فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور تشنغ هوى (كلية بايلور للطب) لAPP [كدنا]. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R21AG031948 (DB، JMB)، F30AG030878 (ESS)، R01DK073394 (AFO)، وسيلي جون صندوق الهبات التذكارية للبحوث الطبية الحيوية (AFO)، وجان وليم C. D. ويليس العلوم العصبية بحوث الوقف (ESS). JMB هو باحث في برنامج البحوث الباحث بالحركة وعضو في جامعة تكساس الطبية فرع كلود E. فلفل أقدم مركز الاستقلال الأميركيين (بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح UL1RR029876 وP30-AG-024832 على التوالي).

<html> 1. التعبير عن المؤتلف المجال APP بين الخلايا (AICD) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل E. القولونية BL21 مع توتر AICD الإنسان (بقايا 649-695 من APP، الخلايا العصبية شكل الإسوي الترقيم) المستنسخة في ناقلات pGEX-1-4T (GE للرعاية الصحية). ستبدي AICD هذه النواقل مثل C-شاردة محطة من البروتين الانصهار الجلوتاثيون-S-ترانسفيراز (ضريبة المبيعات). هذه النواقل بترميز أيضا تسلسل الانقسام ثرومبين لتسهيل إزالة شاردة GST. ويمكن الاطلاع على تفاصيل الاستنساخ AICD في pGEX-1-4T في نشر رسائلنا السابقة 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من مستعمرة واحدة، تطعيم 10 مل من مرق LB مع الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل)، واحتضان بين عشية وضحاها في C ° 37 مع اهتزاز قوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي، تطعيم 400 مل LB / الأمبيسلين في قارورة سعة لتر واحد مع 5 مل من الثقافة بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في C ° 37 مع قوي يهز حتى الكثافة البصرية في 600 نانومتر وصلت 0،4 حتي 0،6. سوف يستغرق ذلك عادة 2 حتي 2،5 ساعة. </li></ol>المحتوى &quot;&gt; عند هذه النقطة قد يكون من المستحسن أن تحصل على عينة صغيرة (~ 10 ميكرولتر) لمتابعة عملية تنقية بواسطة SDS-PAGE (انظر الشكل 1A، B). كل خطوة لاحقة تنقية ينبغي أن يكون أيضا إزالة قسامة الصغيرة لتحليل بواسطة SDS-PAGE. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمل التعبير عن GST-AICD بإضافة 0.4 مم من الآيزوبروبيل بيتا-D-thiogalactopyranoside (IPTG). احتضان في C ° 37 مع قوي يهز لمدة 5 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 6،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. يمكن تخزين بيليه الخلية في C ° -80 لعدة أشهر في هذه المرحلة من العملية. </li></ol> 2. تنقية GST-AICD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخزنة 1 ملم dithiothreitol، 1MM ethylenediaminetetraacetic حمض (EDTA)، 0.1٪ تريتون-X100، 1 ملم فلوريد phenylmethylsulfonyl (PMSF)، كاملة كوكتيل مثبط البروتياز (روش العلوم التطبيقية)، والفوسفات المالحة: تجهيز 50 مل العازلة تحلل على النحو التالي. البرد على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد بيليه البكتيرية (إذا جمدت سابقا) علىالجليد. </li></ol> عند هذه النقطة، فمن الأهمية بمكان أن يتم تنفيذ جميع الخطوات في 4 درجات مئوية للحد من التحلل البروتيني. ينبغي لجميع الأنابيب، مخازن، وغيرها من الكواشف يكون قبل مبردة. إذا باستخدام الصحافة الفرنسية أو مستحلب للتحلل، وينبغي أن تكون هذه قبل المبردة أيضا. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه بدقة البكتيرية في 20 مل من العازلة تحلل. ومن خلال الجمع بين vortexing وسحن مع ماصة 10 مل على الجليد ضمان إعادة تعليق كامل للبيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمر الخلايا البكتيرية من خلال معلق مستحلب (على سبيل المثال، Avestin EmulsiFlex-C3) أو الفرنسية خلية الضغط، قبل المبردة إلى 4 ° C 30000 رطل لكل بوصة مربعة في. تمرير المحللة من خلال مستحلب للمرة الثانية. جمع المحللة في أنبوب ما قبل المبردة 50 مل. </li></ol> والميزة الرئيسية لهاتين الأداتين هو أنها تقليل تسخين العينة. هذه التقنية تستخدم عادة من صوتنة يولد حرارة كبيرة في الطرف الجنوبي من التحقيق وصوتنةيمكن أن يؤدي إلى تجميع البروتينات المؤتلف. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لالمحللة على 15،000 XG لمدة 30 دقيقة. فصل والحفاظ على طاف في أنبوب ما قبل المبردة 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من 50٪ من الطين الجلوتاثيون-الاغاروز (سيغما الدريخ). تدوير لمدة 30 دقيقة في C. ° 4 في حين أن العينة يدور، وجعل جديدة عازلة شطف: 50 ملي تريس، 7.8-0.1٪ تريتون X100، 0.5 مم dithiothreitol، 10 ملم الجلوتاثيون المختزل. </li></ol> الخطوة الوحيدة للبروتوكول التي أجريت في درجة حرارة الغرفة هي الخطوة شطف. وهكذا، يتم الاحتفاظ المخزن المؤقت شطف في درجة حرارة الغرفة. وينبغي إعداد العازلة شطف الطازجة. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب مخزنة المحللة والطين القابل للتصرف في 5 &quot;البوليسترين العمود اللوني مع الخشنة (90-130 ميكرون) مرشحات (العلمية الخضرة). اغسل العمود 5 مرات مع 3 مل من الفوسفات المالحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتويج الجزء السفلي من العمود وإضافة 500 ميكرولتر من العازلة شطف درجة حرارة الغرفة. سقف أعلىوتناوب العمود لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. جمع شطافة إلى 1،5 أنبوب المبرد microfuge مل. تكرار شطف مرتين أخريين (1.5 مل شطافة الكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخزنة في Dialyze شطافة في الغشاء على 10،000 الوزن الجزيئي غسيل الكلى قطع (على سبيل المثال، الحرارية العلمية الشرائح-A-Lyzer غسيل الكلى أشرطة) في 4 لتر ​​من الفوسفات المالحة ليلة وضحاها في C. ° 4 مخزنة Dialyze ضد لتر 4 إضافية من الفوسفات المالحة في 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة في اليوم التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة البروتين من كاسيت غسيل الكلى وإجراء فحص البروتين الكمي لتحديد العائد من GST-AICD. وهناك تنقية نموذجية من 400 مل من الثقافة يؤدي إلى غلة 20 ملغ&gt; من البروتين النقي في تركيزات من 10-20 ملغ / مل. قسامة البروتين إلى 200 ميكرولتر مأخوذة وتجميد في -80 ° C. </li></ol> 3. ثرومبين انشقاق من GST-AICD وتنقية AICD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد 200 ميكرولتر من المنقى GST-AICD وإضافة 20 ميكرولتر من thromb U / ميكرولتر 1احتضان بين عشية وضحاها. وعند 37 درجة C. </li></ol> جودة ونقاء ثرومبين اختلافا كبيرا بين الشركات المصنعة، ويمكن أن تكون مصدرا كبيرا للتلوث. نستخدم ثرومبين من الرعاية الصحية GE (انظر الجدول الكواشف). بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها، يجب المشقوق&gt; 95٪ من البروتين الانصهار (1B الشكل). <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانقسام بين عشية وضحاها مع الثرومبين، فمن المرجح أن جزء بسيط من AICD المحررة خضع التجميع والحل قد تظهر غائم. مسح المواد المجمعة بواسطة الطرد المركزي في 20000 XG لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف في أنبوب microfuge قبل مبردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من 50٪ الجلوتاثيون-الاغاروز الطين و 50 ميكرولتر 50٪ الطين ف aminobenzamidine-الاغاروز لإزالة GST والثرومبين، على التوالي. احتضان مع التناوب لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة على الرسوبيات حبات الاغاروز، وإزالة طاف في أنبوب جديد. استخراج رانه GST أربع مرات مع الجلوتاثيون-الاغاروز. A استخراج واحد مع ف aminobenzamidine-الاغاروز يكفي لإزالة U 20 من ثرومبين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء فحص الكميات البروتين في 5 ميكرولتر من AICD المنقى. غلة نموذجية من ثقافة هي 400 مل 50-100 ميكروغرام بتركيز 0،2 حتي 0،5 ملغ / مل. زيادة الغلة ممكنة من كميات أكبر من الشق GST-AICD. </li></ol> وينبغي إعداد تنقية AICD جديدة لتوصيف البيوكيميائية / البيوفيزيائية. يجب التخلص من المواد غير المستخدمة. ومن الممكن أيضا لتركيز AICD من lyophilizing العينة وresuspending في أصغر حجم المخزن المؤقت 6. إذا كشف AICD يتطلب النشاف (مثل بعد فخ تصفية أو نقطة الفحص صمة عار)، ينبغي أن يقوم استرجاع مستضد على الغشاء كما وصفها Pimplikar وسوريانارايانا 12. 4. AICD تجميع للفحص المجهري القوة الذرية (AFM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع طازجة أعدت AICD في ع<html> مخزنة المالحة hosphate إلى تركيز 0.1 مجم / مل في الحجم النهائي من 15 ميكرولتر. عند هذه النقطة، يمكن إضافة مركبات مختلفة و / أو البروتينات لتحديد ما إذا كانت تحول دون تجميع AICD. على سبيل المثال، لقد أظهرنا أن تركيزات متساوي المولية من ubiquilin-1 منع تجميع AICD في هذا الاختبار 4. </li></ol> ومن الممكن أيضا لتجميع كميات أكبر رد فعل للتجارب الكيميائية الحيوية مثل المقايسات فخ تصفية وتشتت الضوء 4. لقد حققنا نجاحا أداء المقايسات فخ تصفية على مخاليط رد فعل بحجم إلى 400 ميكرولتر مع AICD المخفف لتركيزات منخفضة تصل إلى 1 ميكرومتر. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمل التجميع الحراري عن طريق احتضان العينات في C ° 43 مع اهتزاز في 800 دورة في الدقيقة في Thermomixer إيبندورف لمدة 48 ساعة. وقد تم اختيار هذه الدرجة بناء على المقايسات التي كوصي دراسة التجميع الحراري للسينسيز كوصي نموذج سترات الركيزة 4،13. </li></ol>&gt; تجميع الحرارية هي وسيلة تستخدم عادة للحث على التحول الهيكلي من البروتين من الأم إلى بنية غير الأصلية (التي عادة ما تكون غنية ورقة بيتا) مما يؤدي إلى تشكيل المجاميع الجزيئات. كما يستخدم التجميع الحراري لفحص وظيفة المحرمين الجزيئية، والتي تحمي قطاعات مسعور من تشكيل التفاعلات بين الجزيئات غير لائق (وبالتالي تؤخر أو تمنع التجميع الحراري). <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع العينة 20-أضعاف في الماء منزوع الأيونات وبقعة ميكرولتر 2 على الميكا المشقوق حديثا. تجفيف العينة في dessicator بين عشية وضحاها. وسوف يكون من الضروري تحديد تجريبيا التخفيف الأمثل للتصوير، وبالتالي التخفيفات عدة تتراوح بين 10 - إلى أضعاف-100 سيكون من الحكمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور AICD المجمعة باستخدام AFM التشغيل في وضع التنصت 14. والكابولي المستخدمة هي الذهب الصغيرة المغلفة العتلات نيتريد حادة (MSNL، بروكر) مع دائرة نصف قطرها الاسمي تلميح من 2 نانومتر. نموذجية التنصت سعة الدرجي هي 10-20 نانومتر التصوير في تردد الرنين من الكابولي (30-50 كيلو هرتز). </li></ol> وجدنا أن جودة الصورة وعلى النقيض من المجاميع البروتين مختلفة تعتمد على القوة المستخدمة ومدة التجربة. لتقليل الاضطراب عينة من غيض، حافظنا على القوة المستخدمة منخفضة نسبيا عن طريق الحفاظ على نسبة مجموعة نقاط تزيد عن 95٪ والحد من المسح الضوئي من كل عينة إلى 5-10 دقيقة. تم إجراء معالجة الصور مع برنامج WSxM (NANOTEC). وتألفت معيار معالجة الصور من الطائرة وتسطيح الطرح. مختبراتنا استخدام &quot;محلي الصنع&quot; AFM 15 ربطه لتحقيق المسح التجارية نظام التحكم المجهر (NANOTEC). 5. ممثل النتائج يظهر التعبير وإثراء النسبي للGST-1A AICD في الشكل. بعد تحلل، فإن الغالبية من البروتين الانصهار موجود في جزء القابلة للذوبان، وبالتالي استخراج من inclusiعلى الهيئات غير مطلوب. المواد مزال من العمود الاغاروز الجلوتاثيون هو&gt; 95٪ نقية. في إعداد هو موضح في الشكل 1، وكان تركيز البروتين مزال من العمود 14،5 ملغم / لتر، والعائد كان 22 ملغ (من ثقافة ابتداء من 400 مل). أدى الانقسام من 200 ميكرولتر من إعداد هذا بين عشية وضحاها مع 20 U من الانقسام في ثرومبين٪ تقريبا 100 من انصهار بروتين (1B الشكل). كمية ثرومبين المستخدمة هي منخفضة بما فيه الكفاية حتى لا يكون كشفها بواسطة تلطيخ الأزرق Coomassie (انظر &quot;المشقوق&quot; 1B الشكل حارة،). أسفرت إزالة ثرومبين وGST في فقدان بعض المواد، ومع ذلك فإنه كان&gt; 90٪ نقية مع تحقيق عائد في هذا الإعدادية من 70 ميكروغرام من AICD عند تركيز قدره 0.35 ملغ / مل. الشكل 1C يظهر على الرسم البياني لتدفق تجميع AICD وتحليل لاحقة. المجاميع AICD تصوير بواسطة AFM وعادة ما تكون كروي / غير متبلور، وتتراوح في حجمها. 50 حتي 100 نانومتر (الشكل 1D، F) مجموعالمواد لا يمكن كشفها عند إضافة مبلغ متساوي المولية للكوصي ubiquilin-1 إلى رد فعل التجميع (الشكل 1E) 4. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4204/4204fig1.jpg" /> الشكل 1. تنقية وتجميع AICD. A) تلطيخ الأزرق Coomassie من العينات التي تم جمعها في كل خطوة من عملية تنقية. لعينات uninduced والمستحثة، وتشغيل 20 ميكرولتر من البكتيريا كامل على هلام. لجزء طاف، تم تشغيل 5 ميكرولتر من المحللة (من وحدة تخزين ما مجموعه 20 مل) على هلام. لجزء بيليه، كان بيليه معلق في 20 مل من العازلة تحلل، وكانت sonicated 5 ميكرولتر من هذه المواد في المياه sonicator حمام لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية قبل تحميلها على هلام. لflowthrough، تم تشغيل 5 ميكرولتر على هلام. يشار إلى مبالغ شطافة تحميلها على هلام. B) الملون الأزرق Coomassie جل من uncleaved والمشقوق GST-AICD (2 ميكرولتر) و 1 و 5 و مAICD ل المطهرون؛ ش. C) من مخطط انسيابي تنقية AICD، وتجميع، وتحليل. D، E) الصور AFM ممثل تجمع حراريا AICD في غياب (D) وجود (E) كوصي الجزيئية للubiquilin-1. F) الرسم البياني لتوزيع حجم الركام AICD.

<ol>
	<li>De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretases:+enzymes+with+therapeutic+potential+in+Alzheimer+disease.">The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).</li><li>Chang, K. A., Suh, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+roles+of+amyloid+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein.">Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein.</a> BMB reports. 43, 656-663 (2010).</li><li>McLoughlin, D. M., Miller, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FE65+proteins+and+Alzheimer's+disease.">The FE65 proteins and Alzheimer's disease.</a> J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).</li><li>Stieren, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquilin-1+is+a+molecular+chaperone+for+the+amyloid+precursor+protein.">Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).</li><li>Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+structural+changes+in+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+detected+by+NMR.">Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR.</a> J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).</li><li>Ramelot, T. A., Gentile, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+structure+of+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+indicates+preordering+of+structure+for+binding+to+cytosolic+factors.">Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors.</a> Biochem. 39, 2714-2725 (2000).</li><li>Radzimanowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+intracellular+domain+of+the+amyloid+precursor+protein+in+complex+with+Fe65-PTB2.">Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2.</a> EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).</li><li>Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+alters+gene+expression+and+induces+neuron-specific+apoptosis.">The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis.</a> Gene. 475, 1-9 (2011).</li><li>von Rotz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+APP+intracellular+domain+forms+nuclear+multiprotein+complexes+and+regulates+the+transcription+of+its+own+precursor.">The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor.</a> J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).</li><li>Hamid, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+modulates+cellular+calcium+homeostasis+and+ATP+content.">Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content.</a> J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).</li><li>Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+intracellular+domain+impairs+adult+neurogenesis+in+transgenic+mice+by+inducing+neuroinflammation.">APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation.</a> PLoS ONE. 5, e11866 (2010).</li><li>Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+APP+intracellular+domain+in+brain+tissue.">Detection of APP intracellular domain in brain tissue.</a> Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).</li><li>Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chaperone+function+using+citrate+synthase+as+nonnative+substrate+protein.">Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein.</a> Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).</li><li>Hansma, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+atomic+force+microscopy+of+DNA.">Recent advances in atomic force microscopy of DNA.</a> Scanning. 15, 296-299 (1993).</li><li>Valbuena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasi-simultaneous+imaging/pulling+analysis+of+single+polyprotein+molecules+by+atomic+force+microscopy.">Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).</li><li>Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction,+purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+human+Fe65-PTB2+in+complex+with+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain.">Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain.</a> Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).</li><li>Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein+interacts+with+flotillin-1,+a+lipid+raft+protein.">The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).</li><li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Notch1+signaling+by+the+APP+intracellular+domain+facilitates+degradation+of+the+Notch1+intracellular+domain+and+RBP-Jk.">Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk.</a> J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).</li><li>Lazarov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport,+amyloid+precursor+protein,+kinesin-1,+and+the+processing+apparatus:+revisited.">Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited.</a> J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).</li><li>Kakuda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equimolar+production+of+amyloid+beta-protein+and+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+from+beta-carboxyl-terminal+fragment+by+gamma-secretase.">Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase.</a> J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).</li><li>Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+under+the+atomic+force+microscope.">Amyloid under the atomic force microscope.</a> Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في هذا البروتوكول وقد أوجزنا في إجراءات الحصول على AICD نقية للغاية لتحليل الهيكلية، الفيزياء الحيوية، والكيمياء الحيوية. هذا الإجراء لا يتطلب معدات متطورة اللوني، وبالتالي الوصول إلى معظم المختبرات. طهروا مجموعات أخرى AICD 5-7،16، بما في ذلك GST-AICD 17-19، لتحالي?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> pGEX-4T-1 </td><td> GE للرعاية الصحية </td><td> 28-9545-49 </td><td></td></tr><tr><td> ثرومبين </td><td> GE للرعاية الصحية </td><td> 27-0846-01 </td><td></td></tr><tr><td> الأمبيسلين </td><td> فيشر العلمية </td><td> BP1760 </td><td></td></tr><tr><td> برادفورد كاشف البروتين مقايسة </td><td> بيو راد </td><td> 500-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Coomassie الزرقاء </td><td> بيو راد </td><td> 161-0786 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (الآيزوبروبيل بيتا-D thiogalactopyranoside) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> I6758 </td><td></td></tr><tr><td> الجلوتاثيون-الاغاروز </td><td> سيغما الدريخ </td><td> G4510 </td><td></td></tr><tص&gt; <td> ف aminobenzamidine-الاغاروز </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A7155 </td><td></td></tr><tr><td> كوكتيل كاملة البروتيني المثبط </td><td> روش </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> أشرطة غسيل الكلى الشريحة-A-Lyzer </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 66380 </td><td></td></tr><tr><td> اللوني الأعمدة </td><td> دائمة الخضرة العلمية </td><td> 208-3367-050 </td><td></td></tr><tr><td> مستحلب </td><td> Avestin، وشركة </td><td> EmulsiFlex-C3 </td><td> يوصى بشدة </td></tr><tr><td> إيبندورف Thermomixer </td><td> إيبندورف </td><td> 022670107 </td><td></td></tr><tr><td> أقراص الميكا </td><td> تيد بيلا </td><td> 50-12 </td><td></td></tr><tr><td> الكابولي AFM </td><td> بروكر </td><td> MSNL-10 </td><td></td></tr><tr><td> WSxM البرمجيات </td><td> NANOTEC </td><td> N / A </td><td> FRه ه التحميل </td></tr></tbody></table>

purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain

اميلويد السلائف البروتين (APP) هو نوع من البروتين عبر الغشاء I المرتبطة التسبب في مرض الزهايمر (AD). ويتميز APP بواسطة ملك خارج الخلية الكبيرة ومجال عصاري خلوي يسمى قصيرة المجال APP داخل الخلايا (AICD). خلال النضج من خلال مسار إفرازية، يمكن المشقوق APP بواسطة البروتياز وصف α، β، γ-secretases و1. انشقاق بروتين متسلسلة من APP مع β γ وsecretases-يؤدي إلى إنتاج بروتين الببتيد الصغيرة، ووصف Aβ، وهو amyloidogenic والمكونة الأساسية لويحات خرف. وAICD أيضا تتحرر من الغشاء بعد تجهيز secretase، ومن خلال التفاعل مع Fe65 وTip60، يمكن نقل من لنواة للمشاركة في تنظيم النسخ من الجينات المستهدفة متعددة 2،3. قد البروتين البروتين التفاعلات التي تنطوي على الاتجار تؤثر AICD، وتجهيز، والوظائف الخلوية من هولو-APP والخمسين C-ترمنشظايا آل. لقد أظهرنا مؤخرا التي يمكن الإجمالية في المختبر، وهذه العملية يتم من قبل AICD تحول دون ubiquilin-1 AD-المتورطين كوصي الجزيئية 4. بما يتفق مع هذه النتائج، AICD كشفت المجالات مسعور والمختلين جوهريا في المختبر 5،6، ومع ذلك فإنه يحصل هيكل مستقر الثانوية عندما يتجهون إلى Fe65 7. وقد اقترحنا أن ubiquilin-1 يمنع غير لائق التفاعلات بين وداخل الجزيء من AICD، ومنع تجميع في المختبر وخلايا سليمة في 4. في حين أن معظم الدراسات تركز على دور APP في التسبب في AD، ودور AICD في هذه العملية ليست واضحة. وقد تبين من التعبير للحث على موت الخلايا المبرمج AICD 8، لتعديل مسارات إشارات 9، وتنظيم الكالسيوم مما يشير 10. الإفراط في التعبير عن AICD وFe65 في نموذج الفأر المعدلة وراثيا يؤدي مثل علم الأمراض مرض الزهايمر 11، ومؤخرا تم الكشف عن AICD في البرازيللست] في غرب النشاف من قبل عند استخدام التقنيات المناسبة استرجاع مستضد 12. لتسهيل الدراسات الهيكلية، والكيمياء الحيوية، الفيزياء الحيوية وللAICD، وقد وضعنا الداخلي لإنتاج كميات كبيرة من البروتين recombinantly AICD نقية للغاية. وصفنا طريقة أخرى لإحداث التجميع في المختبر الحراري للAICD والتحليل المجهري القوة الذرية. الأساليب المذكورة مفيدة لتوصيف الكيمياء الحيوية، والفيزياء الحيوية، والهيكلية للAICD وآثار المحرمين الجزيئية على تجميع AICD.

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain at JoVE.com

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

ووصف طريقة لتنقية واسعة النطاق للمجال APP داخل الخلايا (AICD). وصفنا أيضا منهجية للحث<em&gt; في المختبر</em&gt; AICD التجميع والتصور بواسطة المجهر القوة الذرية. الأساليب المذكورة مفيدة لتوصيف البيوكيميائية / الهيكلية للAICD وآثار المحرمين الجزيئية على تجميع لها.

تنقية وتجميع على البروتين اميلويد السلائف المجال بين الخلايا

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

purification-aggregation-amyloid-precursor-protein-intracellular

Research

JoVE Journal

Medicine

11.7K Views.  University of Texas Medical Branch. ووصف طريقة لتنقية واسعة النطاق للمجال APP داخل الخلايا (AICD). وصفنا أيضا منهجية للحث في المختبر AICD التجميع والتصور بواسطة المجهر القوة الذرية. الأساليب المذكورة مفيدة لتوصيف البيوكيميائية / الهيكلية للAICD وآثار المحرمين الجزيئية على تجميع لها.

Video: Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis. Since the clinical presentation of this disease is so variable and non-specific, the associated risks of these biopsies are too great for the diagnostic yield. Other sites that have a lower biopsy risk, such as skin or gingival, are also relatively invasive and expensive. In addition, these biopsies may not always have sufficient amyloid deposits to establish a diagnosis. Fat pad aspiration has demonstrated good clinical correlation with low cost and minimal morbidity. However, there are no standardized protocols for performing this procedure or processing the aspirated specimen, which leads to variable and nonreproducible results. The most frequently utilized modality for detecting amyloid in tissue is an apple-green birefringence on Congo red stained sections using a polarizing microscope. This technique requires cell block preparation of aspirated material. Unfortunately, patients presenting in early stage of amyloidosis have minimal amounts of amyloid which greatly reduces the sensitivity of Congo red stained cell block sections of fat pad aspirates. Therefore, ultrastructural evaluation of fat pad aspirates by electron microscopy should be utilized, given its increased sensitivity for amyloid detection. This article demonstrates a simple and reproducible procedure for performing anterior fat pad aspiration for the detection of amyloid utilizing both Congo red staining of cell block sections and electron microscopy for ultrastructural identification.

Fat pad aspiration is a preferred, minimally invasive, and low cost approach as compared to other methods to detect amyloid for diagnosis of systemic amyloidosis. This video article demonstrates a procedural outline for performing fat pad aspiration with appropriate processing of the specimen for the optimal diagnostic outcome.

الأداء ومعالجة FNA من الدهون الأمامية لوحة اميلويد

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

المؤشرات الحيوية في نموذج حيواني لكشف الاقتران العصبية، الدموية، والسلوكية للPTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability in industrialized countries. Replacement of degenerated photoreceptors by cell transplantation represents a possible treatment option in future clinical applications. Indeed, recent preclinical studies demonstrated that immature photoreceptors, isolated from the neonatal mouse retina at postnatal day 4, have the potential to integrate into the adult mouse retina following subretinal transplantation. Donor cells generated a mature photoreceptor morphology including inner and outer segments, a round cell body located at the outer nuclear layer, and synaptic terminals in close proximity to endogenous bipolar cells. Indeed, recent reports demonstrated that donor photoreceptors functionally integrate into the neural circuitry of host mice. For a future clinical application of such cell replacement approach, purified suspensions of the cells of choice have to be generated and placed at the correct position for proper integration into the eye. For the enrichment of photoreceptor precursors, sorting should be based on specific cell surface antigens to avoid genetic reporter modification of donor cells. Here we show magnetic-associated cell sorting (MACS) - enrichment of transplantable rod photoreceptor precursors isolated from the neonatal retina of photoreceptor-specific reporter mice based on the cell surface marker CD73. Incubation with anti-CD73 antibodies followed by micro-bead conjugated secondary antibodies allowed the enrichment of rod photoreceptor precursors by MACS to approximately 90%. In comparison to flow cytometry, MACS has the advantage that it can be easier applied to GMP standards and that high amounts of cells can be sorted in relative short time periods. Injection of enriched cell suspensions into the subretinal space of adult wild-type mice resulted in a 3-fold higher integration rate compared to unsorted cell suspensions.

Cell transplantation represents a strategy for the treatment of retinal degeneration characterized by photoreceptor loss. Here we describe a method for enrichment of transplantable photoreceptors and their subretinal grafting into adult mice.

زرع تحت الشبكية من MACS تنقية الخلايا السلائف مستقبلات ضوئية في شبكية العين الماوس الكبار

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. Clinically, more than 50% of SCI affect the cervical spine1. As a consequence of the primary injury, a cascade of secondary mechanisms including inflammation, apoptosis, and demyelination occur finally leading to tissue scarring and development of intramedullary cavities2,3. Both represent physical and chemical barriers to cell transplantation, integration, and regeneration. Therefore, shaping the inhibitory environment and bridging cavities to create a supportive milieu for cell transplantation and regeneration is a promising therapeutic target4. Here, a contusion/compression model of cervical SCI using an aneurysm clip is described. This model is more clinically relevant than other experimental models, since complete transection or ruptures of the cord are rare. Also in comparison to the weight drop model, which in particular damage the dorsum columns, circumferential compression of the spinal cord appears advantageous. Clip closing force and duration can be adjusted to achieve different injury severity. A ring spring facilitates precise calibration and constancy of clip force. Under physiological conditions, synthetic self-assembling peptides (SAP) self-assemble into nanofibers and thus, are appealing for application in SCI5. They can be injected directly into the lesion minimizing damage to the cord. SAPs are biocompatible structures erecting scaffolds to bridge intramedullary cavities and thus, equip the damaged cord for regenerative treatments. K2(QL)6K2 (QL6) is a novel SAP introduced by Dong et al.6 In comparison to other peptides, QL6 self-assembles into &#946;-sheets at neutral pH6.14 days after SCI, after the acute stage, SAPs are injected into the center of the lesion and neural precursor cells (NPC) are injected into adjacent dorsal columns. In order to support cell survival, transplantation is combined with continuous subdural administration of growth factors by osmotic micro pumps for 7 days.

Treating cervical spinal cord injury with both self-assembling peptides (SAP) and neural precursor cells (NPC), together with growth factors, is a promising approach to promote regeneration and recovery. A contusion/compression aneurysm clip rat model of cervical SCI and combined treatment involving SAP injection and NPC transplantation is established.

استخدام التآزر من الخلايا العصبية السلائف والببتيدات الذاتي تجميع في التجريبية عنق الرحم إصابة الحبل الشوكي

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. ...

Assessment of Spontaneous Alternation, Novel Object Recognition and Limb Clasping in Transgenic Mouse Models of Amyloid-&#946; and Tau Neuropathology

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional motor behaviors in transgenic mouse models of &#946;-amyloidosis and tauopathy. The paradigm includes tests for spontaneous alternation in a Y-maze, novel object recognition, and limb clasping. These tests were selected because they: 1) interrogate function of cognitive or motor domains and the correlate neural circuitry relevant to the human disease state, 2) have clearly defined endpoints, 3) have easily implementable quality control checks, 4) can be run in a moderate throughput format, and 5) require little intervention by the investigator. These methods are designed for investigators looking to screen compounds for activity in short-term and working memory tasks, or functional motor behaviors associated with Alzheimer's disease mouse models. The methods described here use behavioral tests that engage a number of different brain regions including hippocampus and various cortical areas. Investigators that desire cognitive tests that specifically assess cognition mediated by a single brain region could use these techniques to supplement other behavioral tests.

Assessment of Spontaneous Alternation, Novel Object Recognition and Limb Clasping in Transgenic Mouse Models of Amyloid-&amp;#946; and Tau Neuropathology

Described here is a staged, behavioral screening approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional motor behaviors in transgenic mouse models of &#946;-amyloidosis and tauopathy. These methods are optimized to screen compounds for activity in short-term and working memory tasks.

تقييم التناوب العفوي، التعرف على الكائن الرواية وتسلسل الأطراف في الماوس المعدلة وراثيا نماذج من اميلويد β وتاور الاعتلال العصبي

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional ...

Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or in buffer (washed platelets), by the use of one or a combination of agonists. The use of washed platelets separated from their plasma environment and in the absence of anticoagulants allows for studying intrinsic platelet properties. Among the large panel of agonists, arachidonic acid (AA), adenosine di-phosphate (ADP), thrombin and collagen are the most frequently used. The aggregation response is quantified by measuring the relative optical density (OD) over time of platelet suspension under continuous stirring. Platelets in homogeneous suspension limit the passage of light after the addition of an agonist, platelet shape change occurs producing a small transitory increase in OD. Following this initial activation step, platelet clots form gradually, allowing the passage of light through the suspension as a result of decreased OD. The aggregation process is ultimately expressed as a percentage, compared to the OD of platelet-poor plasma or buffer. Rigorous calibration is thus essential at the beginning of each experiment. As a general rule: calibration to 0% is set by measuring the OD of a non-stimulated platelet suspension while measuring the OD of the suspension medium containing no platelets represents a value of 100%. Platelet aggregation is generally visualized as a real-time aggregation curve. Turbidimetry is one of the most commonly used laboratory techniques for the investigation of platelet function and is considered as the historical gold standard and used for the development of new pharmaceutical agents aimed at inhibiting platelet aggregation. Here, we describe detailed protocols for 1) preparation of human washed platelets and 2) turbidimetric analysis of collagen-induced aggregation of human washed platelets pretreated with the food dye Brilliant Blue FCF that was recently identified as an inhibitor of Pannexin1 (Panx1) channels.

We describe a straightforward method for the isolation of washed platelets from human blood followed by agonist-induced platelet aggregation measurements by turbidimetry. As an example we apply this method for studying the aggregation response of human platelets to collagen after a pre-incubation with the Pannexin1 channel inhibitor Brilliant Blue FCF.

قياس العكر غسلها لحقوق الإنسان الصفائح الدموية: تأثير من Pannexin1 المانع الزرقاء الرائعة FCF على تجميع الناجمة الكولاجين،

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum (SR) serves as a Ca2+ reservoir for contraction, which reuptakes intracellular Ca2+ during relaxation. The SR Ca2+ reserve available for beats is determinate for cardiac contractibility, and the removal of intracellular Ca2+ is critical for cardiac diastolic function. Under some pathophysiological conditions, such as diabetes and heart failure, impaired calcium clearance and SR Ca2+ store in cardiomyocytes may be involved in the progress of cardiac dysfunction. Here, we describe a protocol to evaluate SRCa2+ reserve and diastolic Ca2+ removal. Briefly, a single cardiomyocyte was enzymatically isolated, and the intracellular Ca2+ fluorescence indicated by Fura-2 was recorded by a calcium imaging system. To employ caffeine for inducing total SR Ca2+ release, we preset an automatic perfusion switch program by interlinking the stimulation system and the perfusion system. Then, the mono-exponential curve fitting was used for analyzing decay time constants of calcium transients and caffeine-induced calcium pulses. Accordingly, the contribution of the SR Ca2+-ATPase (SERCA) and Na+-Ca2+ exchanger (NCX) to diastolic calcium removal was evaluated.

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Here, we describe a protocol to evaluate sarcoplasmic reticulum Ca2+ reserve and diastolic calcium removal function in cardiomyocytes by a calcium imaging system.

تقييم الشبكة شبكية الكالسيوم إزالة الكالسيوم االنبساطي الاحتياطي وداخل الخلايا في Cardiomyocytes البطين المعزولة

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

في فيفو التصوير من "الفئران مراسل" Cx3cr1التجارة والنقل/التجارة والنقل مع المجالات الطيفية الضوئية التماسك التصوير المقطعي وفحص تنظير العين الليزر

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier integrity. However, their tissue-specific functions in the heart are not well understood. Moreover, there is currently no protocol utilizing readily accessible materials to isolate and purify pericytes of cardiac origin. Our protocol focuses on using the widely used mammalian model, the mouse, as our source of cells. Using the enzymatic digestion and mechanical dissociation of heart tissue, we obtained a crude cell mixture that was further purified by fluorescence activating cell sorting (FACS) by a plethora of markers. Because there is no single unequivocal marker for pericytes, we gated for cells that were CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Following purification, these primary cells were cultured and passaged multiple times without any changes in morphology and marker expression. With the ability to regularly obtain primary murine cardiac pericytes using our protocol, we hope to further understand the role of pericytes in cardiovascular physiology and their therapeutic potential.

We have optimized a protocol to isolate and purify murine cardiac pericytes for basic research and investigation of their biology and therapeutic potential.

عزل وتنقية البيريكيتالقلبي ة المورين

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

العزل القائم على الطرد المركزي للحويصلات خارج الخلية من ADSCs البشرية

Purification and Characterization of Extracellular Vesicles from Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research suggests that their regenerative function may be attributed to cell-cell contact and cell paracrine effects. The paracrine effect is an important way for cells to interact and transfer information over short distances, in which extracellular vesicles (EVs) play a functional role as carriers. There is significant potential for ADSC EVs in regenerative medicine. Multiple studies have reported on the effectiveness of these methods. Various methods for extracting and isolating EVs are currently described based on principles such as centrifugation, precipitation, molecular size, affinity, and microfluidics. Ultracentrifugation is regarded as the gold standard for isolating EVs. Nevertheless, a meticulous protocol to highlight precautions during ultracentrifugation is still absent. This study presents the methodology and crucial steps involved in ADSC culture, supernatant collection, and EV ultracentrifugation. However, even though ultracentrifugation is cost-effective and requires no further treatment, there are still some inevitable drawbacks, such as a low recovery rate and EV aggregation.

تسليط الضوء على المؤلف: توحيد وتحسين استخراج وتنقية الحويصلات خارج الخلية من ADSCs البشرية

This protocol describes all procedures, from culturing human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) and collecting supernatant to extracting extracellular vesicles (EVs) using ultracentrifugation.

تنقية وتوصيف الحويصلات خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون البشرية

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research ...