نود أن نعترف مارك زنياك للحصول على المساعدة فيديو. ونود أيضا أن نعترف شون موريسون في جنوب غرب التحرير للبروتوكول الأصلي لزراعة خلايا الفئران نورث كارولاينا. وأيد هذا العمل فاندربيلت المركز الطبي لجامعة لدعم البرنامج الأكاديمي، وكان من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (HD36720 وHD036720-11S109) و11GRNT7690040 AHA على بال، والزمالات predoctoral من AHA (0615209B)، والمعاهد الوطنية للصحة (NS065604) لحركة عدم الانحياز، وتخطيط موارد المؤسسات بدعم من T32HD007502 تدريب منحة المعاهد الوطنية للصحة.

1. إعداد لوحات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام تقنية معقمة في كل الأوقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد فبرونيكتين (الجبهة الوطنية) من خلال تمييع 100 ميكرولتر من الإنسان مخزون FN البلازما إلى حجم نهائي قدره 3.3 مل في برنامج تلفزيوني في Dulbecco (dPBS). التركيز النهائي هو 30 ميكروغرام / مل ويمكن تخزين هذا في درجة مئوية 4 ل 1 الاسبوع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الجزء السفلي من كل بئر من لوحة النسيج عقيمة 4 ثقافة بشكل جيد مع حل الجبهة الوطنية والسماح للجلوس لمدة 15 دقيقة. تأكد من يتم تغطية كامل السطح. جعل وسائل الإعلام خلال هذه الفترة (الخطوات 2 و 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجبهة الوطنية حل والسماح لوحات لتجف. شطف الآبار بلطف مع 500 DMEM ميكرولتر، وإزالة DMEM، وإضافة 500 ميكرولتر من التجديد الذاتي (ريال) المتوسط ​​(انظر أدناه). احتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO 2. إكمال هذه ساعة واحدة تقريبا قبل تشريح بحيث لوحات وسوف تكون جافة قبل الاستخدام. </li></ol> 2. يستعد ريال متوسطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لثقافة NC المبهم والجذع10 من الأجنة (حوالي لتر واحد، اعتمادا على خلفية وراثية من خط الماوس)، وإعداد 25 مل من وسط ريال. الجمع بين 12.5 مل منخفض DMEM الجلوكوز، 7.5 مل متوسطة Neurobasal، 25 حمض الريتينويك ميكرولتر (117 ميكرومتر تركيز النهائي)، و 25 ميكرولتر 2-المركابتويثانول (50 ملي تركيز النهائي). تخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3.75 مل استخراج أجنة الدجاج، 250 ميكرولتر N الملحق ملح 2، 500 ميكرولتر ملحق B27 و 250 ميكرولتر البنسلين، الستربتومايسين (تركيز النهائي 1٪). تصفية المتوسطة من خلال مرشح 0.22 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 IGF1 عقيمة ميكروليتر (20 ميكروغرام / مل تركيز النهائي) و 20 ميكرولتر bFGF عقيم (20 ميكروغرام / مل تركيز نهائي). مزيج من قلب. تخزن في درجة مئوية 4 </li></ol> 3. إعداد متوسطة غسيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لنحو 10 الأجنة تحضير 50 ​​مل من المتوسط ​​غسيل. الجمع بين 50 ملغ جيش صرب البوسنة مع 35 مل DMEM انخفاض الجلوكوز، 15 مل متوسطة Neurobasal، و 500 ميكرولتر البنسلين، الستربتومايسين (1٪ تركيز النهائي). معقم فلتر مع 0.22ميكرون فلتر. </li></ol> 4. إعداد كولاجيناز / dispase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من dPBS مل 100 ملغ / مل كولاجيناز / dispase إلى 5. تخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرشح المحاقن مع 0.2 ميكرون تصفية وإضافة 1.5 مل في كل من ثلاثة آبار من 12 لوحة جيدا. ماصة غسل ما يقرب من 1 مل المتوسطة في الآبار المتبقية. لوحة تخزين كامل على الجليد حتى على استعداد لهضم الأنسجة تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع نصائح من طرف ماصة P20 و P1000 مرشح بشفرة حلاقة معقمة. قص أسفل حافة مشطوف من غيض. وسيتم استخدام القطع قبالة P1000 لنقل الجنين كامل في حين سيتم استخدام P20 لنقل قطع من الأنسجة المعزولة. </li></ol> 5. عزل المبهم والأنبوبة العصبية الجذع من أجنة DPC 9.5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالات الحمل توقيتها، وتعتبر السدود مع المكونات المهبلية 0،5 DPC ظهرا من صباح اليوم لوحظ المكونات. تضحية وإزالة الرحم في DPC 9.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الساقط من رحم وبلطف صemove الجنين من الساقط. شهدت مرة واحدة مع هذا البروتوكول، عزل 3-4 9.5 الأجنة DPC في وقت واحد في dPBS العقيمة. استخدام تقنية معقمة وأدوات تشريح للتعقيم. يمكن تعقيم أدوات التعقيم بواسطة جهاز الأوتوكليف الحرارة، أو عن طريق حضانة في الايثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لNC المبهمي الأمامي: استخدام إبر الأنسولين، وقطع الأنبوب العصبي في اللوحاء في منتصف أذني. قطع مرة أخرى على حافة الخلفي من الجسيدة 4 ال. تقليم الأنسجة بطني إلى الأنبوب العصبي لإزالة الأقواس البلعومية والقلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لNC الجذع: استخدام إبر الأنسولين، وإزالة جزء من الأنبوب العصبي بين somites 16-22 (أو الجسيدة مشاركة إذا الأجنة تنمويا في وقت سابق من مرحلة الجسيدة 22). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ابقاء الكيس المحي وأي نوع من الأنسجة الجنينية المتبقية لالتنميط الجيني. </li></ol> 6. إزالة غير الأديم الظاهر العصبي والأديم المتوسط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأنبوب العصبي التي تحتوي على شرائح في كولاجيناز / dispase في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقةق. يغسل فورا في المتوسط ​​غسيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة إلى الأنسجة dPBS العقيمة. استخدام إبر الأنسولين العقيمة، وإزالة بلطف الأديم الظاهر غير عصبية من الأنسجة وفصل و somites بعيدا عن الأنبوب العصبي. ويمكن إزالة الأجزاء آخر ما تبقى من الطبقة الجرثومية الوسطى من الأنسجة الجسيدة بواسطة triturating بلطف باستخدام قطع أسفل P20 طرف. كن حذرا حتى لا تضر الأنبوب العصبي. مراقبة ذلك عن كثب خلال سحن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب معزولة العصبية من خلال غسل الثانية والثالثة 30 ثانية من غسل المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرة واحدة في وسط ريال، ووضع أنبوب معزولة العصبية في مركز بئر FN المغلفة التي أعدت من قبل (الخطوة 1.3). ترطيب الغرفة نقص الأكسجة مع طبق من الماء المعقم. وضع طبق في غرفة نقص الأكسجة وتدفق الغاز مع غرفة مختلطة إلى 3٪ O 2 (استخدام دبابة تحتوي على خليط من 1٪ O 2، 6٪ CO 2، 93٪ N 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعامل دائما الغرفة بعناية فائقة لضمان ثاexplants تي هي دون عائق، والبقاء في مركز للآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية. ويظهر ملخص للخطوات 5-6 في الشكل 1. </li></ol> 7. إزالة الأنبوب العصبي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة من الحضانة، وإزالة الأنبوب العصبي بواسطة إغاظة بلطف حافة الأنبوب العصبي بعيدا عن الخلايا المهاجرة باستخدام إبرة الأنسولين العقيمة. إزالة والتخلص من الأنبوب العصبي من المتوسط ​​باستخدام قطع P20 العقيمة كما في الخطوة 6.2 و استبدال المتوسطة مع المتوسطة ريال الطازجة (الشكل 2). هو الأكثر بسهولة القيام بذلك باستخدام مجهر مقلوب. </li></ol> 8. ممثل النتائج بعد 24 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية في ظروف نقص الأوكسجين، والخلايا NC هاجروا بعيدا عن الأنبوب العصبي في عدد سكانها ما يقرب من محض (الشكل 3A). في بعض الأحيان، وهذا اقل مما الثقافات المثالي لا تسفر عن الامتداد القوي. على سبيل المثال، فمن الممكن أن بعد 24 ساعة تيسيكون قد كرة لولبية كان الأنبوب العصبي حتى على نفسها، ونورث كارولاينا لن تهاجر بعيدا عن الأنبوب العصبي (الشكل 3B). في بعض الأحيان فإن الأنبوب العصبي لا نعلق على لوحات والمغلفة فبرونيكتين. في تجربتنا، يمكن دون المستوى الأمثل NC الهجرة أو مشاكل مع المرفقات في الأنبوب العصبي تتأثر سلبا ظروف normoxia أو تركيز فبرونيكتين، على التوالي. ولا بد من تعديل النشاط الأنزيمي من كولاجيناز / dispase يختلف قليلا عن طريق دفعة والوقت مناسب الهضم، ومع ذلك، لا هضم الأنسجة وقتا أطول من 15 دقيقة. وسوف Overdigestion في الأنبوب العصبي التي تحتوي على نسج في كولاجيناز / dispase يؤدي أيضا إلى الامتداد ناقص. إذا لم يتم الأنسجة الجسيدة إزالتها بسهولة من الأنبوب العصبي بعد حضانة في كولاجيناز / dispase، يمكن تحضين الأنبوب العصبي لمدة تزيد عن عشر دقائق. في بعض الأحيان فإن الأنبوب العصبي لا نعلق على الركيزة. إذا كان هذا هو الحال، انقر نقرا مزدوجا التحقق من fibronecتركيز القصدير وظروف نقص الأكسجة. بينما يمكن استخدام الظروف normoxic إلى ثقافة البرية من نوع نورث كارولاينا، وظروف نقص الأوكسجين بشكل وثيق في بيئة تحاكي فيفو 29،30. في تجربتنا، وأصبحت الظروف الحرجة عندما ميتة زراعة متحولة NC. على سبيل المثال، كان NC جذع عندما تم زرعها Foxd3 متحولة NC في ظروف normoxic، وهو ثمرة خلية تقلص إلى حد كبير بالمقارنة مع الضوابط. تمت إزالة هذا التفاوت في حجم ثمرة عندما تم زرعها في explants في ظروف نقص الأوكسجين (الشكل 4). وعلاوة على ذلك، كان عدد كاسباس إيجابية الخلايا عندما تم زرعها من النوع البري explants الأنبوب العصبي في normoxia، ثم أن من أكبر explants مماثل زرعها في نقص الأكسجة (لا تظهر البيانات). من خلال الحفاظ على كل ثقافة نورث كارولاينا في نقص الأكسجين، ويمكن بسهولة أن يتم إجراء مقارنات بين ديناميات سيطرة وثقافات متحولة. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> <strong<html> &gt; الشكل 1. التخطيطي بشكل عام من العزلة NC. A) تشريح المناطق ذات الاهتمام من الجنين. B) chester ملخص الأنبوب العصبي في كولاجيناز / dispase لمدة عشر دقائق (لا تتجاوز 15 دقيقة). C) في غسل الغسيل المتوسطة. D) تشريح بعيدا في الأديم الظاهر غير العصبية والأديم المتوسط. EF) غسل مرتين في المتوسط ​​غسيل. G) لوحة في المتوسط ​​تجديد الذات. احتضان في 37 درجة مئوية في 3٪ O 2 ظروف نقص الأوكسجين. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. إزالة شكل خطوات من الأنبوب العصبي من ازدراع. ويجب إزالة الأنبوب العصبي بعد 24-48 ساعة لمنع التلوث مع المنظمات غير NC الخلايا. أ) لاحظ الحدود بين الأنبوب العصبي، وثمرة NC (الخط المتصل). ب) قطع على طول حافة الأنبوب العصبي مع إبرة الأنسولين. C) تجاهل الأنبوب العصبي واستبدال المتوسطة مع الطازجة النفس المتوسطة تجديد. خط متقطع يشير مدى ما آل إليه. الاختصار: NT، الأنبوب العصبي. &gt; <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig3.jpg" alt="الشكل (3)" /> الشكل 3. أمثلة من نتائج ممثل. A) ثمرة يزدرع النموذجية بعد حضانة 24 ساعة في المتوسط ​​تجديد النفس في ظروف نقص الأوكسجين (خط متقطع يشير مدى ما آل إليه). B) مكبر نظرا لنمو NC بعد 48 ساعة في الثقافة. ج) الثقافة أقل مثالية مع محصول ثمرة منخفضة. تم زرعها ألف وجيم في ظل نفس الظروف. الصور تظهر مدى متانة الطبيعية في الثقافة. يمكن أن تتأثر بذلك عن طريق كفاءة من العزلة الأنبوب العصبي، وتركيز الجبهة الوطنية، وظروف نقص الأوكسجين، والوقت في كولاجيناز / dispase الهضم. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. في التحليلات المختبرية للثقافات يزدرع NC normoxia في مقابل نقص الأكسجة. السيطرة (نوع البرية) خلايا NC هاجروا من explants الأنبوب العصبي بعد 48 ساعة في ظروف ثقافة normoxic. في المقابل، Foxd3 متحولةقد تقلص إلى حد كبير NC الامتداد خلية في normoxia (حواف حمراء علامة الخطوط العريضة للالامتداد NC). نما Foxd3 متحولة explants NC عندما كانت تزرع explants مشابه في ظل ظروف نقص الأوكسجين، نسبيا لضوابط، مما يسمح للتحليلات لاحقة. علما أن هذا السلوك يرتبط بشكل جيد مع سلوك Foxd3 متحولة NC في الجسم الحي.

<ol>
	<li>Le Douarin, N., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The neural crest. , (1999).</li><li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration:+patterns,+phases+and+signals.">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Developmental biology. 344, 566-568 (2010).</li><li>Saint-Jeannet, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural crest induction and differentiation. , (2006).</li><li>Plank, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+and+timing+of+arrival+of+murine+neural+crest+on+pancreatic+beta+cell+development+and+maturation.">Influence and timing of arrival of murine neural crest on pancreatic beta cell development and maturation.</a> Developmental biology. 349, 321-330 (2011).</li><li>Nekrep, N., Wang, J., Miyatsuka, T., German, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+from+the+neural+crest+regulate+beta-cell+mass+in+the+pancreas.">Signals from the neural crest regulate beta-cell mass in the pancreas.</a> Development. 135, 2151-2160 (2008).</li><li>Freem, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intrinsic+innervation+of+the+lung+is+derived+from+neural+crest+cells+as+shown+by+optical+projection+tomography+in+Wnt1-Cre;YFP+reporter+mice.">The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice.</a> J. Anat. 217, 651-664 (2010).</li><li>Cohen, A. M., Konigsberg, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonal+approach+to+the+problem+of+neural+crest+determination.">A clonal approach to the problem of neural crest determination.</a> Developmental biology. 46, 262-280 (1975).</li><li>Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+quail+neural+crest+cells:+they+are+pluripotent+and+differentiate+in+vitro+in+the+absence+of+noncrest+cells.">Clonal analysis of quail neural crest cells: they are pluripotent and differentiate in vitro in the absence of noncrest cells.</a> Developmental biology. 80, 96-106 (1980).</li><li>Baroffio, A., Dupin, E., Douarin, N. M. L. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+precursors+for+neural+and+mesectodermal+derivatives+in+the+cephalic+neural+crest.">Common precursors for neural and mesectodermal derivatives in the cephalic neural crest.</a> Development. 112, 301-305 (1991).</li><li>White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells+undergo+cell-intrinsic+developmental+changes+in+sensitivity+to+instructive+differentiation+signals.">Neural crest stem cells undergo cell-intrinsic developmental changes in sensitivity to instructive differentiation signals.</a> Neuron. 29, 57-71 (2001).</li><li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification,+isolation+by+flow+cytometry,+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells.">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li><li>Bronner-Fraser, M., Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+the+avian+neural+crest:+migration+and+maturation+of+mixed+neural+crest+clones+injected+into+host+chicken+embryos.">Clonal analysis of the avian neural crest: migration and maturation of mixed neural crest clones injected into host chicken embryos.</a> J. Comp. Neurol. 193, 423-434 (1980).</li><li>Stemple, D. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+stem+cell+for+neurons+and+glia+from+the+mammalian+neural+crest.">Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest.</a> Cell. 71, 973-985 (1992).</li><li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression.">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li><li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skin-derived+precursors+(SKPs)+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny.">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nat. Protoc. 1, 2803-2812 (2006).</li><li>Chung, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+property+of+postmigratory+cranial+neural+crest+cells+and+their+utility+in+alveolar+bone+regeneration+and+tooth+development.">Stem cell property of postmigratory cranial neural crest cells and their utility in alveolar bone regeneration and tooth development.</a> Stem Cells. 27, 866-877 (2009).</li><li>Biernaskie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKPs+derive+from+hair+follicle+precursors+and+exhibit+properties+of+adult+dermal+stem+cells.">SKPs derive from hair follicle precursors and exhibit properties of adult dermal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 610-623 (2009).</li><li>Hagedorn, L., Suter, U., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P0+and+PMP22+mark+a+multipotent+neural+crest-derived+cell+type+that+displays+community+effects+in+response+to+TGF-beta+family+factors.">P0 and PMP22 mark a multipotent neural crest-derived cell type that displays community effects in response to TGF-beta family factors.</a> Development. , 126-3781 (1999).</li><li>Heanue, T. A., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+and+isolation+of+enteric+nervous+system+progenitors+using+Sox2.">Prospective identification and isolation of enteric nervous system progenitors using Sox2.</a> Stem Cells. 29, 128-140 (2011).</li><li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+in+reduced+levels+of+oxygen+promotes+clonogenic+sympathoadrenal+differentiation+by+isolated+neural+crest+stem+cells.">Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells.</a> J. Neurosci. 20, 7370-7376 (2000).</li><li>Ito, K., Morita, T., Sieber-Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+clonal+analysis+of+mouse+neural+crest+development.">In vitro clonal analysis of mouse neural crest development.</a> Developmental biology. 157, 517-525 (1993).</li><li>Etchevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+chick,+mouse+or+human+neural+crest+cells.">Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells.</a> Nat. Protoc. 6, 1568-1577 (2011).</li><li>Mundell, N. A., Labosky, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cell+multipotency+requires+Foxd3+to+maintain+neural+potential+and+repress+mesenchymal+fates.">Neural crest stem cell multipotency requires Foxd3 to maintain neural potential and repress mesenchymal fates.</a> Development. 138, 641-652 (2011).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling.">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development. 133, 99-106 (2006).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling+is+essential+for+cranial+neural+crest+migration+and+trigeminal+ganglion+condensation.">Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation.</a> Dev. Neurobiol. 67, 47-56 (2007).</li><li>Kasemeier-Kulesa, J. C., Bradley, R., Pasquale, E. B., Lefcort, F., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph/ephrins+and+N-cadherin+coordinate+to+control+the+pattern+of+sympathetic+ganglia.">Eph/ephrins and N-cadherin coordinate to control the pattern of sympathetic ganglia.</a> Development. 133, 4839-4847 (2006).</li><li>Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin/neuropilin+signaling+influences+the+positioning+of+migratory+neural+crest+cells+within+the+hindbrain+region+of+the+the+chick.">Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the the chick.</a> Dev. Dyn. 232, 939-949 (2005).</li><li>Schwarz, Q., Maden, C. H., Vieira, J. M., Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin+1+signaling+guides+neural+crest+cells+to+coordinate+pathway+choice+with+cell+specification.">Neuropilin 1 signaling guides neural crest cells to coordinate pathway choice with cell specification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6164-6169 (2009).</li><li>Simon, M. C., Keith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxygen+availability+in+embryonic+development+and+stem+cell+function.">The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 285-296 (2008).</li><li>Ivanovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+or+in+situ+normoxia:+The+stem+cell+paradigm.">Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm.</a> J. Cell Physiol. 219, 271-275 (2009).</li></ol>

ليس لدينا ما يكشف.

وينبغي إيلاء الاهتمام الدقيق لمرحلة التطوير من الجنين لضمان نجاح هذا النهج. عد somites من أجنة الفئران في وقت مبكر أمر بالغ الأهمية سواء بالنسبة للمرحلة مطابقة الأجنة داخل القمامة وتحديد المناطق الصحيح من الأنبوب العصبي للعزلة. وهناك تباين في واحد أو اثنين somites بين الأج...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> DMEM (انخفاض الجلوكوز) </td><td> Gibco / إينفيتروجن </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal متوسطة </td><td> Gibco </td><td> 21103 </td><td></td></tr><tr><td> جيش صرب البوسنة </td><td> سيغما </td><td> A3912-10G </td><td></td></tr><tr><td> dPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> IGF1 </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 354037 </td><td> متجر في aliquots ميكروغرام / 50 مل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 354060 </td><td> متجر في aliquots ميكروغرام / 25 مل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. </td></tr><tr><td> فبرونيكتين </td><td> Gibco </td><td> 33016-015 </td><td> المخزنة في حي 1mg/mLiquots عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. </td></tr><tr><td> حمض الريتينويك </td><td> سيغما </td><td> R2625 </td><td> متجر في aliquots ميكروغرام / مل 35 بعد إعادة تشكيلها في الإيثانول عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. </td></tr><tr><td> 2-المركابتويثانول </td><td> سيغما </td><td> D-5637 </td><td></td></tr><tr><td> N 2 الملحق </td><td> Gibco </td><td> 17502-048 </td><td></td></tr><tr><td> B27 الملحق </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> مرشحات Steriflip 0.22 ميكرون </td><td> ميليبور </td><td> SCGP00525 </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين، الستربتومايسين </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> 0.20 ميكرون مرشحات </td><td> كورنينج </td><td> 431219 </td><td></td></tr><tr><td> المحاقن (لترشيح) </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 301604 </td><td></td></TR&gt; <tr><td> أربع لوحات جيدة </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> كولاجيناز / Dispase </td><td> روش </td><td> 269 ​​638 </td><td> النشاط يختلف من دفعة واحدة. متجر في aliquots ملغ / 100 مل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. </td></tr><tr><td> الأنسولين الإبر (29 ½ غيج) </td><td> بيكتون ديكسون </td><td> 309306 </td><td></td></tr><tr><td> نقص الأكسجة غرفة </td><td> بيلوبس-روتنبرج </td><td></td><td></td></tr><tr><td> محلل الأكسجين </td><td> بيلوبس-روتنبرج </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ملقط # 5 </td><td> أدوات العلم غرامة </td><td></td><td> لإزالة الرحم والساقط. </td></tr><tr><td> التربسين-EDTA (0.25٪) </td><td> Gibco </td><td> 25200 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and culture of neural crest cells from embryonic murine neural tube

والجنينية العرف العصبي (NC) هو عدد السكان سلف multipotent الذي ينشأ في الجانب الظهري في الأنبوب العصبي، يخضع 1 الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT)، وتنتقل في مختلف أنحاء جنين، مما أدى إلى مختلف أنواع الخلايا 1-3. NC أيضا لديه قدرة فريدة على التأثير على التمايز والنضج من الأعضاء المستهدفة 4-6. عندما explanted في المختبر، الأسلاف NC الخضوع الذاتي تجديد، والهجرة تفرق في مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة بما في ذلك الخلايا العصبية، والدبق، وخلايا العضلات الملساء، والغضاريف والعظام. وكان أول وصف NC multipotency من explants من الأنبوب العصبي الطيور 7-9. في عزلة في المختبر من خلايا NC يسهل دراسة ديناميات NC بما في ذلك انتشار الأسلحة النووية، والهجرة، وmultipotency. مزيد من العمل في أنظمة الطيور والفئران أظهرت أن الخلايا explanted NC الاحتفاظ إمكاناتهم NC عندما زرعها مرة أخرى في جنين 10-13. لأن الحفاظ على هذه الخصائص الكامنة الخلوية في الأسلاف NC explanted، ويزدرع الأنبوب العصبي فحص يوفر خيارا جذابا لدراسة نورث كارولاينا في المختبر. من أجل التوصل إلى فهم أفضل للNC الثدييات، وقد استخدمت العديد من الأساليب لعزل سكان نورث كارولاينا. يمكن زرعها NC المستمدة من الأسلاف من ما بعد الهجرة مواقع في كل من جنين وتعليم الكبار لدراسة ديناميات الأسلاف نورث كارولاينا في مرحلة ما بعد الهجرة 11،14-20، ولكن بمعزل عن الأسلاف نورث كارولاينا حيث يهاجر من الأنبوب العصبي يوفر الحفاظ الأمثل لل NC الخلية المحتملة، والخصائص الكثيرة 13،21،22. بعض البروتوكولات توظيف مضان الفرز الخلية تفعيلها (FACS) لعزل السكان NC المخصب لأسلاف خاصة 11،13،14،17. ومع ذلك، عندما تبدأ الأجنة مرحلة مبكرة، وأرقام الخلية كافية لتحليل ويصعب الحصول على مع نظام مراقبة الأصول الميدانية، مما يعقد من عزلة populatio نورث كارولاينا في وقت مبكرنانوثانية من أجنة الفردية. هنا، نحن تصف النهج الذي لا يعتمد على نظام مراقبة الأصول الميدانية والنتائج في عدد السكان ما يقرب من 96٪ NC محض على أساس مراسل Wnt1، لجنة المساواة العرقية نسب المنشط 23. ويتم تكييف الطريقة المعروضة هنا من البروتوكولات الأمثل لثقافة NC الفئران 11،13. من مزايا هذا البروتوكول بالمقارنة مع الطرق السابقة هي أن 1) لا نمت الخلايا على طبقة التغذية، 2) نظام مراقبة الأصول الميدانية ليست مطلوبة للحصول على سكان NC نقي نسبيا، 3) يتم عزل الخلايا premigratory NC و 4) النتائج بسهولة كميا. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لعزل NC من أي نموذج الفأر الطافر، وتسهيل دراسة الخصائص NC مع التلاعب الجيني مختلفة. الحد من هذا النهج هو أن تتم إزالة NC من سياق جنين، والذي يعرف للتأثير على البقاء على قيد الحياة، والهجرة، والتمايز في نورث كارولاينا 2،24-28.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube at JoVE.com

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

العزلة من قمة العصبية الجنينية من الأنبوب العصبي يسهل استخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; طرق لدراسة الهجرة، وتجديد الذات، وmultipotency من قمة العصبية.

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

isolation-culture-neural-crest-cells-from-embryonic-murine-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.1K Views.  Vanderbilt University Medical Center. العزلة من قمة العصبية الجنينية من الأنبوب العصبي يسهل استخدام في المختبر طرق لدراسة الهجرة، وتجديد الذات، وmultipotency من قمة العصبية.

Video: Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent progenitor cells to be an integral part of the neural crest1. Phenotypically, neural crest stem cells (NCSC) are defined by simultaneously expressing p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) and SOX10 during their migration from the neural crest2,3,4,5. These progenitor cells can differentiate into smooth muscle cells, chromaffin cells, neurons and glial cells, as well as melanocytes, cartilage and bone6,7,8,9. To cultivate NCSC in vitro, a special neural crest stem cell medium (NCSCM) is required10. The most complex part of the NCSCM is the preparation of chick embryo extract (CEE) representing an essential source of growth factors for the NCSC as well as for other types of neural explants. Other NCSCM ingredients beside CEE are commercially available. Producing CCE using laboratory standard equipment it is of high importance to know about the challenging details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes. In this protocol we describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE.

To cultivate neural crest stem cells (NCSC) in vitro, a special medium (NCSCM) is required. Essential part of NCSCM is chick embryo extract (CEE). We here describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE, including details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes.

إنتاج استخراج الجنين الفرخ لزراعة الخلايا الجذعية العصبية الفئران كريست

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010). However, the study of mouse embryos in utero is limited by our inability to directly pharmacologically manipulate the embryos in isolation from the effects of maternal metabolism on the reagent of interest. Whether using a small molecule, recombinant protein, or siRNA, delivery of these substances to the mother, through the diet or by injection will subject these unstable compounds to a variety of bodily defenses that could prevent them from reaching the embryo. Investigations in cultures of whole embryos can be used to separate maternal from intrinsic fetal effects on development.
Here, we present a method for culturing mouse embryos using highly enriched media in a roller incubator apparatus that allows for normal neural tube closure after dissection (Crockett, 1990). Once in culture, embryos can be manipulated using conventional in vitro techniques that would not otherwise be possible if the embryos were still in utero. Embryo siblings can be collected at various time points to study different aspects of neurulation, occurring from E7-7.5 (neural plate formation, just prior to the initiation of neurulation) to E9.5-10 (at the conclusion of cranial fold and caudal neuropore closure, Kaufman, 1992). In this protocol, we demonstrate our method for dissecting embryos at timepoints that are optimal for the study of cranial neurulation. Embryos will be dissected at E8.5 (approx. 10-12 somities), after the initiation of neural tube closure but prior to embryo turning and cranial neural fold closure, and maintained in culture till E10 (26-28 somities), when cranial neurulation should be complete.

A method allowing for direct pharmacological manipulation of mouse embryos during neurulation that bypasses maternal metabolism is described. The technique can be adapted to study different aspects of neurulation by varying the time point and pharmacological agent.

اختتام العصبية أنبوب في الثقافة ماوس الأجنة الجامعة

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010).  However, the study of mouse ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

العزلة وثقافة العصبية الخلايا الجذعية من بصيلات الشعر كريست الإنسان

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

العزلة والثقافة من خلايا الفئران العصبية الجنينية: بروتوكول سريعة

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية من الجنينية الدماغ المقدم

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

خالية من التغذية اشتقاق الخلايا العصبية كريست السلف من افرة القوة البشرية الخلايا الجذعية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية البالغة العصبية من المنطقة تحت الثفني ماوس

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

<meta charset="utf8"></head><body>كفاءة النواة من NSCs المعزولة من منطقة البطين تحت البطين الفئران

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) as mitogens, producing clonal aggregates known as neurospheres. This in vitro system is a valuable tool for studying NSC potential. Transfection of siRNAs or genes carried in plasmids can be used to induce perturbations to gene expression and study NSC biology. However, the exogenous nucleic acid delivery to NSC cultures is challenging due to the low efficiency of central nervous system (CNS) cells transfection. Here, we present an improved nucleofection system that achieves high efficiency of gene delivery in expanded NSCs from adult murine SVZ. We demonstrate that this relatively simple method enhances gene perturbation in adult NSCs, surpassing traditional transfection protocols with survival rates exceeding 80%. Moreover, this method can also be applied in primary isolated NSCs, providing a crucial advancement in gene function studies through gene expression manipulation via knockdown or overexpression in neurosphere cultures.

<meta charset="utf8"></head><body>تسليط الضوء على المؤلف: تحسين النواة لتوصيل الجينات عالية الكفاءة في مزارع الخلايا الجذعية العصبية المشتقة من منطقة البطين تحت البطين

Here, we describe a nucleofection system designed to enhance gene delivery efficiency in expanded neural stem cells (NSCs) isolated from the adult murine subventricular zone. The findings demonstrate that this method significantly improves gene perturbation in NSCs, surpassing the effectiveness of traditional transfection protocols and enhancing cell survival rate.

عزل وتوسع ونواة الخلايا الجذعية العصبية من منطقة تحت البطين الفئران البالغة

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented ...