وراثية أو حساسيات المخدرات. واضاف تأثير على اللياقة البدنية ثقافة أي علاجات في أجار الركيزة (الجزيئات الصغيرة على سبيل المثال، والمضادات الحيوية أو المواد الغذائية) أو تطبيقها على لوحات خارجيةويمكن لاي كميا (مثل الأشعة فوق البنفسجية إشعاع، ودرجة الحرارة) من قبل QFA. سير العمل QFA تنتج نسبة نمو تقدر مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها بواسطة قياس الطيف من الثقافات سائل موازية في القراء لوحة 96-جيدا أو 200 حسنة. الأهم من ذلك، QFA لديه سرعة أعلى بكثير بالمقارنة مع مثل هذه الأساليب. الثقافات QFA تنمو على سطح صلب أجار وبالتالي فهي مهوى بشكل جيد خلال نمو من دون الحاجة إلى إثارة أو اهتزاز. QFA الإنتاجية ليست مرتفعة كما أن من صفيف بعض الوراثية الاصطناعية (SGA) أساليب الفحص 5،6. ومع ذلك، منذ يتم تخفيفه بشكل كبير الثقافات QFA قبل أن يتم تلقيح على أجار، ويمكن التقاط QFA منحنيات النمو أكثر اكتمالا، بما في ذلك الأسي ومراحل التشبع 3. على سبيل المثال، ملاحظات منحنى نمو السماح يقدر مرات مضاعفة ثقافة مباشرة مع دقة عالية، كما نوقش سابقا 1. نحن هنا يقدمتطبيق بروتوكول معين QFA إلى الآلاف من S. خميرة الثقافات التي يتم معالجتها تلقائيا بواسطة الروبوت خلال الحضانة، والتلقيح والتصوير. يمكن استبدال أي من هذه الخطوات الآلي عن طريق إجراء، أي ما يعادل دليل، مع تخفيض المرتبطة في الإنتاجية، ونقدم أيضا دليلا انخفاض الإنتاجية بروتوكول. ويمكن تطبيق البرنامج QFA نفس الأدوات لالصور التي تم التقاطها في أي من سير العمل. لدينا خبرة واسعة في تطبيق QFA إلى ثقافات الخميرة في مهدها س. خميرة لكننا نتوقع أن QFA سوف تكون مفيدة على حد سواء لدراسة الثقافات من الخميرة الانشطار س. pombe والثقافات البكتيرية.

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Fitness Analysis Workflow at JoVE.com

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

التحليل الكمي لياقة (QFA) هو عبارة عن سلسلة متكاملة من الطرق التجريبية وحسابية لتقدير اللياقات ثقافة الميكروبية. QFA تقدر تأثير الطفرات الوراثية، والمخدرات، أو غيرها من العلاجات المطبقة على نمو الميكروب. ويمكن تصميم التجارب التحجيم من تحليل مركزة من الثقافات وحيد للآلاف من ثقافات موازية.

تحليل كمي لياقة سير العمل

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Research

JoVE Journal

Biology

14.3K Views.  Newcastle University Medical School. التحليل الكمي لياقة (QFA) هو عبارة عن سلسلة متكاملة من الطرق التجريبية وحسابية لتقدير اللياقات ثقافة الميكروبية. QFA تقدر تأثير الطفرات الوراثية، والمخدرات، أو غيرها من العلاجات المطبقة على نمو الميكروب. ويمكن تصميم التجارب التحجيم من تحليل مركزة من الثقافات وحيد...

Video: A Quantitative Fitness Analysis Workflow

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

التحليل الكمي للهجرة عشوائية من الخلايا باستخدام الوقت الفاصل بين الميكروسكوب فيديو

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

التحليل الكمي الالتهام الذاتي باستخدام المجهر مضان المتقدم 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

A تجليد الفحص إنتاجية عالية MHC II لتحليل الكمي لالببتيد الحواتم

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

تقنية جديدة لتحليل الكمي لتساقط الشعر في الفئران عن طريق تحليل درجات الرمادي

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

سير العمل كاملا لتحليل هيستون التعديلات بعد متعدية عن طريق أسفل إلى أعلى الطيف الكتلي: من هيستون استخراج لتحليل البيانات

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...