نشكر الأستاذ هيراوكا لارسال لنا السلالات. نعترف بدعم من مؤسسة Gustafssons غوران وجمعية السرطان سويدية (2008/939).

1. الانشطار الخميرة الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد وسائل الإعلام الحد الأدنى ادنبره (EMM) وبدون EMM ammoniumchloride (EMM - N) 8. للحد من تألق ذاتي ينبغي أن الحل لا يكون الغلوكوز تعقيمها ولكن بدلا من ذلك تصفية تعقيمها باستخدام ميكرومتر 0.2 تصفية وأضاف في وقت لاحق الى وسائل الاعلام تعقيمها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلقيح خلايا الخميرة الانشطار نمت حديثا على صفيحة آغار مع الوسائط الغنية ، والموافقة 8 ، في 3 مل من وسائل الاعلام مع الجلوكوز السائل EMM تعقيمها التصفية. استخدام أنابيب 13mL مع دفع برفق على الغطاء لضمان التهوية الجيدة للخلايا. السماح للخلايا تنمو بنسبة تهتز لهم 225 دورة في الدقيقة في 30 درجة مئوية. يتبع لمدة 2 يوم بواسطة عد لها باستخدام غرفة Burker بواسطة التخفيف المناسبة ، كل صباح ومساء -- إبقاء الخلايا في مرحلة النمو السجل (2 X 10 7 خلية / مل 1 10 X 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من التجربة تأكد من أن الخلايا في مرحلة مبكرة سجل (5) ، X 06-01 أكتوبر X 10 7 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجويع رانه لخلايا النيتروجين خلال التبديل 20 دقيقة من وسائل الاعلام لEMM EMM - N وسائل الإعلام. قد يتم ذلك عن طريق حصاد 3 مل من الخلايا في أنبوب 1.5 مل إيبندورف في اجهزة الطرد المركزي مقاعد البدلاء في أعلى إطار التعاون الإقليمي والحد الأقصى 1.5 الطرد المركزي بسرعة أكبر لحث على الاستجابة للضغط النفسي في الخميرة الانشطار 9. استخدام تقنية مزدوجة الغزل ، وهذا يعني ، تدور الأولى لل2 دقيقة ، ثم أعد تشغيل أنبوب إيبندورف 180 درجة وتدور مرة أخرى لمدة 1.5 دقيقة 2 RCF 10. هذا يساعد على جمع كافة الخلايا في واحدة بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب. يغسل مرة واحدة مع EMM - N وتذوب ثم بيليه في EMM - N واحتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة عند 30 درجة مئوية في 225 دورة في الدقيقة تهتز ثم تابع إلى نقطة 2. نموذج التحضير. </li></ol> 2. إعداد نموذج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد الحصاد 1.5 مل من الخلايا في أنبوب 1.5 مل إيبندورف في اجهزة الطرد المركزي مقاعد البدلاء في أعلى إطار التعاون الإقليمي والحد الأقصى 1.5 الطرد المركزي بسرعة أكبر لحث على الاستجابة للضغط النفسي في الخميرة الانشطار 9. استخدام تقنية مزدوجة الغزل وميانينانوغرام ، الأولى تدور لمدة 2 دقيقة ، ثم أعد تشغيل أنبوب إيبندورف 180 درجة وتدور مرة أخرى لمدة 2 1.5 RCF 10 دقيقة. هذا يساعد على جمع كافة الخلايا في واحدة بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف ، ولكن ترك 10-15 ميكروليتر وresuspend الخلايا المتبقية في وسائل الإعلام. بدلا من إضافة 10 ميكرولتر من وسائل الإعلام الجديدة لresuspend الكرية الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن الشرائح الزجاجية واضحة والغطاء الزجاجي (لا 1.5). عادة لم يكن لديك لتنظيفها ، ولكن تأكد من أنها ليست مليئة بالغبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخرج من الفريزر an قسامة حل سهم lectin 1mg/mL التي تم تعقيمها التصفية. يمكن أن يكون الحل lectin refrozen بضع مرات. يستخدم lectin لإصلاح خلايا الخميرة في كوب الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 ميكرولتر من مكان EMM مع الجلوكوز تعقيم تصفية على زجاج الهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان 5 ميكرولتر من محلول lectin في زاوية من الزجاج غطاء. المكان في وقت لاحق 5 ميكرولتر الثقافة الخلية في الزاوية نفسها ، أي في إسقاط lectin. انتشار المزيج بواسطة pipetting بضع مرات ثم الخلية الثقافة lectin مزيج من الزجاج تغطي جميع أنحاء باستخدام الجانب طويلة من غيض ماصة. اعتمادا على كثافة الخليط صومعتك ترك كل شيء أو تمتص السيولة الفائضة في الزاوية المقابلة من الزجاج غطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غطاء من الزجاج ، حتى أعلى ، مع جانب واحد على زجاج موضوعية وعلى الجانب الآخر على مقاعد البدلاء. السماح لتغطية الزجاج الجافة قليلا لبضع دقائق. بالتأكيد لا ينبغي أن تكون جافة تماما ، ولكن لا ينبغي أن يكون السائل كثيرا على الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غطاء من الزجاج مع ملاكا التقريبية · 70 من الزجاج الهدف من قطرة من EMM. ترك غطاء من الزجاج بحيث تقع أعلى إلى أسفل في قطرة من EMM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وختم حواف مع الشحوم السيليكون تحضير حقنة 2 مل. قطع نهاية واسعة من طرف 200 ميكروليتر وإرفاقه المحقنة. ملء المحاقن مع حوالي 1 مل من الشحوم السيليكون. يتم تطبيق خيطا رفيعا من السيليكون على حواف الزجاج التي تغطي القيح بلطفهينج المكبس من المحاقن. الآن لديك غرفة صغيرة من النمو س. pombe الخلايا. </li></ol> 3. المجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Initialise في مضان المجهري عن طريق تشغيل مصباح الزئبق / زينون ، المجهر والكمبيوتر. مكان الغرفة نمو الخميرة في مضان المجهر. استخدام هدفا X 63 X أو الهدف 100 مع NA = 1.3 أو أعلى. إذا كان يستخدم هدفا للنفط ، إضافة النفط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الحقل مشرق للعثور على الخلايا والحصول على صورة حادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعدادات المجهري مضان تختلف تبعا لfluorochromes تستخدم لتسمية خلايا الخميرة والمجهر. نستخدم مبائر مجهر زايس LSM مجهر المسح الضوئي ليزر 700 مع خطة لامزيغ - 63x النفط عدسة الهدف (NA = 1.4) مع خط المتوسط ​​16 طائرة إعداد المسح الضوئي. يجب تعيين وحدات ذات الثقب إلى 1-1،1 إيري ، الذي يعطي شريحة بصرية من 0.8 ملم. اكتشفنا GFP في المسار 1 باستخدام مجموعة تصفية اليكسا 488 مع التقسيم في شعاع 582 نانومتر ، وبذلك دetecting موجات بين 488 و 582 نانومتر. في المسار 2 نستخدم مجموعة التصفية المثلى لmCherry باستخدام الحزمة الخائن في 578 نانومتر ، وبالتالي الكشف عن الموجات بين 578 و 600 نانومتر. هذا يعني أنه في المسار 2 وسيتم الكشف عن كل من mRFP (SPB) ، وشمال البحر الأبيض المتوسط ​​(mCherry). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما أخذ العديد من الصور اللازمة لتكون قادرة على قياس في 60 الخلايا مختلفة عن كل سلالة. عادة 15 صورة من حقول المجهري مستقلة بما فيه الكفاية. فمن المستحسن أن يتم تكوين غرفة جديدة للنمو مع خلايا جديدة اذا وقتك المجهري يتجاوز 60 دقيقة. </li></ol> 4. الكمية قياس المسافات التحت خلوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الصور في برنامج زن زايس الطبعة الخفيفة. باستخدام أداة قياس المسافة في القياسات بين ميكرومتر fluorochromes مختلفة في كافة الخلايا فيه جميع الاشارات في طائرة الوصل نفسه. ضبط شدة الضوء والتباين في تحديد مركز للإشارة الفلورسنت. يستخدم هذا البروتوكول المبسط اثنين فقط ج مختلفةوبالتالي olours SPB وشمال البحر الأبيض المتوسط ​​هي في نفس القناة. هو خص بها SPB هيكلها جولة كبيرة في شمال البحر الأبيض المتوسط. نقل المسافات إلى ورقة المفكرة. قياس لا يقل عن 60 في الخلايا. ويمكن أيضا برامج أخرى مثل ImageJ يمكن استخدامها لقياس المسافة ، ولكن يفضل زايس زن الخفيفة بسبب قرار العالي ، من الصورة وسهولة للتكبير والتصغير باستخدام هذا البرنامج. والصور في شكل LSM افتتح في ImageJ يكون القناتين على رأس كل منهما الآخر. لجعل صورة مع كل القنوات ، وتقسيم لأول مرة دمج القناتين وبعد ذلك لهم. بعد ذلك يمكن أن تستخدم أداة سطر لقياس المسافات على النحو الموصوف أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قارن بين المسافات يعني أو الوسيط بين سلالات مختلفة التحت خلوية والعلاجات باستخدام البرنامج الإحصائي ، على سبيل المثال اختبار t أو اختبار مان ويتني مجموع رتبة ، على سبيل المثال باستخدام برنامج SigmaStat - 3.5. في كثير من الأحيان ليست البيانات الموزعة منذ عادة سيكون هناك اختيار للخلايا مع أقصرالمسافات بين الإشارات الفلورسنت منذ إشارات جميعا بحاجة إلى أن يكون في الطائرة نفسها إلى التنسيق يقاس. يمكن فقط لاختبار t يتم استخدامها عند البيانات لديها التوزيع العادي في حين أن مجموع رتبة اختبار مان ويتني يسمح للمقارنة بين مجموعات البيانات التي تفتقر إلى التوزيع العادي. في اختبار T - تقارن يعني اثنين من قواعد البيانات المختلفة أثناء وجوده في رتبة مجموع اختبار مان ويتني تتم مقارنة المتوسط. </li></ol> 5. ممثل النتائج سلالة PJ1185 : (ح + + his7 : dis1placR -- GFP Chr1 [: : + ura4 hphMX6 lacO] natMX6 ura4 - D18 leu1 - 32 - DN ade6 / N - sid4 mRFP : : : kanMX6 cut11 - mCherry :) كانت تزرع في EMM . تم سحب عينة والذي أقيم في غرفة صغيرة النمو ، وأخذت الصور (الشكل 1A + N). بعد ذلك تم استبدال وسائط النمو مع EMM ث / س ammoniumchloride (EMM - N) ، وكانت الخلايا زrown لمدة 15 دقيقة في حين تهتز. وقد شنت بعد ذلك تجويع الخلايا النيتروجين في غرفة النمو مع EMM - N والصور أخذت (الشكل 1A - N). تم استخدام أداة قياس لقياس المسافة بين موضع (GFP) وSPB في (الشكل 1B والجدول 1). بالإضافة إلى ذلك ، تم قياس المسافة بين موضع (GFP) وشمال البحر الأبيض المتوسط ​​(1B الشكل والجدول 2). وتمت مقارنة المسافات التحت خلوية وسيطة قبل وبعد استنزاف النيتروجين باستخدام 3.5 SigmaStat البرمجيات (الجدول 3). كان هناك تحول كبير إحصائيا في توطين الكتلة الجين تتحرك بعيدا عن شمال البحر الأبيض المتوسط ​​نحو SBP. كانت بيانات قياس المسافة بين GFP وSBP في التوزيع العادي ، وبالتالي يعني مسافات (1،777 ميكرومتر + N و1587 ميكرومتر - N) ويمكن مقارنة باستخدام اختبار t (الجدول رقم 1 و 3). كان هناك فرق كبير بين القيمتين يعني (P = 0.008 ، اختبار t). فإن البيانات قياس المسافة بين GFP وشمال البحر الأبيض المتوسط ​​لم يكن لديك دي العاديوتمت مقارنة stribution وبالتالي المسافات المتوسطة (0 ميكرون + N و 0.390 ميكرون - N) باستخدام مبلغ رتبة اختبار مان ويتني (الجدول 2 و 3). كان هناك فرق كبير بين القيمتين وسيطة (P &lt;0.001 ، المجموع رتبة مان ويتني الاختبار). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454fig1.jpg" /> الشكل 1 ، وتوطين مجموعة من الجينات المسماة Chr1 ، التي تميزت GFP ، تغيرت بعد المجاعة النيتروجين. (أ) العمود الأيسر ، + N ، وهو ممثل نواة الخلية من خلية تزرع في العمود الأيمن EMM ، - N ، وهو ممثل نواة الخلية من خلية تزرع في EMM - N. الأخضر هو إشارة GFP العلامات الكتلة Chr1 ، الأحمر هو mRFP mCherry ووصفها SPB وشمال البحر الأبيض المتوسط ​​، على التوالي. (ب) نواة الخلية نفس (A) ولكن الآن مع قياس المسافات subnuclear ؛ الصفراء : قطر نواة الخلية ، الزرقاء : المسافة بين SPB وإشارة GFP والوردي : المسافة بين إشارة GFP والغشاء النووي. <pالطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="الجدول 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1a.jpg" /> <img alt="الجدول 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1b.jpg" /> <img alt="الجدول 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1c.jpg" /> الجدول 1 ، وقياس المسافات في subnuclear ميكرون من سلالة PJ1185 تزرع في EMM. أول صف ، وقطره من الخلية (د) ، الصف الثاني ، وبعد المسافة بين GFP وSPB ، والصف الثالث ، وبعد المسافة بين GFP وشمال البحر الأبيض المتوسط. <img alt="الجدول 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2a.jpg" /> <img alt="الجدول 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2b.jpg" /> <img alt="الجدول 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2c.jpg" /> الجدول 2. قياس المسافات في subnuclear ميكرون من سلالة PJ1185 تزرع في EMM - N. أول صف ، وقطره من الخلية (د) ، الصف الثاني ، وبعد المسافة بين GFP وSPB ، والصف الثالث ، وبعد المسافة بين GFP وشمال البحر الأبيض المتوسط. <imgALT = &quot;الجدول 3&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/3454/3454table3.jpg&quot; /&gt; الجدول 3. الإحصاء الوصفي من المسافات التي لوحظت في subnuclear PJ1185 قبل سلالة (+ N) وبعد (- N) التجويع النيتروجين. الصف الأول : عدد الخلايا قياسه ، الصف الثاني : يعني القطر (د) من الصف الثالث : قطر وسيطة (د) من الصف الرابع : يعني المسافة بين GFP وSPB ، الصف الخامس : مسافات سيطة بين GFP وشمال البحر الأبيض المتوسط.

<ol>
	<li>Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-802 (1994).</li><li>Robinett, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator/repressor+recognition.">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. Cell. Biol. 135, 1685-1685 (1996).</li><li>Bahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14, 943-943 (1998).</li><li>Asakawa, H., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+imaging+of+meiotic+chromosome+dynamics+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Live-cell fluorescence imaging of meiotic chromosome dynamics in Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods. Mol. Biol. 558, 53-53 (2009).</li><li>Alfredsson-Timmins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+chromatin+is+an+early+response+to+nitrogen+starvation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Reorganization of chromatin is an early response to nitrogen starvation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 118, 99-99 (2009).</li><li>Kristell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+depletion+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe+causes+nucleosome+loss+in+both+promoters+and+coding+regions+of+activated+genes.">Nitrogen depletion in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe causes nucleosome loss in both promoters and coding regions of activated genes.</a> Genome. Res. 20, 361-361 (2010).</li><li>West, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cut11(+):+A+gene+required+for+cell+cycle-dependent+spindle+pole+body+anchoring+in+the+nuclear+envelope+and+bipolar+spindle+formation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">cut11(+): A gene required for cell cycle-dependent spindle pole body anchoring in the nuclear envelope and bipolar spindle formation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol. Biol. Cell. 9, 2839-2839 (1998).</li><li>Tomlin, G. C., Morrell, J. L., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+protein+Cdc11p+links+Sid4p+to+the+fission+yeast+septation+initiation+network.">The spindle pole body protein Cdc11p links Sid4p to the fission yeast septation initiation network.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 1203-1203 (2002).</li><li>Funabiki, H., Hagan, I., Uzawa, S., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle-dependent+specific+positioning+and+clustering+of+centromeres+and+telomeres+in+fission+yeast.">Cell cycle-dependent specific positioning and clustering of centromeres and telomeres in fission yeast.</a> J. Cell. Biol. 121, 961-961 (1993).</li><li>Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+analysis+of+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods. Enzymol. 194, 795-795 (1991).</li><li>Soto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+centrifugation-induced+gravity+forces+through+mitogen-activated+protein+kinase+pathways+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Transduction of centrifugation-induced gravity forces through mitogen-activated protein kinase pathways in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Microbiology. 153, 1519-1519 (2007).</li><li>Hagan, I. M., Ayscough, K. R., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence microscopy in yeast. , (2000).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+and+exploiting+the+fluorescent+protein+paintbox+(Nobel+Lecture).">Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 5612-5612 (2009).</li><li>Mackay, D. R., Ullman, K. S., Rodesch, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Imaging+of+Mitosis+After+siRNA+Transfection.">Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection.</a> J. Vis. Exp. (40), e1878-e1878 (2010).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

خلال العقد الماضي أصبح استخدام التصوير الخلية الحية لرصد الأحداث الخليوي شعبية متزايدة. بدأ ذلك مع استخدام البروتين الإسفار الأخضر من قنديل البحر Aequorea فيكتوريا والآن fluorochromes مختلفة كثيرة متاحة مضان ينبعث منها من خلال أطياف واسعة من السماوي (475 نانومتر) إلى اللون الأحمر حتى الآن (648 نانومتر) 11. واحد من أهم مزايا التصوير الخلية الحية عبر المناعي هو أنه لم يتم إصلاح الخلايا الفورمالديهايد أو المعاملة الايثانول / الأسيتون قبل المجهري ، وبالتالي تجنب القطع الممكنة من عملية التثبيت. بالإضافة إلى ذلك ، يعيش التصوير الخلية توفر إمكانية تتبع الخلايا الفردية ، والتقاط الصور على فترات متكررة خلال ساعات أو أيام من الحضانة ، مما يجعل من الممكن الحصول على الأفلام من الأحداث الخلوية 12. خلايا الثدييات لديها ميزة وجود حجم أكبر ، ويبلغ قطرها حوالي 100 ميكرون ، بالمقارنة مع خلايا الخميرة الصغيرة التي يبلغ قطرها حوالي 3-4 ومو ؛ متر. من ناحية أخرى ، فإن الميزة مع الخميرة الجينوم هو التلاعب بسهولة. مثلي تأشب يحدث بكفاءة عالية في الخميرة ، ويستخدم لفتيل البروتينات التي تهم مختلف fluorochromes 3. وعلاوة على ذلك ، وذلك باستخدام التكامل المستهدف لمتواليات lacO والتعبير لاحقة من البروتين GFP - LacR يسمح للكشف عن جزء معين من الجينوم داخل نواة الخلية 2. باستخدام S. خلايا pombe في المجهر ومزايا إضافية لأنها كائنات وحيدة الخلية الطبيعية التي تنمو مع الوقت جيل السريع في الظروف منخفضة التكلفة ثقافة الخلية. وعلاوة على ذلك ، S. pombe ممتازة الكائنات حقيقية النواة نموذج له منذ metazoan الجينات المتماثلة. واحدة من القيود الرئيسية لهذا الأسلوب هو تألق ذاتي في خلية الخميرة مزعجة للكشف عن إشارة حقيقية. ويمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق استخدام وسائط النمو مع الحد الأدنى من الجلوكوز تعقيم تصفية بدلا من تعقيمها. فيبالإضافة إلى ذلك ينبغي أن تزرع في خلايا الخميرة لمدة 2 يوما في المرحلة قبل التركيب سجل لهم. بروتوكول المعروضة هنا يقدم طريقة بسيطة نسبيا ، ولكن حتى الآن لتحديد الكمية توطين التحت خلوية من البروتينات داخل الخلية الخميرة. وعلاوة على ذلك عن طريق التقاط الصور عند نقاط زمنية مختلفة يمكننا متابعة الأحداث الخلوية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف / المعدات </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليق </td></tr><tr><td> Lectin </td><td> سيغما </td><td> L1395 </td><td></td></tr><tr><td> السيليكون الشحوم </td><td> داو كورنينج </td><td></td><td></td></tr><tr><td> مجهر المسح الضوئي ليزر LSM 700 </td><td> زايس </td><td> LSM 700 </td><td> ويمكن استخدام المجهر متحد البؤر الأخرى. </td></tr><tr><td> SigmaStat 3.5 </td><td> Statcon </td><td> SigmaStat 3.5 </td><td> ويمكن استخدام أي برنامج للتحليل الإحصائي. </td></tr></tbody></table>

quantitative live cell fluorescence-microscopy analysis of fission yeast

المجهري تقنيات عدة متوافرة اليوم التي يمكن الكشف عن بروتين معين داخل الخلية. خلال العقد الماضي أصبح يعيش التصوير الخلية باستخدام fluorochromes مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) يعلق مباشرة على البروتين من الاهتمام الشعبي على نحو متزايد 1. ويمكن استخدام GFP fluorochromes مماثلة يتم الكشف عن اللغات المحلية التحت خلوية وتحركات البروتينات في المجهر الفلورسنت. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا أن تدرس توطين subnuclear في منطقة معينة من الكروموسوم باستخدام هذه التقنية. وتنصهر GFP للبروتين كاظمة لاك (LacR) ، وأعرب عن ectopically في الخلية حيث تم إدخال يكرر جنبا إلى جنب من تسلسل lacO في المنطقة ذات الاهتمام على الكروموزوم 2. سوف LacR - GFP ربط lacO ويكرر هذا المجال من الجينوم سيكون مرئيا باعتبارها نقطة خضراء في مضان المجهر. وهي ملائمة بشكل خاص الخميرة لهذا النوع من التلاعب منذ مثليوالتوحد هو فعالة جدا ويمكن بالتالي التكامل المستهدفة من يكرر lacO والبروتينات الانصهار هندسيا مع GFP 3. نحن هنا وصف الأسلوب الكمي لتحليل الخلية الحية من الخميرة الانشطار. ويمكن الاطلاع على بروتوكولات إضافية لتحليل الخلية الحية من الخميرة الانشطار ، على سبيل المثال على كيفية صنع فيلم من 4 السلوك الكروموسومات الانتصافي. في هذه التجربة خاصة ونحن نركز على تنظيم subnuclear وكيف يتأثر أثناء تحريض الجينات. وصفت لنا كتلة الجين المسمى Chr1 ، عن طريق استحداث مواقع lacO ملزمة في المنطقة المجاورة للجينات. غير المخصب الكتلة الجين لجينات التي يسببها الجوع في وقت مبكر خلال النيتروجين من الخميرة الانشطار 5. في سلالة يسمى الغشاء النووي (NM) عن طريق الحجز على mCherry إلى NM Cut11 البروتين مما يؤدي إلى الإشارات الحمراء الفلورسنت. وتنصهر في الجسم القطب المغزل (SPB) مجمع Sid4 لبروتين فلوري الأحمر (Sid4 - mRFP) 6 </sيصل&gt;. في خلايا الخميرة نباتيا المتزايدة هي التي تعلق دائما centromeres إلى SPB مضمن في شمال البحر الأبيض المتوسط ​​7. تم تحديد هيكل وSPB جولة واسعة في شمال البحر الأبيض المتوسط. بواسطة التصوير قبل وبعد 20 دقيقة من مصدر استنزاف النيتروجين يمكننا تحديد المسافة بين الكتلة الجين (GFP) وNM / SPB. وتتم مقارنة المسافات يعني أو الوسيط قبل وبعد استنفاد النيتروجين ، ويمكننا بالتالي تحديد ما إذا كان أو لم يكن هناك تحولا في توطين التحت خلوية من الكتلة الجين بعد استنفاد النيتروجين.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast at JoVE.com

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

والانشطار الخميرة ،<em&gt; Schizosaccharomyces pombe</em&gt; ، هو نظام نموذجا جيدا لدراسة العمليات الخلوية الأساسية. نحن هنا وصف طريقة التحليل الكمي لأداء الخلية الحية من الخميرة الانشطار. في هذه التجربة خاصة ونحن نركز على تنظيم الجينوم داخل نواة الخلية ، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم أسلوب لدراسة العوامل عصاري خلوي.

الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

quantitative-live-cell-fluorescence-microscopy-analysis-fission

Research

JoVE Journal

Biology

20.1K Views.  University of Uppsala. والانشطار الخميرة ، Schizosaccharomyces pombe ، هو نظام نموذجا جيدا لدراسة العمليات الخلوية الأساسية. نحن هنا وصف طريقة التحليل الكمي لأداء الخلية الحية من الخميرة الانشطار. في هذه التجربة خاصة ونحن نركز على تنظيم الجينوم داخل نواة الخلية ، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم...

Video: Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

متصور الكهربائي زنزانة مع مضان المجهري

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

والفحص المجهري لالإسفار Mitophagy الرصد في الخميرة السكيراء الجعوية

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

تحليل كمي لياقة سير العمل

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

التحليل الكمي الالتهام الذاتي باستخدام المجهر مضان المتقدم 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

التحليل السريع واستكشاف الإسفار الميكروسكوب الصور

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

المجهر من دورة حياة الجنسية الانشطار الخميرة

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

تحليل الزمانية المكانية من Cytokinetic الأحداث في الخميرة الانشطار

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of proteins which are essential for bacterial survival. A series of target-specific dyes can be used as probes to better understand these processes. Staining with lipophilic dyes enables the observation of membrane structure, visualization of lipid microdomains, and detection of membrane blebs. Use of fluorescent-d-amino acids (FDAAs) to probe the sites of peptidoglycan biosynthesis can indicate potential defects in cell wall biogenesis or cell growth patterning. Finally, nucleic acid stains can indicate possible defects in DNA replication or chromosome segregation. Cyanine DNA stains label living cells and are suitable for time-lapse microscopy enabling real-time observations of nucleoid morphology during cell growth. Protocols for cell labeling can be applied to protein depletion mutants to identify defects in membrane structure, cell wall biogenesis, or chromosome segregation. Furthermore, time-lapse microscopy can be used to monitor morphological changes as an essential protein is removed and can provide additional insights into protein function. For example, the depletion of essential cell division proteins results in filamentation or branching, whereas the depletion of cell growth proteins may cause cells to become shorter or rounder. Here, protocols for cell growth, target-specific labeling, and time-lapse microscopy are provided for the bacterial plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Together, target-specific dyes and time-lapse microscopy enable characterization of essential processes in A. tumefaciens. Finally, the protocols provided can be readily modified to probe essential processes in other bacteria.

Understanding the function of essential processes in bacteria is challenging. Fluorescence microscopy with target-specific dyes can provide key insights into microbial cell growth and cell cycle progression. Here, Agrobacterium tumefaciens is used as a model bacterium to highlight methods for live cell imaging for characterization of essential processes.

يعيش خلية Fluorescence مجهرية لمراقبة العمليات الأساسية أثناء نمو الخلايا الميكروبية

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...