我们要感谢马克·沃兹尼亚克视频援助。我们也想承认在得克萨斯大学西南肖恩·莫里森的培养大鼠数控细胞的原始协议。这项工作是支持范德比尔特大学医学中心的学术计划支持，由国立卫生研究院（HD36720，HD036720-11S109）和的果酸11GRNT7690040的为PAL，从AHA（0615209B）和国立卫生研究院（NS065604）博士前奖学金不结盟运动，和ERP赠款由美国国立卫生研究院培训资助T32HD007502支持。

1。准备板<ol><li>在任何时候使用无菌技术。 </li><li>纤维连接蛋白（FN）Dulbecco的PBS（DPBS）在3.3毫升的稀释成终体积100μL人体血浆FN的股票准备。终浓度为30微克/毫升，这可以在4°C保存1周。 </li><li>覆盖的底部，并让每个无菌组织培养与FN的解决方案4孔板以及坐了15分钟。确保覆盖整个表面。在这段时间内（步骤2和3）媒体。 </li><li>删除FN的解决方案，并让板干燥。轻轻冲洗井与500μL的DMEM培养液，去除培养液，添加500μL的自我更新（SR）中（见下文）。在37°C的潮湿含5％ 二氧化碳培养箱中孵育。完成这个约一小时前清扫，使板块将使用前干燥。 </li></ol> 2。准备简中等<ol><li>为迷走神经和主干数控文化从10个克隆胚胎（约一乱抛垃圾，取决于遗传背景的鼠标线），准备25毫升的SR培养基。结合低血糖12.5毫升培养液，7.5毫升的Neurobasal中等，25μL维甲酸（117微米的最终浓度），25μL2 - 巯基乙醇（50毫米终浓度）。拌匀。 </li><li>加入3.75毫升鸡胚提取物，250μL的氮盐的补充，500μL，B27的补充和250μL的青霉素，链霉素（终浓度1％）。通过0.22微米的过滤器的过滤介质。 </li><li>加入10微升无菌IGF1的（20μg/ mL的终浓度）和20μL无菌碱性成纤维细胞生长因子（20μg/ mL的终浓度）。混合相。保存于4°C。 </li></ol> 3。准备洗净中等<ol><li>约10胚胎准备清洗液50毫升。结合35毫升低糖DMEM培养液，15毫升的Neurobasal中等，和500μL的青霉素，链霉素（终浓度1％）50毫克，牛血清白蛋白。 0.22无菌过滤微米过滤器。 </li></ol> 4。准备胶原酶/ Dispase酶<ol><li>加入50μL100 mg / mL胶原酶/ Dispase酶5毫升DPBS。拌匀。 </li><li>注射器用0.2微米的过滤器过滤和添加到三个井的12孔板每1.5毫升。吸取约1毫升，其余井洗介质。存储整个冰板，直到准备好消化解剖组织。 </li><li>削减1 P20和P1000移液器过滤嘴用无菌刀片的技巧。削减略低于针尖的斜面边缘。削减了P1000将用于转移整个胚胎，而P20将用于传输孤立的组织块。 </li></ol> 5。从9.5 DPC胚胎分离迷走神经干的神经管<ol><li>与对于超时怀孕，阴道塞坝被认为是在中午0.5 DPC上午插头观察。牺牲和删除9.5 DPC的子宫​​。 </li><li>删除从子宫蜕膜和轻轻ŕemove的胚胎从蜕膜。一旦该协议经历，隔离在无菌DPBS 3-4 9.5 DPC胚胎。使用无菌技术和消毒清扫工具。仪器可以灭菌消毒，热杀菌或乙醇的培养。 </li><li>对于前迷走神经数控：使用胰岛素针，切中期耳基板的神经管。再次削减在第 4 届体节的后边缘。修剪消除咽弓和心脏神经管腹侧组织。 </li><li>为主干数控：使用胰岛素针，取出部分之间的神经管体节16-22（或如果胚胎发育早于22体节期的最后体节）。 </li><li>保持卵黄囊和任何剩余胚胎的基因分型组织。 </li></ol> 6。拆除非神经外胚层和中胚层<ol><li>将神经管胶原酶/​​ Dispase酶分割成包含在室温下10分钟第立即洗涤液洗。 </li><li>返回组织无菌DPBS。使用无菌胰岛素针，轻轻地从组织中删除非神经外胚层远离神经管分离体节。最后剩下的部分中胚层体节组织可以去掉研制过程中轻轻用截止P20尖。小心不损害神经管。密切观察这期间研磨。 </li><li>通过第二个和第三个30洗介质的第二洗，将孤立的神经管。 </li><li>在SR培养基洗一次，孤立的神经管放入一个FN涂层以及准备（步骤1.3）的中心。加湿缺氧室，无菌水菜。菜放入低氧室和冲洗室至3％的O 2（含1％O 2 6％CO 2，93％N2混合使用坦克）的混合气体。 </li><li>总是处理室非常仔细，以确保THAţ植原状，并留在井的中心。 </li><li>在37°C。步骤5-6摘要如图1所示。 </li></ol> 7。去除神经管<ol><li>培养24小时后，取出神经管神经管细胞迁移使用无菌胰岛素针距边缘轻轻逗​​弄。从中期的神经管在步骤6.2使用无菌P20停产删除和丢弃和更换介质，用新鲜的SR中（ 图2）。这是最容易使用倒置显微镜。 </li></ol> 8。代表结果经过24小时的潜伏期在37°C在缺氧条件下，数控细胞迁移的神经管在一个近乎纯的人口（ 图3a）。有时，小于理想的文化，不会产生强大的副产物。例如，它是可能的后24小时内ţ蜷缩着他的神经管会根据本身和数控不会迁移从神经管（ 图3b）。偶尔，神经管不会附加到纤维连接蛋白涂层板。 次优数控迁移或神经管附件的问题，在我们的经验，可以产生不利影响常氧条件或纤维连接蛋白的浓度，分别为。胶原酶/ Dispase酶的酶活性略有不同批次和消化时间必须适当调整，但不超过十五分钟消化组织不再。过量也会导致含有胶原酶/ Dispase酶在组织神经管缺陷的副产物。如果体节的组织是不会轻易从神经管胶原酶/​​ Dispase酶在孵化后取出，神经管可以培养超过10分钟。神经管有时会不重视基板。如果是这种情况，仔细检查fibronec锡浓度和缺氧的条件。 虽然常氧条件下可用于文化野生型数控，缺氧条件下，更加紧密地模仿体内环境29,30。根据我们的经验，缺氧条件下成为关键的时候培养突变数控。例如，当突变数控Foxd3在常氧条件下培养，主干数控大大降低细胞生长与对照组相比。这一产物大小悬殊被删除时，外植体在缺氧条件下培养（ 图4）。此外，野生型神经管外植体时，在常氧培养，凋亡阳性细胞数大于缺氧培养的类似植（​​数据未显示）。维持在缺氧的所有NC文化，比较可以更方便地进行动态控制和突变文化之间。 <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig1.jpg" alt="图1" /> <strong&gt;图1。数控隔离的整体示意图。甲）从胚胎解剖感兴趣的地区。乙）为10分钟（不超过十五分钟）胶原酶/ Dispase酶消化，神经管。 c）清洗在清洗介质。四）解剖了非神经外胚层和中胚层。英法）洗涤液洗两次。 G）的自我更新介质板。在37°C孵育在3％O 2和缺氧条件下。 <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig2.jpg" alt="图2" /> 图2。神经管植逐步去除。神经管的，必须拆除后24-48小时，以防止污染与非数控细胞。一）注意神经管和NC的产物（实线）之间的边界。 b）切割神经管的边缘，随着胰岛素的针。三）丢弃的神经管，并更换新鲜的自我更新介质的介质。虚线表示程度的产物。缩写：新台币，神经管。 图3。代表结果的例子。一）培养24小时后典型的外植体在缺氧条件下的自我更新介质的产物（虚线表示程度的产物）。 b）放大后，48小时在文化的数控产物。 c）不太理想的文化产物产量低。 A和C在相同条件下进行培养。图片展示文化鲁棒性的自然范围。这可能会影响神经管隔离，FN的浓度，缺氧条件下，胶原酶/ Dispase酶消化时间效率。 <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig4.jpg" alt="图4" /> 图4。 在体外常氧与缺氧数控植文化分析。控制（野生型）数控从神经管植在常氧培养条件下48小时后的细胞迁移。相比之下，Foxd3突变数控大大降低细胞在常氧副产物（红色标记边缘轮廓的数控副产物）。可比植体缺氧条件下生长时，Foxd3突变数控植可比增长控制，使后续分析。请注意，此行为与与Foxd3突变数控体内的行为。

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A., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+and+isolation+of+enteric+nervous+system+progenitors+using+Sox2.">Prospective identification and isolation of enteric nervous system progenitors using Sox2.</a> Stem Cells. 29, 128-140 (2011).</li><li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+in+reduced+levels+of+oxygen+promotes+clonogenic+sympathoadrenal+differentiation+by+isolated+neural+crest+stem+cells.">Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells.</a> J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cell+multipotency+requires+Foxd3+to+maintain+neural+potential+and+repress+mesenchymal+fates.">Neural crest stem cell multipotency requires Foxd3 to maintain neural potential and repress mesenchymal fates.</a> Development. 138, 641-652 (2011).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling.">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development. 133, 99-106 (2006).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling+is+essential+for+cranial+neural+crest+migration+and+trigeminal+ganglion+condensation.">Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation.</a> Dev. Neurobiol. 67, 47-56 (2007).</li><li>Kasemeier-Kulesa, J. C., Bradley, R., Pasquale, E. B., Lefcort, F., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph/ephrins+and+N-cadherin+coordinate+to+control+the+pattern+of+sympathetic+ganglia.">Eph/ephrins and N-cadherin coordinate to control the pattern of sympathetic ganglia.</a> Development. 133, 4839-4847 (2006).</li><li>Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin/neuropilin+signaling+influences+the+positioning+of+migratory+neural+crest+cells+within+the+hindbrain+region+of+the+the+chick.">Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the the chick.</a> Dev. Dyn. 232, 939-949 (2005).</li><li>Schwarz, Q., Maden, C. H., Vieira, J. M., Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin+1+signaling+guides+neural+crest+cells+to+coordinate+pathway+choice+with+cell+specification.">Neuropilin 1 signaling guides neural crest cells to coordinate pathway choice with cell specification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6164-6169 (2009).</li><li>Simon, M. C., Keith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxygen+availability+in+embryonic+development+and+stem+cell+function.">The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 285-296 (2008).</li><li>Ivanovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+or+in+situ+normoxia:+The+stem+cell+paradigm.">Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm.</a> J. Cell Physiol. 219, 271-275 (2009).</li></ol>

我们什么都没有透露。

小心应注意的胚胎发育阶段，以确保这种方法的成功。计数小鼠早期胚胎的体节是匹配的胚胎内的枯枝落叶，并确定正确地区神经管隔离阶段的关键。一个或两个胚胎体节之间的变化是在合理的范围内的发展时机，取决于进行试验的决议。 DPC 9和9.5之间的胚胎将有17和25体节之间。如果胚胎拥有超过25体节，是进一步推进数控发育时间，数控副产物，将在文化，那么强劲。分期根据胚胎体节数，便?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 试剂 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td><td> 评论 </td></tr><tr><td> DMEM培养基（低糖） </td><td> GIBCO / Invitrogen公司</td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td>的Neurobasal中等</td><td> Gibco公司</td><td> 21103 </td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>西格玛</td><td> A3912-10G </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco公司</td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> IGF1的</td><td> BD公司</td><td> 354037 </td><td>储存在50微克/毫升，分装在-20°C </td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子</td><td> BD公司</td><td> 354060 </td><td>在25微克/毫升分装保存在-20°C </td></tr><tr><td>纤维连接蛋白</td><td> Gibco公司</td><td> 33016-015 </td><td>存储在为1mg/mL人iquots在-20°C。 </td></tr><tr><td>维甲酸</td><td>西格玛</td><td> R2625 </td><td>乙醇在-20°C重组后，在35微克/毫升分装店</td></tr><tr><td> 2 - 巯基乙醇</td><td>西格玛</td><td> D - 5637 </td><td></td></tr><tr><td> 氮的补充</td><td> Gibco公司</td><td> 17502-048 </td><td></td></tr><tr><td> B27的补充</td><td> Gibco公司</td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> steriflip 0.22微米的过滤器</td><td> Millipore公司</td><td> SCGP00525 </td><td></td></tr><tr><td>青霉素链霉素</td><td> Invitrogen公司</td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> 0.20微米的过滤器</td><td>康宁</td><td> 431219 </td><td></td></tr><tr><td>注射器（过滤） </td><td> BD公司</td><td> 301604 </td><td></td></TR&gt; <tr><td>四孔板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td>胶原酶/ Dispase酶</td><td>罗氏公司</td><td> 269​​ 638 </td><td>活动由一批不同。储存在-20°C 100毫克/毫升等分</td></tr><tr><td>胰岛素针 （29半规） </td><td>贝克顿·迪克森</td><td> 309306 </td><td></td></tr><tr><td>缺氧商会</td><td>比卢普斯-罗滕伯格</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氧分析仪</td><td>比卢普斯-罗滕伯格</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子＃5 </td><td>罚款科学工具</td><td></td><td>为消除子宫和蜕膜。 </td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25％） </td><td> Gibco公司</td><td> 25200 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and culture of neural crest cells from embryonic murine neural tube

胚胎神经嵴（数控）是一个多能祖人口，背神经管方面的，经历了一个上皮间质转化（EMT）和迁移整个胚胎，从而引起不同的细胞类型1-3。数控也有独特的能力，影响靶器官4-6的分化和成熟。 在体外 explanted时，数控祖细胞进行自我更新，迁移和分化成各种组织类型，包括神经元，神经胶质细胞，平滑肌细胞，软骨和骨。 数控多能首次描述7-9禽流神经管的外植体。数控细胞体外分离，有利于数控加工动力学研究，包括细胞增殖，迁移和多能。在禽流感和大鼠系统的进一步工作表明，explanted数控细胞保留其数控潜力，移植胚胎10时-13。因为这些固有的保存explanted数控祖细胞特性，神经管外植体检测提供了一个有吸引力的选择研究在体外数控。 为了达到更好地了解了哺乳动物的数控，许多方法已受聘隔离数控人口。数控源性祖细胞培养胚胎和成年后洄游数控祖11,14-20研究动态，可以从迁移后的位置然而数控祖细胞的分离，因为他们从神经管移民提供最佳的保护， NC细胞的潜力和洄游特性13,21,22。有些协议采用荧光激活细胞分类（FACS）来隔离丰富的NC为11,13,14,17尤其祖人口。然而，与早期胚胎开始时，细胞数量足够用于分析是很难获得与流式细胞仪，复杂的隔离早期数控人群的从单个胚胎的NS。在这里，我们描述的方法，不依赖流式细胞仪和结果约96％的纯数控1 WNT1-Cre重组酶激活血统记者23人口。 这里介绍的方法是改编从大鼠数控11,13文化优化的协议。以前的方法相比，这种协议的优点是：1）细胞生长饲养层，2）没有需要获得一个相对纯净的的数控人口，3）premigratory数控细胞分离和4流式细胞仪）的结果很容易量化。此外，该协议可用于数控隔离任何突变小鼠模型，促进数控特点与不同的基因操作的研究。这种方法的局限性是数控的胚胎，这是众所周知的影响数控2,24-28的存活，迁移和分化的背景下删除。

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Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

胚胎神经嵴的神经管分离，便于使用<em&gt;在体外</em&gt;学习迁移，自我更新和多能神经嵴的方法。

从小鼠胚胎神经管的神经嵴细胞的分离和培养

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

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