وأيد هذا العمل من قبل المنح لFZ من المعاهد الوطنية للصحة (R01NS064288) وكريغ H. مؤسسة نيلسون.

1. إعداد Coverslips، متوسط ​​الثقافة، وإنزيمات الهضم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتستخدم في الجولة ال 12 مم # 1 coverslips زجاج للثقافة العصبية. يتم تنظيف coverslips مع 10٪ HCL ثم بين عشية وضحاها من قبل غسل بالموجات فوق الصوتية مع الماء المقطر ومنزوع الأيونات لمدة 3 مرات (20 دقيقة / الساعة). يتم تخزين coverslips تنظيفها في الايثانول 70٪ للاستخدام في المستقبل. قبل كل التجارب، coverslips هي الهواء يجفف ويوضع في لوحة الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى معطف يضاف coverslips المجففة، 100 ميكروليتر من محلول الطلاء التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل بولي-D-ليسين و 10 ميكروغرام / مل Laminin العمل على حل كل ساترة، ويتم نقل لوحة الثقافة في الحاضنة 37 درجة مئوية. 1-2 بعد ساعة، تتم إزالة حل الطلاء ويتم غسل coverslips 3 مرات مع PBS 1X العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد ثقافة المتوسط، ومتوسط ​​الحد الأدنى الأساسي (MEM) وتستكمل مع مصل الدم 5٪ بقري جنيني (FBS)، 1X البنسلين، الستربتوميسين حل (500 وحدة من penicilلين و 500 ميكروغرام من الستربتوميسين)، 1X الملحق GlutaMAX-I، والكواشف التي تحتوي على مضاد التفتل 20 ميكرون 5-الفلوري-2-deoxyuridine و 20 يوريدين ميكرومتر (FDU / R). للوسط المصل خالية، يتم استبدال FBS مع ملحق B27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وكولاجيناز يتم إعداد حل عن طريق إذابة كولاجيناز ومسحوق مع MEM لجعل تركيز العمل من 1 ملغ / مل. لالتربسين، يتم استخدام TrypLE 1X اكسبرس. </li></ol> 2. تشريح والحصاد من الكبار الفأر الخلايا العصبية DRG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد euthanizing ال 6 - لفأر بالغ 10 أسابيع من العمر، وإزالة جلد ظهري وقطع العمود الفقري بأكمله. غسل العمود الفقري مع إزالة 1 مرات X 2-3 برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دبوس العمود الفقري لإزالة لوحة تشريح مع ما يصل الجانب بطني، ويزيل بعناية العضلات لكشف الأعصاب الحسية تحت المجهر تشريح. الأعصاب المتصلة DRGs على مستوى الخشب هي سمكا وسهلة لتحديد مكان. ولذلك، بالنسبة لمعظم التجارب فقط قطنيويتم حصاد DRGs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من خلال قطع كل فقرة على طول محور مع مقص صغير وإزالة بعناية الأقراص الفقرية. باستخدام ملقط لتقسيم كل فقرة لفضح الحبل الشوكي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتشريح خارج DRGs الخشب، ترفع كل عصب الخشب مع ملقط وتعقب نحو الحبل الشوكي لتحديد موقع DRGs المرتبطة قطني (من L1 الى L6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع كل DRG من الأعصاب الطرفية المرفقة، جذور ظهري وبطني مع مقص الربيع، وتخزينها في أنبوب microfuge مع متوسط ​​MEM وضعت على الجليد. ويمكن تشريح أكثر DRGs على مستويات مختلفة في العمود الفقري (DRGs الصدري على سبيل المثال) بطريقة مشابهة عندما يكون ذلك ضروريا. </li></ol> 3. هضم والتفكك من الكبار الفأر الخلايا العصبية DRG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد جمع كل DRGs تشريح، يستعاض عن متوسط ​​MEM مع كولاجيناز 1 مل الى حل واحتضان أنبوب microfuge على 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال كولاجيناز حل مع 500 ميكرولتر اكسبرس TrypLE 1X ذلكlution واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحل السريع TrypLE ويغسل DRGs مع 1 مل الثقافة المتوسطة المعدة (التي تحتوي على 5٪ FBS) لمدة 3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخرج ماصة معلومات سرية إضافة 600 مستنبت ميكرولتر وماصة بلطف صعودا ونزولا إلى يسحن الأنسجة لمدة 20-30 مرات باستخدام 1 مل أزرق،. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد سحن، والسماح للأنسجة غير فصلها ليستقر على الجزء السفلي من microfuge ونقل تعليق خلية إلى أنبوب معقم 10 مل. إضافة آخر 600 مستنبت ميكرولتر وكرر الخطوة سحن حتى معظم الأنسجة وفصلها. تعليق خلية تم الحصول عليها على كل من الخلايا العصبية والخلايا غير العصبية. في معظم الحالات، يتم استخدام خلايا من 6 DRGs (~ 5 X10 4) عن رد فعل electroporation واحد. </li></ol> 4. التلاعب الجيني للخلايا العصبية عبر Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حل ترنسفكأيشن عن طريق خلط الحل nucleofection Amaxa عن الخلايا العصبية الماوس مع البلازميدات الحمض النووي (~ 10 ميكروغرام) أو oligos سيرنا (حوالي 0.2 نانومول) لجعل حجم نهائي قدره 100 ميكروليتر لكل ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منبذة الخلايا فصل في 680 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل طاف قدر الإمكان. إضافة حل ترنسفكأيشن المعدة وماصة بلطف صعودا ونزولا 3-4 مرات مع 200 ميكرولتر نصائح ماصة للعودة لوقف الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية مختلطة مع حل ترنسفكأيشن إلى كوفيت electroporation وelectroporate الخلايا باستخدام نظام Nucleofector Amaxa برنامج G-013. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد electroporation، إضافة على الفور 500 ميكرولتر من قبل حرارة (37 درجة مئوية) متوسط ​​الثقافة التي تحتوي على FBS لكفيت ونقل عن الحل (~ 600 ميكرولتر) في لوحة الثقافة المغلفة في كثافة الخلية المطلوب. عن التجربة التي تتطلب اعادة التعليق وإعادة الطلاء، يتم استزراع الخلايا العصبية مباشرة على طبق من البلاستيك في ثقافة عالية الكثافة (10000-20000 خلايا / جيد). عن التجربة التي يدرس مباشرة نمو محور عصبي، الخلايا العصبية هي ونط مطليس coverslips الزجاج المطلي في أقل كثافة (3000-5000 خلايا / جيد). وضع لوحة الثقافة في الحاضنة (37 درجة مئوية، ونسبة 5٪ CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أربع ساعة بعد تصفيح عندما الخلايا العصبية والتي تعلق على ركائز، استبدال بلطف الثقافة المتوسطة (الذي يحتوي على حل nucleofection Amaxa) مع 500 ميكرولتر المتوسطة ثقافة جديدة ومرحلة ما قبل حرارة، والعودة إلى لوحة الحاضنة للثقافة إضافي (37 درجة مئوية ، ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2). يمكن استخدامها على حد سواء ثقافة المتوسط ​​تحتوي على FBS أو وسيلة خالية من المصل في هذه الخطوة. </li></ol> 5. زراعة الخلايا العصبية الكبار DRG لتحليل النمو أكسون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالخلايا العصبية transfected مع البلازميدات الحمض النووي، يمكن ملاحظة التعبير عن الجينات الفائدة من (على سبيل المثال EGFP) في وقت مبكر باعتباره ساعة بعد بضعة electroporation. لالخلايا العصبية transfected مع siRNAs، ونحن ننتظر عادة 3-4 أيام للسماح للنضوب كافية من البروتينات الذاتية. يمكن أن الخلايا العصبية مثقف إما ثابتة مباشرة لتحليل نمو محور عصبي في فاريولنا مرة نقاط (1-4 أيام بعد electroporation) أو إعادة مع وقف التنفيذ وإعادة مطلي لتحليل محور عصبي إعادة النمو (انظر أدناه) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للدراسات الخسارة من وظيفة رني بوساطة، يمكن أن الخلايا العصبية مثقف اعادة مع وقف التنفيذ وإعادة مطلي السماح للمحاور عصبية من الخلايا العصبية لتنمو، والتي هي نضبت بالفعل البروتينات المستهدفة. للقيام بذلك، استبدال ثقافة المتوسط ​​القديم من الخلايا العصبية ذات الكثافة العالية مع مثقف 1 حبة متوسطة الحجم قبل حرارة مل الطازجة وماصة بلطف صعودا ونزولا ل6-10 مرات لاعادة وقف الخلايا العصبية المرفق من لوحة الثقافة. لأن الخلايا غير العصبية (مثل خلايا شوان) نعلق أكثر صرامة بكثير للثقافة طبق من الخلايا العصبية، الخلايا إعادة المعلقة هي في معظمها الخلايا العصبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا العصبية اعادة مع وقف التنفيذ في أنبوب microfuge ويسحن بلطف 10-15 مرة لإعادة فصل كتل الخلية في تعليق خلية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة لوحة الخلايا العصبية إعادة فصلها على coverslips أعدت حديثا في منخفض الكثافة (3000-5000 خلايا / جيد)، والثقافة بين عشية وضحاها (16-24 ساعة). </li></ol> 6. تثبيت والمناعة تلطيخ، والتصوير الإسفار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح على المديين المتوسط ​​واضافة لامتصاص العرق 4٪ (منهاج العمل) (200 ميكروليتر / جيد) لعلاج هذه الخلايا ل15-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم تغسل الخلايا ثابت مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة حل حجب (1٪ مصل بقري، تريتون 0.1٪ X-100، و 2.0٪ مصل الماعز العادي في برنامج تلفزيوني 1X) إلى الخلايا العصبية ثابتة لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على محاور عصبية التسمية، والخلايا العصبية والمناعية الملون مع المضادة للneurofilaments أو المضادة للأجسام المضادة βIII تويولين. للقيام بذلك، ضع قطرة من حل 30μl الأضداد الابتدائي (1:1200 تخفيف ل-βIII الضد تويولين) على parafilm لكل ساترة. قلب لcoverslips ووضعها على الحل الضد الأولية لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة coverslips إلى لوحة الثقافة الأصلية، وغسلها مع PBS 1X لمدة 3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر نفس الإجراء بالنسبة للثانويةtibody. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips مع الماء المقطر لمدة 3 مرات، وبعد ذلك شن coverslips على شرائح الزجاج مع تصاعد حل (على سبيل المثال إطالة Antifade الذهب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ولا يمكن تصوير الخلايا العصبية الملون مع أي نظام مضان المجهر مزودة كاميرا رقمية. ويتم قياس أطوال محور عصبي وتحليلها مع برامج التحليل والتصوير. </li></ol> 7. ممثل النتائج في غياب أي عوامل النمو خارج الخلية المضافة، والخلايا العصبية DRG الكبار عادة ما تبدأ في النمو المحاوير 48 ساعة بعد تصفيح الأولى. على محاور عصبية وغالبا ما تظهر morphologies متفرعة (الشكل 1). في المقابل، فإن الخلايا العصبية إعادة مطلي البدء في توسيع نطاق محاور عصبية سوى ساعة وبعد بضعة الطلاء، واستطال محاور عصبية مع المتفرعة خفضت كثيرا (الشكل 2). هذه النتائج تشير إلى أن إعادة مطلي الخلايا العصبية تتقاسم خصائص مشابهة لتلك الخلايا العصبية تكييف lesioned. باستخدام هذا النهج، ولقد قمنا مؤخرا الخسارةمن وظيفة دراسات لبحث دور للتجديد محور عصبي عامل النسخ المرتبطة ج يونيو في نمو محور عصبي من البالغين الخلايا العصبية DRG في المختبر. أظهرت النتائج أن electroporation من مجموعة من 4 siRNAs مختلفة تستهدف مناطق مختلفة من C-يونيو (ON-TARGETplus) انخفضت بشكل ملحوظ في مستويات البروتين من طراز C-يونيو في الخلايا العصبية DRG البالغ 3 أيام بعد ترنسفكأيشن (الشكل 3) 9. وانخفض بشكل ملحوظ عندما الخلايا العصبية اعيد مطلي ومثقف بين عشية وضحاها، ونمو الخلايا العصبية من محور عصبي ضربة قاضية ج يونيو (التحكم: 348.37 ± 16.21mm؛ SI-C-يونيو: 262،32 ± 15،69 ميكرون، الشكل 3) 9. هذه النتائج تشير إلى أن DRG الكبار مثقف الخلايا العصبية توفير نظام نموذجا مفيدا لدراسة نمو الخلايا العصبية من محور عصبي بالغ. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig1.jpg" /> الشكل 1. الخلايا العصبية DRG الكبار الماوس تربيتها في كثافة منخفضة لمدة 3 أيام. تم صبغ الخلايا العصبية مع مضاد - &amp; Bايتا؛ الثالث الضد تويولين. لاحظ أن معظم محاور عصبية تظهر morphologies متفرعة. مقياس شريط: 125 ميكرون. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig2.jpg" /> الشكل 2. إعادة طلاء فأر بالغ DRG الخلايا العصبية بعد 3 أيام في الثقافة. (أ) الخلايا العصبية DRG الكبار تربيتها في كثافة عالية لمدة 3 أيام. (ب) تم زرعها إعادة مطلي الخلايا العصبية DRG الكبار في كثافة منخفضة ليلة وضحاها. لاحظ أن معظم محور عصبي تظهر morphologies ممدود مع المتفرعة محور عصبي قليلا. مقياس شريط: 250 ميكرون في A و 125 ميكرون في B. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig3.jpg" /> الشكل 3. دور ج يونيو في نمو الخلايا العصبية من محور عصبي DRG الكبار في المختبر. (أ) تحليل لطخة غربية من طراز C-يونيو في فأر بالغ DRG الخلايا العصبية بعد electroporation من طراز C-يونيو siRNAs. والنتيجة تظهر مستوى انخفضت بشكل ملحوظ من طراز C-يونيو (ب) نمت الخلايا العصبية تحكم transfected مع EGFP محاور عصبية بعد فترة طويلة من إعادة طلاء والثقافة بين عشية وضحاها. (ج) الرئيسان العابرfection من طراز C-يونيو siRNAs وEGFP نمو محور عصبي من ضعف بالغ الخلايا العصبية DRG بعد إعادة طلاء والثقافة بين عشية وضحاها. الحمراء: Tuj-1 تلطيخ؛ الأخضر: EGFP. مقياس شريط: 125 ميكرون. وقد نشرت هذه النتائج في Saijilafu وآخرون. 9.

<ol>
	<li>Yiu, G., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+inhibition+of+CNS+axon+regeneration.">Glial inhibition of CNS axon regeneration.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).</li><li>Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Intrinsic+Mechanisms+of+Axon+Regeneration.">Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration.</a> Annu. Rev. Neurosci. , (2010).</li><li>Zhou, F. Q., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+control+of+developmental+and+regenerative+axon+growth.">Intracellular control of developmental and regenerative axon growth.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).</li><li>Neumann, S., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+dorsal+column+fibers+into+and+beyond+the+lesion+site+following+adult+spinal+cord+injury.">Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury.</a> Neuron. 23, 83-91 (1999).</li><li>Liu, R. Y., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+signaling+pathways+mediate+regenerative+versus+developmental+sensory+axon+growth.">Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth.</a> J. Neurosci. 21, RC164 (2001).</li><li>Zhou, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins+support+regenerative+axon+assembly+over+CSPGs+by+an+ECM-integrin-independent+mechanism.">Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism.</a> J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).</li><li>Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axotomy-induced+Smad1+activation+promotes+axonal+growth+in+adult+sensory+neurons.">Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons.</a> J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).</li><li>Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF-induced+axon+growth+is+mediated+by+localized+inactivation+of+GSK-3beta+and+functions+of+the+microtubule+plus+end+binding+protein+APC.">NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC.</a> Neuron. 42, 897-912 (2004).</li><li>Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+axon+regeneration+via+in+vivo+electroporation+of+adult+mouse+sensory+neurons.">Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons.</a> Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).</li><li>Costigan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicate+high-density+rat+genome+oligonucleotide+microarrays+reveal+hundreds+of+regulated+genes+in+the+dorsal+root+ganglion+after+peripheral+nerve+injury.">Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury.</a> BMC Neurosci. 3, 16 (2002).</li><li>Xiao, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+gene+expression+profile+of+dorsal+root+ganglion+in+the+rat+peripheral+axotomy+model+of+neuropathic+pain.">Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).</li><li>Michaelevski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+to+transcription+networks+in+the+neuronal+retrograde+injury+response.">Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response.</a> Sci. Signal. 3, ra53 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الكبار الخلايا العصبية DRG تجديد المحاور العصبية الخاصة بقوة بعد اصابة الأعصاب الطرفية في والمجراة في المختبر، وبالتالي توفير نظام مفيد لدراسة تجديد محور عصبي في الحيوانات البالغة. في ثقافة المختبر من الخلايا العصبية DRG الكبار أصبحت الطريقة المستخدمة ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> MEM </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> بولي-D-يسين هيدروبروميد </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> إينفيتروجن </td><td> 23017-015 </td></tr><tr><td> 5-الفلوري-2-deoxyuridine </td><td> سيغما الدريخ </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> يوريدين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> U3003 </td></tr><tr><td> كولاجيناز A </td><td> روش </td><td> 10103578001 </td></tr><tr><td> TrypLE اكسبرس </td><td> إينفيتروجن </td><td> 12604-013 </td></tr><tr><td> مصل بقري جنيني </td><td> إينفيتروجن </td><td> 10270-098 </td></tr><tr><td> البنسلين، الستربتومايسين (100X) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15140-122</td></tr><tr><td> GlutaMAX-I (100X) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 35050-038 </td></tr><tr><td> زجاج coverslips (# 1) </td><td> علوم المجهر الإلكتروني </td><td> 72196-12 </td></tr><tr><td> 24 ثقافة الخلية جيدا لوحة </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CV </td></tr><tr><td> معقم، والماء المقطر منزوع الأيونات </td><td> Mediatech </td><td> 25-055-CV </td></tr><tr><td> Nucleofector وelectroporation الكاملة للالخلايا العصبية ماوس </td><td> Lonza </td><td> VPG-1001 </td></tr><tr><td> ON-TARGETplus سيرنا ضد ج يونيو </td><td> Dharmacon </td><td> L-043776 </td></tr><tr><td> المضادة - βIII الضد تويولين (Tuj-1) </td><td> كوفانس </td><td> MMS-435P </td></tr><tr><td> إطالة الذهب حل Antifade تصاعد </td><td> إينفيتروجن </td><td> P36930 </td></tr></tbody&gt; </table>

genetic study of axon regeneration with cultured adult dorsal root ganglion neurons

ومن المعلوم أن الخلايا العصبية الناضجة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) لا يمكن تجديد المحاور العصبية الخاصة بهم بعد الإصابات بسبب تضاؤل ​​القدرة الذاتية لدعم نمو محور عصبي وبيئة معادية في الجهاز العصبي المركزي 1،2 ناضجة. في المقابل، الخلايا العصبية الناضجة في النظام العصبي الطرفي (المحيطي) تجديد بسهولة بعد إصابة 3. ومن المعروف جيدا الكبار عقدة الجذر الظهري (DRG) لتجديد الخلايا العصبية بقوة بعد إصابات الأعصاب الطرفية. كل عصبون DRG ينمو 1 محور عصبي من سوما الخلية، التي الفروع إلى فرعين محواري: فرع الطرفية التعصيب أهداف الطرفية وفرع الوسطى تمتد إلى النخاع الشوكي. إصابة نتائج المحاور الطرفية DRG في تجديد محور عصبي كبير، في حين أن المحاور العصبية المركزية في النخاع الشوكي تجديد سيئة بعد وقوع الضرر. ومع ذلك، إذا كان الضرر الطرفية محواري يحدث قبل إصابة الحبل الشوكي (عملية تسمى الآفة تكييف)، والتجديد من المحاور المركزية greatlتحسن Y 4. وعلاوة على ذلك، فإن محاور عصبية من الخلايا العصبية المركزية DRG مشاركة في بيئة معادية لها نفس التنازلي المحاوير القشري في النخاع الشوكي. معا، هو الافتراض أنه يمكن تسخير الآليات الجزيئية التي تتحكم في تجديد الخلايا العصبية من محور عصبي DRG الكبار لتعزيز الجهاز العصبي المركزي تجديد محور عصبي. ونتيجة لذلك، يتم الآن الكبار الخلايا العصبية DRG المستخدمة على نطاق واسع بأنه نظام نموذجي لدراسة التجدد نمو محور عصبي 5-7. نحن هنا وصف طريقة لثقافة الكبار الخلايا العصبية DRG التي يمكن استخدامها للدراسة الجينية لتجديد محور عصبي في المختبر. في هذا بالغ نموذج يتم التلاعب وراثيا الخلايا العصبية DRG عبر electroporation بوساطة ترنسفكأيشن الجينات 6،8. بواسطة transfecting الخلايا العصبية مع البلازميد أو الاشتراكية / shRNA، هذا النهج يمكن تحقيق مكاسب على حد سواء، وفقدان وظيفة من بين التجارب للتحقيق في دور الجينات أي فائدة من محور عصبي في نمو الخلايا العصبية من DRG الكبار. عندما يتم transfected الخلايا العصبية مع الاشتراكية / shRNA، البروتين المحلية المستهدفة هيالمنضب عادة بعد 3-4 أيام في الثقافة، وخلال الوقت الذي نمو محور عصبي قوي حدث بالفعل، مما يجعل من دراسات فقدان وظيفة من بين أقل فعالية. لحل هذه المشكلة، الطريقة الموصوفة هنا يتضمن خطوة اعادة التعليق وإعادة الطلاء، بعد ترنسفكأيشن، والذي يسمح لمحاور عصبية من الخلايا العصبية في حالة عدم وجود بروتين استهدفت تنمو من جديد. أخيرا، ونحن نقدم مثالا على استخدام هذا النموذج في المختبر لدراسة دور الجينات المرتبطة تجديد محور عصبي، ج يونيو، في التوسط في نمو الخلايا العصبية من محور عصبي DRG الكبار 9.

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons at JoVE.com

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

و<em&gt; في المختبر</emيوصف&gt; نموذج للدراسة الجينية لتجديد محور عصبي مثقف باستخدام الماوس الخلايا العصبية الظهرية جذر عقدة الكبار. الأسلوب يشمل خطوة re-suspension/re-plating للسماح محور عصبي إعادة نمو الخلايا العصبية التي تمر من التلاعب الجيني. هذا النهج هو مفيد وخاصة بالنسبة للخسارة من بين وظيفة دراسات من تجديد محور عصبي باستخدام رني القائم على ضربة قاضية البروتين.

دراسة وراثية من التجديد أكسون مع الكبار الظهرية مثقف الخلايا العصبية العقدة الجذر

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

genetic-study-axon-regeneration-with-cultured-adult-dorsal-root

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.5K Views.  Johns Hopkins University School of Medicine. و في المختبر نموذج للدراسة الجينية لتجديد محور عصبي مثقف باستخدام الماوس الخلايا العصبية الظهرية جذر عقدة الكبار. الأسلوب يشمل خطوة re-suspension/re-plating للسماح محور عصبي إعادة نمو الخلايا العصبية التي تمر من التلاعب الجيني. هذا النهج هو مفيد وخاصة بالنسبة...

Video: Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

الظهرية جذر العقد الخلايا العصبية والخلايا الجذعية المتباينة الدهنية المشتقة: ل<em&gt; في المختبر</em&gt; المشارك الثقافة نموذج لدراسة الأعصاب الطرفية التجديد

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

في المختبر نمذجة السرطانية العصبية الغزو: وظهري الجذر العقدة نموذج

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

مدخل لتعزيز التوافق وتكون الميالين في ظهري الجذر العقدة العصبية

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

الظهرية جذر حقن العقدة وظهري الجذر سحق إصابة نموذجا لالحسية أكسون التجديد

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive targets for injection of novel therapeutics aimed at treating chronic pain. In small animal models, laminectomy has been used to facilitate DRG injection because it involves surgical removal of the vertebral bone surrounding each DRG. We demonstrate a technique for intraganglionic injection of lumbar DRG in a large animal species, namely, swine. Laminotomy is performed to allow direct access to DRG using standard neurosurgical techniques, instruments, and materials. Compared with more extensive bone removal via laminectomy, we implement laminotomy to conserve spinal anatomy while achieving sufficient DRG access. Intraoperative progress of DRG injection is monitored using a non-toxic dye. Following euthanasia on post-operative day 21, the success of injection is determined by histology for intraganglionic distribution of 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). We inject a biologically inactive solution to demonstrate the protocol. This method could be applied in future preclinical studies to target therapeutic solutions to DRG. Our methodology should facilitate testing the translatability of intraganglionic small animal paradigms in a large animal species. Additionally, this protocol may serve as a key resource for those planning preclinical studies of DRG injection in swine.

We describe a method for laminotomy in swine that provides access to lumbar dorsal root ganglia (DRG) for intraganglionic injection. Injection progress is monitored intraoperatively and histologically confirmed up to 21 days after surgery. This protocol could be used for future preclinical studies involving DRG injection.

و Laminotomy للوصول إلى العقدة الجذر الظهرية القطنية وحقن في الخنازير

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

التحقيق إكسون الثدييات التجديد: في فيفو انهانسر من العقدة الجذر الظهرية الماوس الكبار

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

العزلة السريعة للضامة الجذرية الدجورة

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, assembly and activity-dependent plasticity. Giant ankyrin-G, the master organizer of AIS, directly associates with membrane-spanning voltage gated sodium (VSVG) and potassium channels (KCNQ2/3), as well as 186 kDa neurofascin, a L1CAM cell adhesion molecule. Giant ankyrin-G also binds to and recruits cytoplasmic AIS molecules including beta-4-spectrin, and the microtubule-binding proteins, EB1/EB3 and Ndel1. Giant ankyrin-G is sufficient to rescue AIS formation in ankyrin-G deficient neurons. Ankyrin-G also includes a smaller 190 kDa isoform located at dendritic spines instead of the AIS, which is incapable of targeting to the AIS or rescuing the AIS in ankyrin-G-deficient neurons. Here, we described a protocol using cultured hippocampal neurons from ANK3-E22/23-flox mice, which, when transfected with Cre-BFP exhibit loss of all isoform of ankyrin-G and impair the formation of AIS. Combined a modified Banker glia/neuron co-culture system, we developed a method to transfect ankyrin-G null neurons with a 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, which is sufficient to rescue the formation of AIS. We further employ a quantification method, developed by Salzer and colleagues to deal with variation in AIS distance from the neuronal cell bodies that occurs in hippocampal neuron cultures. This protocol allows quantitative studies of the de novo assembly and dynamic behavior of AIS.

Here, we described a protocol to quantitatively study the assembly and structure of the axon initial segments (AIS) of hippocampal neurons that lack pre-assembled AIS due to the absence of a giant ankyrin-G.

استخدام الخلايا العصبية فرس النهر المستزرعة الأولية لدراسة تجميع الأجزاء الأولية أكسون

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

ثقافة اكسال من الخلايا العصبية الجرذ الشبكية جانجليون مع الشم Ensheathing غليا، كنموذج في المختبر من تجديد أكسونال الكبار

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

في الموقع تصور نمو المحور العصبي وديناميكيات مخروط النمو في مزارع شرائح الدماغ الجنينية الحادة خارج الجسم الحي

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...