ويتم تمويل هذا العمل من قبل العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (منحة # 249669، 482986 و#) والقلب والسكتة الدماغية مؤسسة كندا (منحة # 485508). الكتاب أشكر يوسف الحايك والدكتور وان تشى لمساعدتهم في تطوير البروتوكولات التجريبية.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على التعامل مع الحيوانات من جامعة تورونتو لحيوانات جنة رعاية فقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية (البروتوكول رقم 20009387). يجب أن يتم تنفيذ الطرق التالية باستخدام أدوات معقمة والتقنيات، في الصفحي هود تدفق حيثما ينطبق ذلك. في النص أدناه بروتوكول، فإن عبارة &quot;EFH-SFM&quot; يشير إلى وسائل الإعلام الحرة تستكمل مع مصل عامل نمو البشرة، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية والهيبارين. يستخدم EFH-SFM عند التحقيق في انجذاب غلفاني من الشخصيات غير متمايزة لأن هذه الشخصيات mitogens الحفاظ على دولتهم في 4 غير متمايزة. عند التحقيق في انجذاب غلفاني من الشخصيات التي يسببها على التمايز إلى أنواع الخلايا الناضجة، &quot;FBS-SFM&quot; يشير إلى وسائل الإعلام الحرة المصل تستكمل مع مصل بقري جنيني 1٪. FBS يعزز تمايز الشخصيات في الظواهر العصبية الناضجة 5. 1. العزلة وثقافة العصبية السلائف (غيرهو مبين في الفيديو) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير ماوس CD1 (6-8 أسابيع من العمر) مع isofluorane والتضحية عبر خلع عنق الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اخماد الرأس في الايثانول 70٪ وقطع رأس الحيوان مع مقص تشريح حادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين الضغط على الرأس مع ملقط جراحي، وإزالة الجلد على السطح الظهري لفضح الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وباستخدام مشرط لا. 11 شفرة، يسجل الجمجمة في الجيب الجبهي على طول محور الناصف الوحشي، وكذلك على طول الدرز السهمي في الاتجاه rostrocaudal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر العظام الجدارية بعيدا عن الرأس مع عدم وجود. 7 ملقط المنحني، مع الحرص على عدم اختراق أنسجة المخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج ملعقة رقيقة تحت الدماغ بدءا من تحت المخيخ والتقدم نحو المصابيح حاسة الشم. في حين عقد الجمجمة في مكان مع ملقط، وسحب بلطف الدماغ من الجمجمة ووضع على الفور في الجليد الباردة السائل النخاعي الاصطناعي (انظر صفات أدناه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح، وذلك باستخدام العقيمةقطع مقص وملقط تشريح الدماغ إلى النصف على طول خط الوسط. تدوير كل نصف الكرة بحيث الإنسي (قطع) عن سطح البحر وتواجه صعودا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد نصف الكرة، ومع السطح الإنسي التي تواجه التصاعدي، حدد موقع splenium من الجسم الثفني (المنطقة الخلفية من الجسم الثفني). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق من سطح القشرة إلى splenium من الجسم الثفني على طول محور ظهري بطني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر القشرة قطعي نحو البصلة الشمية لفضح جدران الإنسي والجانبية للبطين الوحشي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير نصف الكرة بحيث يواجه السطح الظهري إلى أعلى، واستخدام microscissors المنحني لقطع الجدران وجمع يتعرض الإنسي والجانبية، والتي تحتوي على منطقة حول البطينات الدماغية حيث يقيم الشخصيات 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 1،8-1،11 لنصف الكرة الأرضية الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة الأنسجة المعزولة إلى 7 مل من محلول التربسين (انظر صفة أدناه) في أنبوب سم مكعب 15، ووضع أنبوب على الروك في C ° 37حاضنة لمدة 25 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، نضح طاف، و resuspend الأنسجة في 2 مل من محلول التربسين المانع (انظر صفة أدناه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسحن بلطف الأنسجة مع صغيرة بئر مرات باستور 30-50 ماصة بعناية لتجنب فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، نضح طاف، و resuspend في 1-2 مل من SFM (انظر صفة أدناه) بواسطة الطحن وبيليه 3-5 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق، نضح طاف و resuspend في 1 مل من SFM + EFH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد كثافة الخلية يعيش مع وhaemocytometer وحة الخلايا في قارورة T25 الثقافة في مناطق ذات كثافة من 10 خلية لكل ميكرولتر في SFM + EFH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للثقافة أن تنمو دون عائق لمدة 7 أيام لانتاج التعويم الحر neurospheres الابتدائية تتألف من الشخصيات. </li></ol> 2. انجذاب غلفاني غرفة التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان 3 مربع الزجاج لا. تغطية زلات 1 (22 × 22 × 0،17 مم) طNA زجاجة من حمض الهيدروكلوريك 6N بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، استخدم الماس طرف زجاج لقطع لشرائح 6 قطع مستطيلة (22 × 5 × 0،17 مم) من الزجاج من أي مربع. تغطية زلات 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل زلات حمض غسلها مربع ومستطيل زلات إلى الصفحي هود التدفق. غسل شرائح مستطيلة ومربعة الأولى مع الايثانول 70٪، ثم بالماء ثقافة الجودة الأنسجة تعقيمها، والسماح ليجف على كيم مسح (على العقم وأضاف، قد يسمح الزجاج لالهواء الجاف). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الشحوم فراغ في محيط سطح واحد من الشرائح الزجاجية مربع، وختم لهم قاعدة 60 مم أطباق بتري بلاستيكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الشحوم فراغ على طول محور واحد طويل سطح الزجاج شرائط مستطيلة، وختم لهم حواف الآخر من الشرائح الزجاجية مربع (بحيث تكون موازية لبعضها البعض) من أجل إنشاء حوض المركزية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> UV-تعقيم غرف على الأقل 15 دقيقة في الصفحي هود التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 250-300 ميكرولتر من بولي-L-lysiشمال شرق على الحوض الصغير للدوائر المركزية واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما يقرب من 15 دقيقة قبل نهاية فترة الحضانة، وإعداد الحل Matrigel (انظر صفة أدناه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في بولي-L-يسين، وغسل أحواض وسط مع 1 مل من الماء تعقيمها، وماصة 250-300 ميكرولتر من حل لMatrigel على أحواض المركزية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الدوائر في C ° 37 لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الحل Matrigel وغسل بلطف مع أحواض المركزي 1-2 مل من SFM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 100 ميكرولتر من EFH-SFM أو FBS-SFM على أحواض للوسط ونقل الدوائر انجذاب غلفاني على خشبة المسرح المجهر من العد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة مل 3-4 من الثقافة التي تحتوي على neurosphere في طبق بتري 60 مم ونقل طبق بيتري إلى مرحلة المجهر العد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى هدف عرضها 5X، استخدم ماصة نقل P10 5-8 neurospheres كله (ما يصل إلى أربعة في وقت واحد) على الحوض الصغير وسط كل انجذاب غلفانيغرفة دون الانفصال لهم، ونشر بعناية neurospheres حول الحوض الصغير دون تعطيل وسط الركيزة Matrigel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ميكرولتر من 150-200 إضافية EFH-SFM أو FBS-SFM على وأحواض المركزية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الدوائر انجذاب غلفاني ° C إلى 37، 5٪ CO 2، حاضنة مرطب 100٪ لل17-20 ساعة (إذا تحليل الشخصيات غير متمايزة) للسماح للneurospheres على الانضمام إلى الركيزة Matrigel وفصل واحد في الخلايا كما هو موضح في الشكل (1) . إذا تحليل الشخصيات المتباينة، ينبغي أن تمتد فترة الحضانة إلى 69-72 ساعة للسماح للتمايز الخلايا. </li></ol> 3. تعيش خلية الوقت الفاصل بين التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للخلية الحية التصوير نظام للتوازن في 37 ° C، 5٪ CO 2 لمدة لا تقل عن 30 دقيقة قبل الشروع في تسجيل الوقت الفاصل بين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع قطعتين 12 سم من 1 مم سلك فضي، لفائف لهم من نهاية واحدة، ووضعها في كلوروكس بليتش لمدة 20 دقيقة لتشكيل جي / أجكل الأقطاب الكهربائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الدوائر انجذاب غلفاني على خشبة المسرح المجهر من العد وتحديد أي غرفة سيتم استخدامها لخلايا الحية التصوير تحليل الهجرة على أساس المعايير التالية: ط) ينبغي أن يكون تقريبا neurospheres فصلها تماما في الخلايا واحد والثاني) الخلايا ينبغي أن يتمتع الأشكال التضاريسية جولة مع قليل إلى عدم العمليات تمتد من أجسام الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل غرفة انجذاب غلفاني المحددة في الصفحي هود تدفق، جنبا إلى جنب مع أي مربع منفصلة. 1 زلة غطاء الزجاج والشحوم فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل غطاء ينزلق الأولى مع الايثانول 70٪، ثم تعقيمها بالماء، وتطبيق شريط من الشحوم فراغ على اثنين من حواف متوازية من الانزلاق الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وسائل الإعلام الثقافة من الحوض الصغير المركزية للغرفة، ثم وضع غطاء بسرعة الانزلاق (الشحوم من جانب أسفل) على هذه الدائرة أن بقية شرائح الشحوم على اتجاهين متوازيين شرائح مستطيلة من الزجاج، على نحو فعال خلق سقفإلى الدائرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 100 ميكرولتر من جديد EFH-SFM أو FBS-SFM في الحوض الصغير المركزية عن طريق عمل شعري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الشحوم فراغ لخلق حدود لحمامات السباحة وسائل الإعلام الثقافة على كل نهاية الحوض الصغير المركزية، كما هو مبين في الشكل 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع قطعتين 15 سم من أنابيب PVC، واستخدام حقنة سم مكعب 10 مع إبرة قياس 18 إلى حقن بعناية الاغاروز حل في أنابيب، وضمان تشكيل فقاعات لا في أنابيب، والسماح للهلام لترسيخ لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل غرفة انجذاب غلفاني لنظام الخلية الحية التصوير، جنبا إلى جنب مع أنابيب هلام الاغاروز، جي / أقطاب أجكل، وزوج من 60 مم فارغة أطباق بتري التي سيتم استخدامها وثقافة الإعلام الخزانات وسوف تحتوي على جي / أقطاب أجكل. السماح للغرفة انجذاب غلفاني للراحة في 37 ° C، 5٪ CO 2 لمدة 20-30 دقيقة البيئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال هذا الوقت، وإعداد الأغطية من الأطباق الفارغة وبيتري 2 غطاء الطبق غرفة انجذاب غلفاني في بتري بواسطة حفر ثقوبلهم في دريميل اداة أو ما شابه ذلك كما هو موضح في الشكل 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 1-1،5 مل من EFH-SFM أو FBS-SFM على جانبي الحوض الصغير المركزية، و 7-8 مل من SFM في كل طبق بتري فارغة. طبق بتري مكان واحد على كل جانب من الحوض الصغير غرفة انجذاب غلفاني المركزي ومكان واحد جي / أجكل الكهربائي في كل طبق. جسر الفجوة بين غرفة انجذاب غلفاني وأطباق بتري لإنشاء الاستمرارية الكهربائية مع الجسور هلام الاغاروز، كما هو مبين في الشكل 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل الأقطاب الكهربائية جي / أجكل إلى مصدر طاقة خارجي، مع مقياس التيار الكهربائي في سلسلة لقياس التيار الكهربائي، وتشغيل التيار الكهربائي. استخدام الفولتميتر لقياس قوة الحقل الكهربائي مباشرة عبر الحوض الصغير المركزية، وضبط إخراج التيار الكهربائي حتى يتم تحقيق المطلوب شدة المجال الكهربائي (للفحوصات التي أجريت في هذا المختبر الاستفادة من قوة dcEF من 250 بالسيارات / ملم مع التيار الكهربائي بين 1 و 1.5 مللي أمبير). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> املبادراتالشركة المصرية للاتصالات وحدة مرور الزمن على نظام الخلية الحية التصوير، والسماح للتجربة لخوض المبلغ المطلوب من الوقت. بعد الانتهاء من الفحص، وتحديد الخلايا في بارافورمالدهيد 4٪ للتحليل المناعية القياسية. </li></ol>

<ol>
	<li>Borgens, R. B., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+histogenesis+from+morphogenesis+in+the+vertebrate+embryo+by+collapse+of+the+transneural+tube+potential.">Uncoupling histogenesis from morphogenesis in the vertebrate embryo by collapse of the transneural tube potential.</a> Dev. Dyn. 203, 456-467 (1995).</li><li>Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+cues+regulate+the+orientation+and+frequency+of+cell+division+and+the+rate+of+wound+healing+in+vivo.">Electrical cues regulate the orientation and frequency of cell division and the rate of wound healing in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 13577-13582 (2002).</li><li>Song, B., Zhao, M., Forrester, J., McCaig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+regeneration+and+wound+healing+are+stimulated+and+directed+by+an+endogenous+electrical+field+in+vivo.">Nerve regeneration and wound healing are stimulated and directed by an endogenous electrical field in vivo.</a> Journal of Cell Science. 117, 4681-4690 (2004).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+and+population+analyses+demonstrate+that+an+EGF-responsive+mammalian+embryonic+CNS+precursor+is+a+stem+cell.">Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell.</a> Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).</li><li>Chiasson, B. J., Tropepe, V., Morshead, C. M., vander Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mammalian+forebrain+ependymal+and+subependymal+cells+demonstrate+proliferative+potential,+but+only+subependymal+cells+have+neural+stem+cell+characteristics.">Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have neural stem cell characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 4462-4471 (1999).</li><li>Erickson, C. A., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+fibroblast+motility+and+orientation+can+be+influenced+by+physiological+electric+fields.">Embryonic fibroblast motility and orientation can be influenced by physiological electric fields.</a> J. Cell Biol. 98, 296-307 (1984).</li><li>Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+and+directed+migration+of+cultured+corneal+epithelial+cells+in+small+electric+fields+are+serum+dependent.">Orientation and directed migration of cultured corneal epithelial cells in small electric fields are serum dependent.</a> J. Cell Sci. 109, 1405-1414 (1996).</li><li>Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct-Current+Electrical+Field+Guides+Neuronal+Stem/Progenitor+Cell+Migration.">Direct-Current Electrical Field Guides Neuronal Stem/Progenitor Cell Migration.</a> Stem Cells. 26, 2193-2200 (2008).</li><li>Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo.">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nat. Protoc. 2, 1479-1489 (2007).</li><li>Huang, C. -. W., Cheng, J. -. Y., Yen, M. -. H., Young, T. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+a+multiple-electric-field+chip.">Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip.</a> Biosen Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).</li><li>SATO, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input-output+relationship+in+galvanotactic+response+of+Dictyostelium+cells.">Input-output relationship in galvanotactic response of Dictyostelium cells.</a> Biosystems. 88, 261-272 (2007).</li><li>Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+mediated+electrotaxis+of+embryonic+and+adult+neural+progenitor+cells+in+the+presence+of+growth+factors.">PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors.</a> Exp. Neurol. 227, 210-217 (2011).</li><li>Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lipids,+EGF+receptors,+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field.">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> The FASEB Journal. , (2002).</li><li>Fang, K., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+relocalization+and+kinase+activity+are+necessary+for+directional+migration+of+keratinocytes+in+DC+electric+fields.">Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields.</a> J. Cell Sci. 112, 1967-1976 (1999).</li><li>McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+Cell+Behavior+Electrically:+Current+Views+and+Future+Potential.">Controlling Cell Behavior Electrically: Current Views and Future Potential.</a> Physiol. Rev. 85, 943-978 (2005).</li><li>Morshead, C. M., Benveniste, P., Iscove, N. N., vander Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+competence+is+a+rare+property+of+neural+stem+cells+that+may+depend+on+genetic+and+epigenetic+alterations.">Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations.</a> Nat. Med. 8, 268-273 (2002).</li><li>Babona-Pilipos, R., Droujinine, I. A., Popovic, M. R., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Subependymal+Neural+Precursors,+but+Not+Differentiated+Cells,+Undergo+Rapid+Cathodal+Migration+in+the+Presence+of+Direct+Current+Electric+Fields.">Adult Subependymal Neural Precursors, but Not Differentiated Cells, Undergo Rapid Cathodal Migration in the Presence of Direct Current Electric Fields.</a> PLoS ONE. 6, e23808 (2011).</li><li>Deuschl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Randomized+Trial+of+Deep-Brain+Stimulation+for+Parkinson's+Disease.">A Randomized Trial of Deep-Brain Stimulation for Parkinson's Disease.</a> N. Engl. J. Med. 355, 896-908 (2006).</li><li>Stone, S. S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+Entorhinal+Cortex+Promotes+Adult+Neurogenesis+and+Facilitates+Spatial+Memory.">Stimulation of Entorhinal Cortex Promotes Adult Neurogenesis and Facilitates Spatial Memory.</a> J. Neurosci. 31, 13469-13484 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد تم تكييف هذا البروتوكول من أساليب راسخة من الدراسات السابقة 7-9. ويمكن بناء غرف Galvanotactic باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات المختلفة، بما في ذلك بناء كوب منفصلة بشكل جيد لاحتجاز بذر الخلية، أو باستخدام الليزر التذرية CO 2 لمن الحوض الصغير الدقيق microfabrication...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td height="44"> اسم البند </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> عزل الخلايا العصبية السلائف </td></tr><tr><td> 2M كلوريد الصوديوم </td><td> سيجما </td><td> S5886 </td><td> ز 11،688 المذاب في 100 مل O 2 درهم </td></tr><tr><td> 1M بوكل </td><td> سيجما </td><td> P5405 </td><td> 7،456 ز المذاب في 100 مل O 2 درهم </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> سيجما </td><td> M2393 </td><td> 20،33 ز المذاب في 100 مل O 2 درهم </td></tr><tr><td> 155 مم 3 NaHCO </td><td> سيجما </td><td> S5761 </td><td> 1،302 ز المذاب في 100 مل O 2 درهم </td></tr><tr><td> 0.5M الجلوكوز </td><td> سيجما </td><td> G6152 </td><td> 9،01 ز حل في 100مل DH 2 O </td></tr><tr><td> 108 مم CaCl 2 </td><td> سيجما </td><td> C7902 </td><td> 1،59 ز المذاب في 100 مل O 2 درهم </td></tr><tr><td> البنسلين الستربتوميسين </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> الأبقار البنكرياس التربسين </td><td> سيجما </td><td> T1005 </td><td></td></tr><tr><td> الأغنام الخصيتين هيالورونيداز </td><td> سيجما </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> Kynurenic حمض </td><td> سيجما </td><td> K3375 </td><td></td></tr><tr><td> مخاطاني البيض التربسين المانع </td><td> ورثينجتون </td><td> LS003086 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> إينفيتروجن </td><td> 12100046 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> إينفيتروجن </td><td> 21700075 </td><td></td></tr><tr><td> 30٪ جلوكوز </td><td> سيجما </td><td> G6152 </td><td></td></tr><tr><td> 7.5٪ NaHCO 3 </td><td> سيجما </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> سيجما </td><td> H3375 </td><td> 23،83 ز المذاب في 100 مل O 2 درهم </td></tr><tr><td> الجلوتامين L- </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> EGF </td><td> إينفيتروجن </td><td> PMG8041 </td><td> إعادة في 1 مل من مزيج الهرمونات وقسامة إلى 20 وحدة ميكرولتر. </td></tr><tr><td> FGF </td><td> إينفيتروجن </td><td> PHG0226 </td><td> إعادة في 0.5 مل من مزيج الهرمونات وقسامة إلى 20 وحدة ميكرولتر. </td></tr><tr><td> الهيبارين </td><td> سيجما </td><td> H3149 </td><td></td></tr><tr><td> APO-ترانسفيرين </td><td> R &amp; D أنظمة </td><td> 3188-AT </td><td> 0.1 غ في حل DH مل 4 2 0 </td></tr><tr><td> بوتريسين </td><td> سيجما </td><td> P7505 </td><td> حل 9،61 ملغ في آبو-ترانسفيرين ذلكlution </td></tr><tr><td> الأنسولين </td><td> سيجما </td><td> I5500 </td><td> حل 25 ملغ في 0.5 مل من حمض الهيدروكلوريك 0.1N وإضافة إلى 3.5 مل من DH 2 0 </td></tr><tr><td> عنصر السيلينيوم </td><td> سيجما </td><td> S9133 </td><td></td></tr><tr><td> البروجسترون </td><td> سيجما </td><td> P6149 </td><td></td></tr><tr><td> أدوات تشريح القياسية </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td></td><td></td></tr><tr><td> تشريح المجهر </td><td> زايس </td><td> STEMI 2000 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> انجذاب غلفاني غرفة التحضير </td></tr><tr><td> مربع الشرائح الزجاجية غطاء </td><td> VWR </td><td> 16004 </td><td></td></tr><tr><td> 6N حمض الهيدروكلوريك </td><td> VWR </td><td> BDH3204-1 </td><td></td></tr><tr><td> ارتفاع الشحوم فراغ </td><td> داو كورنينج </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 60 مم أطباق بتري </td><td> فيشر العلمية </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> بولي يسين-L- </td><td> سيجما </td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 354234 </td><td> ذوبان الجليد وقسامة إلى 150 وحدة ميكرولتر </td></tr><tr><td> FBS </td><td> إينفيتروجن </td><td> 10082139 </td><td> استخدام فقط في حالة حمل تمايز NPC، وإلا استخدام وسائل الإعلام الثقافة SFM + EFH كما هو مبين أعلاه </td></tr><tr><td> عد المجهر </td><td> OLYMPUS </td><td> CKX41 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> تعيش خلية الوقت الفاصل بين التصوير </td></tr><tr><td> الفضة الأسلاك </td><td> الفا Aesar </td><td> 11434 </td><td></td></tr><tr><td> عالى النقاء الاغاروز </td><td> إينفيتروجن </td><td> 15510-027 </td><td></td></tr><tr><td> الحرارة Inactivated FBS </td><td> سيجما </td><td> 16140071 </td><td></td></tr><tr><td> PVC أنابيب </td><td> فيشر العلمية </td><td> 80000006 </td><td> 3/32 &quot;ID X 5/32&quot; OD </td></tr><tr><td> تبييض </td><td> كلوروكس </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10 سم مكعب حقنة </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> 18 إبرة قياس </td><td> BD </td><td> 305195 </td><td></td></tr><tr><td> DREMEL الحفر </td><td> DREMEL </td><td> نموذج 750 </td><td></td></tr><tr><td> المجهر المقلوب غرفة مجهزة، مرطب المحتضنة </td><td> زايس </td><td> Axiovert-200M </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> وصفات <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> بند </td><td> حجم </td></tr><tr><td> 2M كلوريد الصوديوم </td><td> 6،2 مل </td></tr><tr><td>1M بوكل </td><td> 0.5 مل </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 0،32 مل </td></tr><tr><td> 155mM NaHCO 3 </td><td> 16،9 مل </td></tr><tr><td> 1M الجلوكوز </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> 108 مم CaCl 2 </td><td> 0،09256 مل </td></tr><tr><td> البنسلين الستربتوميسين </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> تعقيمها المياه </td><td> 74 مل </td></tr></tbody></table> السائل النخاعي الاصطناعي <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> بند </td><td> حجم أو كتلة </td></tr><tr><td> السائل النخاعي الاصطناعي </td><td> 30 مل </td></tr><tr><td> الأبقار البنكرياس التربسين </td><td> 40 ملغ </td></tr><tr><td> الأغنام الخصيتين هيالورونيداز </td><td> 22،8 ملغ </td></tr><tr><td> Kynurenic حمض </td><td> 5 ملغ </td></tr></tbody></table> &lt;STRONG&gt; الحل التربسين <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> بند </td><td> حجم أو كتلة </td></tr><tr><td> SFM </td><td> 15 مل </td></tr><tr><td> مخاطاني البيض التربسين المانع </td><td> 10 ملغ </td></tr></tbody></table> التربسين المانع الحل <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> بند </td><td> حجم </td></tr><tr><td> تعقيمها المياه </td><td> 37 مل </td></tr><tr><td> 10X DMEM/F12 </td><td> 10 مل </td></tr><tr><td> 30٪ جلوكوز </td><td> 2 مل </td></tr><tr><td> 7.5٪ NaHCO 3 </td><td> 1.5 مل </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> 0.5 مل </td></tr><tr><td> ترانسفيرين، بوتريسين الحل </td><td> 4 مل </td></tr><tr><td> 25 ملغ حل الأنسولين </td><td> 4 مل </td></tr><tr><td> عنصر السيلينيوم </td><td> 100 &amp; مو؛ L </td></tr><tr><td> البروجسترون </td><td> 100 ميكرولتر </td></tr></tbody></table> ميكس هرمون (100 مل المجموع، المحل في -20 درجة مئوية) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> بند </td><td> حجم </td></tr><tr><td> تعقيمها المياه </td><td> 37،5 مل </td></tr><tr><td> 10X DMEM/F12 (3:1) </td><td> 5 مل </td></tr><tr><td> 30٪ جلوكوز </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> 7.5٪ NaHCO 3 </td><td> 0،75 مل </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> 0.25 مل </td></tr><tr><td> هرمون مزيج </td><td> 5 مل </td></tr><tr><td> الجلوتامين L- </td><td> 0.5 مل </td></tr><tr><td> البنسلين الستربتوميسين </td><td> 0.5 مل </td></tr></tbody></table> المصل وسائل الإعلام الحرة EFH-SFM: إضافة 10 ميكرولتر من EGF، 10 ميكرولتر من جمعية جيل المستقبل، و3.66 ميكرولتر من الهيبارين FBS-SFM: إضافة 0.5 مل FBS <taبلي الحدود = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> بند </td><td> حجم </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> 150 ميكرولتر </td></tr><tr><td> SFM </td><td> 3،6 مل </td></tr></tbody></table> يجب وضع Matrigel قسامة Matrigel الحل في مربع من الجليد وذوبان الجليد يسمح للببطء على مدى 4-5 ساعات لتشكيل سائل لزج قبل الاختلاط SFM. وهذا سيضمن تشكيل طبقة ناعمة من الركيزة Matrigel. إن لم يكن إذابة ببطء، والركيزة الناتجة تحتوي على كتل من Matrigel، مما يعيق ربما الهجرة الخلية. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> بند </td><td> حجم أو كتلة </td></tr><tr><td> عالى النقاء الاغاروز </td><td> 300 ملغ في DDH مل 10 2 0 </td></tr><tr><td> SFM FBS المعطل الحرارة </td><td> 8 مل 2 مل </td></tr></tbody></table> Matrigelمزيج الحل 8 مل من SFM مع 2 مل FBS المعطل الحرارة في أنبوب الصقر 15 سم مكعب. مزيج الاغاروز مع DDH مل 10 2 0 في دورق مخروطي، والحرارة في الميكروويف لمدة 30 ثانية في 10 ثانية فترات، وضمان لإزالة الحل من فرن الميكروويف بعد كل فاصل زمني 10-ثوانى ومزيج دقيق. بعد فترة أخيرة ميكروويف 10-ثوانى، مزيج الحل مع الاغاروز الحل SFM FBS / ومخزن في حمام ماء C ° 57. </td></tr></tbody></table>

a galvanotaxis assay for analysis of neural precursor cell migration kinetics in an externally applied direct current electric field

وقد أدى اكتشاف الجذعية العصبية والخلايا الاصلية (وهو ما يسمى خلايا السلائف جماعي العصبية) (الشخصيات) في دماغ الثدييات الكبار لمجموعة من البحوث التي تهدف إلى الاستفادة من خصائص متعددة القدرات والتكاثري من هذه الخلايا لتطوير استراتيجيات neuroregenerative. A خطوة حاسمة لنجاح هذه الاستراتيجيات هو تعبئة الشخصيات نحو موقع الآفة أو بعد زرع الخارجية لتعزيز الاستجابة للالسلائف الذاتية التي تم العثور عليها في المنطقة المحيطة بالبطين من الجهاز العصبي المركزي. وفقا لذلك، من الضروري لفهم الآليات التي تشجع، توجيه، وتعزيز الهجرة NPC. عملنا يركز على الاستفادة من حقول التيار الكهربائي المباشر (dcEFs) لتعزيز والهجرة مباشرة NPC - وهي ظاهرة تعرف باسم انجذاب غلفاني. الذاتية المجالات الكهربائية الفيزيولوجية يعمل واشارات حاسمة للهجرة الخلايا خلال التطور الطبيعي وإصلاح الجرح. تعطيل الدوائيةعبر أنبوب العصبي في الأجنة المحتملة قنفذ البحر يسبب تشوهات في النمو الحاد 1. في سياق التئام الجروح، ويرتبط بشكل مباشر على معدل إصلاح القرنية الجرحى مع حجم إمكانيات الجرح الظهارية الذي ينشأ بعد الإصابة، كما يتضح من تعزيز الدوائية أو تعطيل هذا dcEF 2-3. لقد أثبتنا أن اللجان التحضيرية الوطنية تحت البطانة العصبية الكبار الخضوع الهجرة السريع وإخراج المهبطي في المختبر عند تعرضها إلى dcEF يطبق خارجيا. في هذا البروتوكول وصفنا تقنيات المختبر لإنشاء مقايسة انجذاب غلفاني بسيطة وفعالة لتسوية عالية، على المدى الطويل مراقبة موجهة الخلية إزفاء الجسم (الهجرة) على مستوى وحيدة الخلية. وهذا الاختبار تكون مناسبة للتحقيق في الآليات التي تنظم تنبيغ dcEF في الحركة الخلوية من خلال استخدام الفئران المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب، RNA قصيرة التدخل، أو منبهات مستقبلات محددة / الخصوم.

تحليل يكشف عن أن الحركية في وجود dcEF بالسيارات / 250 مم، عرض الشخصيات غير متمايزة انجذاب غلفاني الموجهة للغاية وسريعة نحو القطب السالب (الشكل 5A، الفيلم 1). في حالة عدم وجود dcEF، لوحظ حركة عشوائية من الخلايا (الشكل 5B، فيلم 2). في هذه القوة الميدانية،&gt; 98٪ من...

Watch this Scientific Journal Video about A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field at JoVE.com

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

في هذا البروتوكول ونحن لشرح كيفية بناء الغرف المخصصة التي تسمح بتطبيق حقل كهربائي مباشر الحالية لتمكين الوقت الفاصل بين التصوير من الدماغ العصبية مشتقة الكبار إزفاء الخلية تمهيدا خلال انجذاب غلفاني.

A الفحص انجذاب غلفاني لتحليل حركية العصبية السلائف الهجرة خلية في الحقل الحالي مباشرة التطبيقية خارجيا الكهربائية

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

a-galvanotaxis-assay-for-analysis-neural-precursor-cell-migration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.4K Views.  University of Toronto. في هذا البروتوكول ونحن لشرح كيفية بناء الغرف المخصصة التي تسمح بتطبيق حقل كهربائي مباشر الحالية لتمكين الوقت الفاصل بين التصوير من الدماغ العصبية مشتقة الكبار إزفاء الخلية تمهيدا خلال انجذاب غلفاني.

Video: A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

العصبية تشكيل مستعمرة الفحص الخلوي : إن الفحص تميز بحسن نية الخلايا الجذعية العصبية من الخلايا العصبية السلف

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after undergoing an epithelial-mesenchymal transition 1,2. Following EMT, NCCs migrate large distances along stereotypic pathways until they reach their targets. NCCs differentiate into a vast array of cell types including neurons, glia, melanocytes, and chromaffin cells 1-3. The ability of NCCs to reach and recognize their proper target locations is foundational for the appropriate formation of all structures containing trunk NCC-derived components 3. Elucidating the mechanisms of guidance for trunk NCC migration has therefore been a matter of great significance. Numerous molecules have been demonstrated to guide NCC migration 4. For instance, trunk NCCs are known to be repelled by negative guidance cues such as Semaphorin, Ephrin, and Slit ligands 5-8. However, not until recently have any chemoattractants of trunk NCCs been identified 9. 
Conventional in vitro approaches to studying the chemotactic behavior of adherent cells work best with immortalized, homogenously distributed cells, but are more challenging to apply to certain primary stem cell cultures that initially lack a homogenous distribution and rapidly differentiate (such as NCCs). One approach to homogenize the distribution of trunk NCCs for chemotaxis studies is to isolate trunk NCCs from primary NT explant cultures, then lift and replate them to be almost 100% confluent. However, this plating approach requires substantial amounts of time and effort to explant enough cells, is harsh, and distributes trunk NCCs in a dissimilar manner to that found in in vivo conditions. 
Here, we report an in vitro approach that is able to evaluate chemotaxis and other migratory responses of trunk NCCs without requiring a homogenous cell distribution. This technique utilizes time-lapse imaging of primary, unperturbed trunk NCCs inside a modified Zigmond chamber (a standard Zigmond chamber is described elsewhere10). By exposing trunk NCCs at the periphery of the culture to a chemotactant gradient that is perpendicular to their predicted natural directionality, alterations in migratory polarity induced by the applied chemotactant gradient can be detected. This technique is inexpensive, requires the culturing of only two NT explants per replicate treatment, avoids harsh cell lifting (such as trypsinization), leaves trunk NCCs in a more similar distribution to in vivo conditions, cuts down the amount of time between explantation and experimentation (which likely reduces the risk of differentiation), and allows time-lapse evaluation of numerous migratory characteristics.

An approach to analyze the migration of explanted cells (trunk neural crest cells) is described. This method is inexpensive, gentle, and capable of distinguishing chemotaxis from both chemokinesis and other influences on migratory polarity such as those derived from cell-cell interactions within the primary trunk neural crest cell culture.

تحليل العصبية كريست الهجرة جذع الخلية باستخدام التعديل الفحص غرفة زيجموند

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

استنساخه سحق الفأر العصب الوركي وتقييم لاحق للتجديد من قبل الجامعة جبل تحليل العضلات

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. Chimeric avian embryos, in which quail donor tissue is transplanted into a chick embryo in ovo, combine the power of indelible genetic labeling of cell populations with the ease of manipulation presented by the avian embryo.
Quail-chick chimeras are a classical tool for tracing migratory neural crest cells (NCCs)1-3. NCCs are a transient migratory population of cells in the embryo, which originate in the dorsal region of the developing neural tube4. They undergo an epithelial to mesenchymal transition and subsequently migrate to other regions of the embryo, where they differentiate into various cell types including cartilage5-13, melanocytes11,14-20, neurons and glia21-32. NCCs are multipotent, and their ultimate fate is influenced by 1) the region of the neural tube in which they originate along the rostro-caudal axis of the embryo11,33-37, 2) signals from neighboring cells as they migrate38-44, and 3) the microenvironment of their ultimate destination within the embryo45,46. Tracing these cells from their point of origin at the neural tube, to their final position and fate within the embryo, provides important insight into the developmental processes that regulate patterning and organogenesis.
Transplantation of complementary regions of donor neural tube (homotopic grafting) or different regions of donor neural tube (heterotopic grafting) can reveal differences in pre-specification of NCCs along the rostro-caudal axis2,47. This technique can be further adapted to transplant a unilateral compartment of the neural tube, such that one side is derived from donor tissue, and the contralateral side remains unperturbed in the host embryo, yielding an internal control within the same sample2,47. It can also be adapted for transplantation of brain segments in later embryos, after HH10, when the anterior neural tube has closed47.
Here we report techniques for generating quail-chick chimeras via neural tube transplantation, which allow for tracing of migratory NCCs derived from a discrete segment of the neural tube. Species-specific labeling of the donor-derived cells with the quail-specific QCPN antibody48-56 allows the researcher to distinguish donor and host cells at the experimental end point. This technique is straightforward, inexpensive, and has many applications, including fate-mapping, cell lineage tracing, and identifying pre-patterning events along the rostro-caudal axis45. Because of the ease of access to the avian embryo, the quail-chick graft technique may be combined with other manipulations, including but not limited to lens ablation40, injection of inhibitory molecules57,58, or genetic manipulation via electroporation of expression plasmids59-61, to identify the response of particular migratory streams of NCCs to perturbations in the embryo's developmental program. Furthermore, this grafting technique may also be used to generate other interspecific chimeric embryos such as quail-duck chimeras to study NCC contribution to craniofacial morphogenesis, or mouse-chick chimeras to combine the power of mouse genetics with the ease of manipulation of the avian embryo.62

An approach for analyzing migration and eventual fate of avian neural crest cells in quail-chick chimeric embryos is described. This method is a simple and straightforward technique for tracing neural crest cells during migration and differentiation that are otherwise difficult to distinguish within an unmanipulated chick embryo.

تحليل للهجرة كريست العصبية والتمايز بواسطة الصليب الأنواع زرع

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

الفحص Neuroblast: والفحص للانشاء وإثراء خلايا متعلق بالخلايا العصبية السلف من التفريق العصبية الجذعية آله الخلية باستخدام التدفق الخلوي

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout the developing vertebrate embryo. In addition to providing peripheral glia and neurons, NCC generate melanocytes as well as most of the cranio-facial skeleton. NCC migration and differentiation is controlled by a combination of their axial origin along the neural tube and their exposure to regionally distinct extracellular cues. Such contribution of extracellular ligands is especially evident during the formation of the enteric nervous system (ENS), a complex interconnected network of neural ganglia that locally controls (among other things) gut muscle movement and intestinal motility. Most of the ENS is derived from a small initial pool of NCC that undertake a long journey in order to colonize - in a rostral to caudal fashion - the entire length of the prospective gut. Among several signaling pathways known to influence enteric NCC colonization, GDNF/RET signaling is recognized as the most important. Indeed, spatiotemporally controlled secretion of the RET ligand GDNF by the gut mesenchyme is chiefly responsible for the attraction and guidance of RET-expressing enteric NCC to and within the embryonic gut. Here, we describe an ex vivo cell migration assay, making use of a transgenic mouse line possessing fluorescently labeled NCC, which allows precise quantification of enteric NCC migration potential in the presence of various growth factors, including GDNF.

We present an ex vivo cell migration assay that allows precise quantification of enteric neural crest cell migration potential in the presence of various growth factors.

مقايسة الهجرة الخلية الكمي لالفئران العصبية المعوية أسلاف

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls body functions and internal organ rhythms when animals are exposed to emotional challenges and changes in their living environments. In general experiments, signals from different organs, such as the brain and the heart, are recorded by independent recording systems that require multiple recording devices and different procedures for processing the data files. This study describes a new method that can simultaneously monitor electrical biosignals, including tens of local field potentials in multiple brain regions, electrocardiograms that represent the cardiac rhythm, electromyograms that represent awake/sleep-related muscle contraction, and breathing signals, in a freely moving rat. The recording configuration of this method is based on a conventional micro-drive array for cortical local field potential recordings in which tens of electrodes are accommodated, and the signals obtained from these electrodes are integrated into a single electrical board mounted on the animal's head. Here, this recording system was improved so that signals from the peripheral organs are also transferred to an electrical interface board. In a single surgery, electrodes are first separately implanted into the appropriate body parts and the target brain areas. The open ends of all of these electrodes are then soldered to individual channels of the electrical board above the animal's head so that all of the signals can be integrated into the single electrical board. Connecting this board to a recording device allows for the collection of all of the signals into a single device, which reduces experimental costs and simplifies data processing, because all data can be handled in the same data file. This technique will aid the understanding of the neurophysiological correlates of the associations between central and peripheral organs.

This study introduces a method for the simultaneous recording of local field potentials in the brain, electrocardiograms, electromyograms, and breathing signals of a freely moving rat. This technique, which reduces experimental costs and simplifies data analysis, will contribute to the understanding of the interactions between the brain and peripheral organs.

التسجيلات المتزامنة الإمكانات الميدانية المحلية القشرية، ورسم القلب، اليكتروميوجرام وإيقاع من الفئران تتحرك بحرية في التنفس

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

تسجيل بصري ذو صورة واحدة في شرائح الدماغ باستخدام صبغ حساس للجهد الكهربائي

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

High-Content Screening Differentiation and Maturation Analysis of Fetal and Adult Neural Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Precursor Cell Cultures

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance between in vitro simplification and recreating the complex in vivo environment, along with the main aim, shared by all screening strategies, of obtaining robust and reliable data, highly predictive for in vivo translation.
In the field of demyelinating diseases, the majority of drug screening strategies are based on immortalized cell lines or pure cultures of isolated primary oligodendrocyte precursor cells (OPCs) from newborn animals, leading to strong biases due to the lack of age-related differences and of any real pathological condition or complexity.
Here we show the setup of an in vitro system aimed at modeling the physiological differentiation/maturation of neural stem cell (NSC)-derived OPCs, easily manipulated to mimic pathological conditions typical of demyelinating diseases. Moreover, the method includes isolation from fetal and adult brains, giving a system which dynamically differentiates from OPCs to mature oligodendrocytes (OLs) in a spontaneous co-culture which also includes astrocytes. This model physiologically resembles the thyroid hormone-mediated myelination and myelin repair process, allowing the addition of pathological interferents which model disease mechanisms. We show how to mimic the two main components of demyelinating diseases (i.e., hypoxia/ischemia and inflammation), recreating their effect on developmental myelination and adult myelin repair and taking all the cell components of the system into account throughout, while focusing on differentiating OPCs.
This spontaneous mixed model, coupled with cell-based high-content screening technologies, allows the development of a robust and reliable drug screening system for therapeutic strategies aimed at combating the pathological processes involved in demyelination and at inducing remyelination.

We describe the production of mixed cultures of astrocytes and oligodendrocyte precursor cells derived from fetal or adult neural stem cells differentiating into mature oligodendrocytes, and in vitro modeling of noxious stimuli. The coupling with a cell-based high-content screening technique builds a reliable and robust drug screening system.

عالية المحتوى فحص التمايز وتحليل النضج من الجنين والكبار الخلايا الجذعية العصبية المشتقة من ثقافات الخلايا السليفة Oligodendrocyte

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance ...