Ce travail a été soutenu par des subventions des NIH à FZ (R01NS064288) et la Fondation Craig H. Nielsen.

1. Préparation des lamelles, milieu de culture, et les enzymes de digestion <ol><li> La ronde de 12 mm n ° 1 des lamelles de verre sont utilisés pour la culture neuronale. Les lamelles sont nettoyées avec 10% HCL nuit suivi d&#39;un lavage à ultrasons avec de l&#39;eau distillée et désionisée pour 3 fois (20 min / heure). Les lamelles nettoyés sont stockés dans l&#39;éthanol à 70% pour une utilisation future. Avant chaque expérience, les lamelles sont séchées à l&#39;air et placé dans la plaque de culture. </li><li> Pour enrober les lamelles séchées, 100 pi de solution de revêtement contenant 100 ug / ml de poly-D-Lysine et 10 pg / ml laminine solution de travail est ajouté sur chaque lamelle et la plaque de culture est transférée dans un incubateur à 37 ° C. Après 1-2 heures, la solution de revêtement est enlevé et les lamelles sont lavées 3 fois avec du PBS 1X stérile. </li><li> Pour préparer le milieu de culture, le milieu essentiel minimum (MEM) est supplémenté avec 5% de sérum bovin (FBS), 1X de pénicilline-streptomycine solution (500 unités de Penicilliumlin et 500 ug de streptomycine), 1X Glutamax-je supplément, et les réactifs antimitotiques contenant 20 pM de 5-fluoro-2-désoxyuridine et 20 uM (FDU / R) uridine. Pour le milieu sans sérum, le FBS est remplacé par le supplément de B27. </li><li> La collagénase Une solution est préparée en dissolvant la collagénase avec une poudre MEM pour obtenir une concentration de travail de 1 mg / ml. Pour la trypsine, la 1X TrypLE Express est utilisé. </li></ol> 2. Dissection et la récolte des adultes neurones DRG de souris <ol><li> Après l&#39;euthanasie de la 6 - à la souris adulte de 10 semaines, retirez la peau du dos et couper toute la colonne vertébrale. Laver la colonne vertébrale avec retirés du 1 x PBS 2-3 fois. </li><li> Pin de la colonne vertébrale retiré à la plaque de dissection avec un maximum face ventrale, et enlève soigneusement les muscles afin d&#39;exposer les nerfs sensitifs sous une loupe binoculaire. Les nerfs reliés aux GHM au niveau du bois sont les plus épaisses et facile à localiser. Par conséquent, pour la plupart des expériences que la région lombaireDRG sont récoltés. </li><li> Couper passant par chaque vertèbre le long de la ligne médiane avec de petits ciseaux, et retirez soigneusement les disques intervertébraux. En utilisant des pinces de diviser chaque vertèbre pour exposer la moelle épinière. </li><li> Afin de disséquer les DRG de bois, soulevez chaque nerf du bois avec une pince et de tracer vers la moelle épinière pour localiser les GHM associés lombaires (L1 à L6). </li><li> Coupez chaque DRG du nerf périphérique connecté, les racines dorsales et ventrales avec des ciseaux à ressort, et de le stocker dans un tube de centrifugeuse avec du milieu MEM placé sur la glace. DRG plus à différents niveaux épinière (DRG thoraciques) peut être découpé dans la même manière, si nécessaire. </li></ol> 3. Digestion et dissociation des adultes neurones DRG de souris <ol><li> Après avoir recueilli tous les DRG disséqués, remplacer le milieu MEM avec 1 ml de collagénase Une solution et incuber le tube de centrifugeuse à 37 ° C pendant 90 min. </li><li> Remplacer la collagénase Une solution avec 500 pi Express 1X TrypLE afinlution et incuber à 37 ° C pendant 15-20 min. </li><li> Retirer la solution TrypLE Express et laver les GHM avec 1 ml de milieu de culture préparé (contenant 5% de FBS) pour 3 fois. </li><li> Ajouter 600 ul milieu de culture et doucement pipeter haut et en bas de triturer les tissus pour les 20-30 fois en utilisant un 1 ml de bleu, pipette graduée de pointe. </li><li> Après trituration, de permettre aux tissus non dissociés de s&#39;installer au fond de la centrifugeuse et le transfert de la suspension cellulaire dans un tube de 10 ml stérile. Ajouter un autre support 600 ul de la culture et répétez l&#39;étape de trituration jusqu&#39;à la plupart des tissus sont dissociées. La suspension cellulaire obtenue contient deux neurones et des cellules non neuronales. Dans la plupart des cas, les cellules à partir de 6 GHM (~ 5 x10 4) sont utilisés pour une réaction d&#39;électroporation. </li></ol> 4. Manipulation génétique des neurones par électroporation <ol><li> Préparer la solution de transfection en mélangeant la solution nucléofection Amaxa pour les neurones de souris avec des plasmides d&#39;ADN (~ 10 pg) Ou oligos siRNA (~ 0,2 nmol) pour obtenir un volume final de 100 pl pour chaque transfection. </li><li> Centrifuger les cellules dissociées à 680 tours par minute pendant 7 min à température ambiante, et éliminer le surnageant autant que possible. Ajouter la solution de transfection préparé et doucement pipeter haut et en bas 3-4 fois avec 200 pointes de pipette ul pour remettre en suspension les cellules. </li><li> Transférer la suspension de cellules mélangée avec la solution de transfection à la cuvette d&#39;électroporation et électroporer des cellules à l&#39;aide du programme de système Amaxa Nucleofector U-013. </li><li> Après électroporation, ajouter immédiatement 500 pl de pré-chauffée (37 ° C) milieu de culture contenant FBS dans la cuvette et de transférer toute la solution (~ 600 pi) dans la plaque de culture revêtue à des densités cellulaires souhaités. Pour l&#39;expérience que requiert la remise en suspension et de re-placage, les neurones sont cultivées directement sur la boîte de culture en plastique à haute densité (10000-20000 cellules / puits). Pour l&#39;expérience, qui examine directement la croissance des axones, les neurones sont en Ontario plaquéo des lamelles de verre enduits à faible densité (3000-5000 cellules / puits). Placez la plaque de culture dans l&#39;incubateur (37 ° C, 5% de CO 2). </li><li> Quatre heures après étalement lorsque les neurones sont attachés à des substrats, doucement remplacer le milieu de culture (qui contient la solution nucléofection Amaxa) avec 500 ul milieu de culture frais et préchauffée, et de retourner la plaque dans l&#39;incubateur pour la culture supplémentaire (37 ° C , 5% CO 2). Les deux milieu de culture contenant FBS ou le milieu sans sérum peut être utilisé à cette étape. </li></ol> 5. La culture de neurones adultes DRG pour l&#39;analyse de la croissance axonale <ol><li> Pour les neurones transfectées avec des plasmides d&#39;ADN, l&#39;expression du gène d&#39;intérêt (par exemple EGFP) peuvent être observées dès qu&#39;une heure à peine après l&#39;électroporation. Pour les neurones transfectées avec des siRNA, nous avons l&#39;habitude d&#39;attendre 3-4 jours pour permettre l&#39;épuisement suffisante des protéines endogènes. Les neurones en culture peut être fixé soit directement pour l&#39;analyse de la croissance axonale à varionous le temps des points (1-4 jours après électroporation) ou remis en suspension et ré-étalées à analyser axone repousse (voir ci-dessous). </li><li> Pour l&#39;ARNi à médiation perte de fonction des études, des neurones en culture peuvent être remis en suspension et ré-plaqué afin de permettre aux axones des neurones repousser, dans laquelle les protéines ciblées sont déjà épuisés. Pour ce faire, remplacer le milieu de culture ancienne des neurones à haute densité d&#39;élevage avec 1 ml préchauffé milieu frais et pipette doucement de haut en bas pour les 6-10 fois pour remettre en suspension les neurones sont reliés de la plaque de culture. Parce que les cellules non neuronales (par exemple les cellules de Schwann) attachent beaucoup plus serré de la boîte de culture que les neurones, les cellules remises en suspension sont pour la plupart des neurones. </li><li> Transférer les neurones remises en suspension dans un microtube et doucement triturer 10-15 fois de re-dissocier les amas cellulaires dans la suspension cellulaire unique. </li><li> Re-re de la plaque des neurones dissociés sur des lamelles nouvellement préparés à basse densité (3000-5000 cellules / puits) et de la culture du jour au lendemain (16-24 h). </li></ol> 6. Fixation, immuno-coloration, et imagerie par fluorescence <ol><li> Aspirer le milieu et ajouter du paraformaldéhyde à 4% (PFA) (200 pl / puits) pour fixer les cellules pour 15-20 min à température ambiante. Les cellules fixes sont ensuite lavées avec du PBS 1X pour 3 fois. </li><li> Aspirer le PBS et ajouter la solution de blocage (1% de sérum albumine bovine, 0,1% de Triton X-100, et 2,0% de sérum de chèvre normal dans du PBS 1X) pour les neurones fixes pour 60 min à température ambiante. </li><li> Pour les axones de l&#39;étiquette, les neurones sont immuno-teinté avec des anti-neurofilaments ou d&#39;anticorps anti-tubuline βIII. Pour ce faire, déposer une goutte 30μl de solution d&#39;anticorps primaire (1:1200 dilution pour l&#39;anticorps tubuline-βIII) sur un parafilm pour chaque lamelle. Inverser les lamelles et les placer sur la solution d&#39;anticorps primaire pendant 60 min à température ambiante. </li><li> Retour lamelles sur la plaque de culture d&#39;origine et les laver avec du PBS 1X pour 3 fois. </li><li> Répétez la même procédure pour le secondaire unetibody. </li><li> Laver les lamelles avec de l&#39;eau distillée pour 3 fois, puis monter les lamelles sur des lames de verre avec la solution de montage (par exemple ProLong Antifade Or). </li><li> Les neurones colorés peut être visualisé avec n&#39;importe quel système de microscopie par fluorescence équipé d&#39;un appareil photo numérique. Les longueurs des axones sont mesurés et analysés avec le logiciel d&#39;analyse d&#39;imagerie. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs En l&#39;absence de tout facteur de croissance extracellulaires ajoutée, les neurones DRG adultes commencent généralement à se développer axones 48 h après le placage en premier. Les axones montrent souvent des morphologies ramifiées (Figure 1). En revanche, les neurones re-plaqués commencer à étendre les axones seulement quelques heures après le placage, et les axones allongée avec beaucoup réduit la ramification (Figure 2). Ces résultats suggèrent que re-plaqués neurones partagent des propriétés similaires à celles des neurones lésés de conditionnement. En utilisant cette approche, nous avons récemment effectué des pertesde fonction des études visant à examiner le rôle de la régénération des axones facteur de transcription c-Jun associée à la croissance des axones de neurones adultes GHM in vitro. Les résultats ont montré que l&#39;électroporation d&#39;un groupe de 4 siRNA ciblant différentes régions différentes de c-Jun (ON-TARGETplus) réduit significativement les taux de protéines de c-Jun dans les neurones de DRG adultes 3 ​​jours après la transfection (figure 3) 9. Lorsque les neurones ont été ré-plaqué et de culture du jour au lendemain, la croissance des axones des neurones knockdown c-Jun a été significativement réduite (contrôle: 348,37 ± 16.21mm; si-c-Jun: 262,32 ± 15,69 pm, Figure 3) 9. Ces résultats indiquent que les neurones en culture DRG adultes constituent un système modèle utile pour étudier la croissance des axones des neurones adultes. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig1.jpg" /> Figure 1. Neurones adultes de souris cultivées DRG à faible densité pendant 3 jours. Les neurones ont été colorés avec des anticorps anti - &amp; beta; anticorps tubuline III. Notez que la plupart des axones montrent des morphologies ramifiées. La barre d&#39;échelle: 125 um. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig2.jpg" /> Figure 2. Souris adulte Re-placage DRG neurones après 3 jours de culture. (A) des neurones DRG adultes cultivées à haute densité pendant 3 jours. (B) Re-plaqués neurones DRG adultes ont été cultivées à faible densité pour la nuit. Notez que la plupart des axones montrent des morphologies allongées avec peu axone branchement. La barre d&#39;échelle: 250 um à 125 um A et en B. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4141/4141fig3.jpg" /> Figure 3. Rôle de c-Jun dans la croissance axonale des neurones DRG adultes in vitro. (A) l&#39;analyse par Western blot de c-Jun chez la souris adulte DRG neurones après l&#39;électroporation de c-Jun siRNA. Le résultat indique le niveau nettement réduit de c-Jun. (B) neurones de contrôle transfectées avec EGFP a augmenté de longs axones après re-placage et de la culture du jour au lendemain. (C) Co-transfection de c-Jun siRNA et la croissance des axones EGFP avec facultés affaiblies de neurones adultes DRG après re-placage et de la culture du jour au lendemain. Rouge: Tuj-1 coloration; vert: EGFP. La barre d&#39;échelle: 125 um. Ces résultats ont été publiés dans Saijilafu et al. 9.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Adultes neurones DRG régénérer leurs axones robuste après une lésion nerveuse périphérique in vivo et in vitro, fournissant ainsi un système utile pour étudier la régénération des axones chez les animaux adultes. Dans la culture in vitro de neurones DRG adultes devient une méthode largement utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires par lesquels les la régénération des axones est réglementée. La procédure in vitro des neurones en culture...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11090-081 </td></tr><tr><td> Poly-D-Lysine bromhydrate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> La laminine </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td></tr><tr><td> 5-fluoro-2-désoxyuridine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> Uridine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U3003 </td></tr><tr><td> Une collagénase </td><td> Roche </td><td> 10103578001 </td></tr><tr><td> TrypLE express </td><td> Invitrogen </td><td> 12604-013 </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Invitrogen </td><td> 10270-098 </td></tr><tr><td> La pénicilline-streptomycine (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122</td></tr><tr><td> Glutamax-I (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-038 </td></tr><tr><td> Verre lamelles (# 1) </td><td> Sciences Electron Microscopy </td><td> 72196-12 </td></tr><tr><td> 24 plaques à puits culture cellulaire </td><td> Becton Dickinson </td><td> 35-3047 </td></tr><tr><td> PBS 1X </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CV </td></tr><tr><td> Stérile, l&#39;eau distillée et déionisée </td><td> Mediatech </td><td> 25-055-CV </td></tr><tr><td> Kits Nucleofector et l&#39;électroporation pour les neurones de souris </td><td> Lonza </td><td> VPG-1001 </td></tr><tr><td> SUR-TARGETplus siRNA contre c-Jun </td><td> Dharmacon </td><td> L-043776 </td></tr><tr><td> Anticorps anti - tubuline βIII (Tuj-1) </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td></tr><tr><td> ProLong solution Antifade Or de montage </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td></tr></tbody&gt; </table>

genetic study of axon regeneration with cultured adult dorsal root ganglion neurons

Il est bien connu que les neurones matures dans le système nerveux central (SNC) ne peuvent se régénérer leurs axones après des blessures dues à la capacité intrinsèque diminuée pour soutenir la croissance des axones et un environnement hostile dans le 1,2 matures du SNC. En revanche, les neurones matures dans le système nerveux périphérique (SNP) de régénérer rapidement après les blessures 3. Adultes dorsales profondes ganglionnaires (DRG) neurones sont bien connus pour régénérer vigoureusement après lésions des nerfs périphériques. Chaque neurone DRG pousse un axone du soma des cellules, qui se divise en deux branches: une branche axonale périphérique innervant cibles périphériques et une branche centrale se prolongeant dans la moelle épinière. Blessures des résultats DRG axones périphériques dans la régénération des axones substantielle, alors que les axones centraux dans la moelle épinière régénérer mal après la blessure. Toutefois, si la lésion périphérique axonale se produit avant la lésion de la moelle épinière (un processus appelé la lésion conditionné), la régénération des axones centraux est greatly améliorée 4. En outre, les axones des neurones centraux DRG partager le même environnement hostile comme descendant des axones cortico dans la moelle épinière. Ensemble, on fait l&#39;hypothèse que les mécanismes moléculaires contrôlant la régénération des axones des neurones DRG adultes peuvent être exploitées pour améliorer la régénération des axones du SNC. En conséquence, adultes neurones DRG sont maintenant largement utilisé comme un système modèle pour étudier la croissance des axones régénérative 5-7. Ici, nous décrivons une méthode d&#39;adultes DRG neurone culture qui peut être utilisé pour l&#39;étude génétique de la régénération des axones in vitro. Dans ce modèle adulte neurones DRG sont génétiquement manipulés par électroporation à médiation transfection du gène 6,8. Par transfection neurones avec l&#39;ADN plasmidique ou si / shRNA, cette approche permet à la fois à gain et la perte de fonction des expériences pour étudier le rôle de n&#39;importe quel gène d&#39;intérêt dans la croissance axonale des neurones DRG adultes. Lorsque les neurones sont transfectées avec si / shRNA, la protéine endogène ciblée estgénéralement épuisés après 3-4 jours de culture, au cours de laquelle la croissance axonale temps robuste a déjà eu lieu, ce qui rend les études de perte de fonction moins efficace. Pour résoudre ce problème, la méthode décrite ici comprend une étape de remise en suspension et de re-placage après la transfection, les axones qui permet de repousser à partir de neurones dans l&#39;absence de la protéine ciblée. Enfin, nous donnons un exemple d&#39;utilisation de ce modèle in vitro pour étudier le rôle d&#39;une régénération des axones gène associé à, c-Jun, dans la médiation de la croissance des axones des neurones de l&#39;adulte DRG 9.

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Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle pour l&#39;étude génétique de la régénération des axones en utilisant la souris adultes en culture des neurones ganglionnaires dorsales profondes est décrite. Le procédé comprend une étape pour permettre re-suspension/re-plating axone repousse des neurones subissant une manipulation génétique. Cette approche est particulièrement utile en cas de perte de fonction des études de la régénération des axones en utilisant knockdown protéines ARNi basée.

Étude génétique de la régénération des axones avec cultivées adultes dorsaux neurones ganglion de la racine

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

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26.5K vues.  Johns Hopkins University School of Medicine. Un In vitro Modèle pour l'étude génétique de la régénération des axones en utilisant la souris adultes en culture des neurones ganglionnaires dorsales profondes est décrite. Le procédé comprend une étape pour permettre re-suspension/re-plating axone repousse des neurones subissant une manipulation génétique. Cette approche est particulièrement utile en cas de perte de fonction des études de la régénération des axones en utilisant knock...

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Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Les ganglions rachidiens neurones et les cellules souches différenciées dérivées de tissu adipeux: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-culture modèle pour étudier la régénération des nerfs périphériques

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Recherche

Neurosciences

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

In Vitro Modélisation de Cancerous Neural Invasion: Le ganglion de racine dorsale Modèle

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Une approche pour améliorer l&#39;alignement et myélinisation de ganglion de racine dorsale Neurones

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Racine Dorsale Ganglion Injection et Racine Dorsale Crush blessures comme modèle pour la régénération sensorielle Axon

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive targets for injection of novel therapeutics aimed at treating chronic pain. In small animal models, laminectomy has been used to facilitate DRG injection because it involves surgical removal of the vertebral bone surrounding each DRG. We demonstrate a technique for intraganglionic injection of lumbar DRG in a large animal species, namely, swine. Laminotomy is performed to allow direct access to DRG using standard neurosurgical techniques, instruments, and materials. Compared with more extensive bone removal via laminectomy, we implement laminotomy to conserve spinal anatomy while achieving sufficient DRG access. Intraoperative progress of DRG injection is monitored using a non-toxic dye. Following euthanasia on post-operative day 21, the success of injection is determined by histology for intraganglionic distribution of 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). We inject a biologically inactive solution to demonstrate the protocol. This method could be applied in future preclinical studies to target therapeutic solutions to DRG. Our methodology should facilitate testing the translatability of intraganglionic small animal paradigms in a large animal species. Additionally, this protocol may serve as a key resource for those planning preclinical studies of DRG injection in swine.

We describe a method for laminotomy in swine that provides access to lumbar dorsal root ganglia (DRG) for intraganglionic injection. Injection progress is monitored intraoperatively and histologically confirmed up to 21 days after surgery. This protocol could be used for future preclinical studies involving DRG injection.

Laminotomy pour accès de Ganglion de la racine dorsale lombaire et Injection chez le porc

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

Chargée de l’enquête la régénération axonale mammifères : In Vivo électroporation du Ganglion de la racine dorsale de souris adulte

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Isolement rapide des macrophages de ganglion de racine dorsal

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, assembly and activity-dependent plasticity. Giant ankyrin-G, the master organizer of AIS, directly associates with membrane-spanning voltage gated sodium (VSVG) and potassium channels (KCNQ2/3), as well as 186 kDa neurofascin, a L1CAM cell adhesion molecule. Giant ankyrin-G also binds to and recruits cytoplasmic AIS molecules including beta-4-spectrin, and the microtubule-binding proteins, EB1/EB3 and Ndel1. Giant ankyrin-G is sufficient to rescue AIS formation in ankyrin-G deficient neurons. Ankyrin-G also includes a smaller 190 kDa isoform located at dendritic spines instead of the AIS, which is incapable of targeting to the AIS or rescuing the AIS in ankyrin-G-deficient neurons. Here, we described a protocol using cultured hippocampal neurons from ANK3-E22/23-flox mice, which, when transfected with Cre-BFP exhibit loss of all isoform of ankyrin-G and impair the formation of AIS. Combined a modified Banker glia/neuron co-culture system, we developed a method to transfect ankyrin-G null neurons with a 480 kDa ankyrin-G-GFP plasmid, which is sufficient to rescue the formation of AIS. We further employ a quantification method, developed by Salzer and colleagues to deal with variation in AIS distance from the neuronal cell bodies that occurs in hippocampal neuron cultures. This protocol allows quantitative studies of the de novo assembly and dynamic behavior of AIS.

Here, we described a protocol to quantitatively study the assembly and structure of the axon initial segments (AIS) of hippocampal neurons that lack pre-assembled AIS due to the absence of a giant ankyrin-G.

Utilisation de neurones hippocampiques cultivés primaires pour étudier l’assemblage des segments initiaux axonaux

Neuronal axon initial segments (AIS) are sites of initiation of action potentials and have been extensively studied for their molecular structure, ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

Coculture de neurones rétiniens axotomisés de ganglion de rat avec glia ensheathing olfactif, comme modèle in vitro de régénération axonale adulte

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

In situ Visualisation de la croissance des axones et de la dynamique des cônes de croissance dans des cultures de tranches cérébrales embryonnaires ex vivo aiguës

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...