This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.

1. خلية الطلاء وترنسفكأيشن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غطاء ثقافة الخلية، لوحة ~ 300،000 إلى ~ 500،000 SN56 الخلايا (هدية عينية من الدكتور جين Rylett) على الزجاج السفلي 35 مم طبق متحد البؤر، وتغطي مع وسائل الإعلام قبل ترنسفكأيشن (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة، DMEM، على أن تستكمل مع 10٪ FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة لتتكاثر. ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا ما يقرب من 50٪ -70٪ متموجة قبل ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غطاء ثقافة الخلية، وخلايا transfect مع البلازميدات معربا عن بروتين فلوري الموسومة TGN علامة (Galactosyl ترانسفيراز بالإضافة إلى سماوي نيون البروتين، جالت-CFP)، الموسومة بروتين فلوري مقصورة علامة (هنا، يحلول يرتبط البروتين غشاء 1، LAMP1، الموسومة ب mRFP)، والبروتين من الفائدة الموسومة ب paGFP (βAPP-paGFP). (سبق وصف هذه بنيات 30) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا مع كاشف ترنسفكأيشن وDNA البلازميد وأو 24 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة. استخدام نسبة ~ 2 ميكروغرام من الحمض النووي ل5 ميكرولتر من وكيل ترنسفكأيشن (على سبيل المثال Lipofectamine 2000) لأفضل السمية الخلوية التوازن والكفاءة ترنسفكأيشن. قد تحتاج تركيزات الفعلية ليكون الأمثل لالبلازميدات مختلفة. في التجارب الموصوفة هنا، استخدم 1 ميكروغرام / طبق متحد البؤر من βAPP-paGFP، 0.3 ميكروغرام / طبق متحد البؤر من LAMP1-mRFP، و 0.2 ميكروغرام / طبق متحد البؤر من جالت-CFP. ملاحظة: إن كمية البلازميد المستخدمة تعتمد على كفاءة ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لخطوط الخلايا العصبية: بعد الخطوة 1.4، في غطاء ثقافة الخلية، وإزالة وسائل الاعلام قبل ترنسفكأيشن وتفرق خلايا SN56 في 2 مل DMEM تستكمل مع 0.1٪ البنسلين / الستربتومايسين مع 1 ملي dibutyryl AMP الحلقي (dbcAMP) لمدة 24 ساعة. </li></ol> 2. مجهر مرحلة الإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الدافئة المالحة الفوسفات مخزنة (PBS) ومحلول الملح المتوازن هانك (HBSS) إلى 37 درجة مئوية. الاحماء مرحلة المجهر قبل imagiنانوغرام إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، لإزالة وسائل الإعلام التمايز ويحل مع 2 مل من HBSS في 37 ° C. خلايا المكان على خشبة المسرح المجهر تحسنت إلى 37 درجة مئوية. ملاحظة: خلايا قابلة للتطبيق لحوالي 1،5-2 ساعة في HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح 5-10 دقيقة لدرجة الحرارة لوحة مبائر لكي تتوازن مع المرحلة المجهر. </li></ol> 3. صور-تفعيل رويس خلال جولجي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع العدسة المجهر، والعثور على الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع جالت-CFP، LAMP1-mRFP، وβAPP-paGFP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام عدسة النفط الغمر مع تضخم عالية (أي 63X أو 100X). لالتشكل البصري مضان، استخدام عامل تصفية مجموعة قادرة على تصور FITC (لCFP وGFP مضان) ورودامين (لmRFP مضان). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين شريحة مبائر لكل قناة إلى 1 ميكرون. اتخاذ المنخفض دقة وضوح الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المحاصيل لصورة فقط من الخلايا في المصالح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقبض تعديل، تعيين يدوياطائرة الوصل إلى وسط الخلية. هذا هو عادة جزء من الخلية حيث النواة هي الأكبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم 3-5 المناطق دائرية من اهتمامات (رويس) داخل TGN (جالت-CFP مضان). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم رويس (أي في برنامج زايس LSM)، حدد زر &quot;تحرير ROI&quot; في وحدة القيادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد زر ROI دائري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر واسحب على جالت-CFP المناطق إيجابية للخلية. ملاحظة: حزم الصور وتبييض للعديد من المجاهر لديها هذه القدرة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صورة للخلية مع رويس مضافين. حفظ نسخة من رويس كمرجع لاحق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحفظ رويس إلى صورة، حدد زر &quot;ماكرو&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على زر &#39;تحميل&#39; لبدء &quot;CopyRoisToOverlay &#39;(مسار الملف: ج: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb). ملاحظة: A المجهر متحد البؤر مجهزة 475-525 نانومتر (CFP) الفرقة تمرير (BP)، و500-530 نانومتر BP (GFP)،وهناك حاجة إلى 560 نانومتر تمريرة طويلة (LP) مجموعات التصفية. مطلوب أيضا ليزر الأرجون ل458 نانومتر و 488 نانومتر، وانبعاث الليزر الحنة لانبعاث 540 نانومتر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء المجهر لدورة الوقت التبييض. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين يزر ديود (25 ميغاواط 405 نانومتر ليزر) لأقصى قدر من السلطة. تحذير: الإفراط في الصورة التنشيط يمكن أن يؤدي إلى الصور سمية أو أضرار في الأغشية الخلوية. استخدام حماية العين لتجنب الضرر في شبكية العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء المجهر لمدة 120 دورات التصوير. ملاحظة: تتكون دورة التصوير واحد من التبييض داخل رويس والتصوير من الخلية بأكملها. هذه هي دورة الوقت التبييض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين المجهر لتبييض (الصورة تنشيط) فقط رويس لمدة 20-30 التكرار بعد كل صورة. الوقت للصورة والتبييض سوف تتفاوت صورة. تعيين تأخير الوقت بين الصور لذلك كل دورة حوالي 30 ثانية. ملاحظة: جزء من كل دورة التصوير يستغرق حوالي 15-30 ثانية اعتمادا على حجم الصورة. تبيض لكل ROI حوالي 50 مللي ثانية. سوف تبيض جميع رويس 4 لمدة 20 التكرار يأخذ 4 ثانية في نهاية كل دورة التبييض / صورة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء دوام التبييض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف تبيض بعد 15 دقيقة (30 دورات التصوير وتبيض)، ولكن متابعة التقاط الصور للخلية. ملاحظة: الوقت 0-15 دقيقة هو &#39;نبض&#39; الفترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متابعة التقاط الصور لمدة 45 دقيقة (بدون تبيض)، لمتابعة إزالة βAPP-paGFP. ملاحظة: الوقت 15-45 دقيقة هي الفترة &quot;مطاردة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام أسلوب التحليل هو موضح في الخطوة 6، وشارك في توطين البروتين من الفائدة (هنا، βAPP-paGFP) مع مقصورة الفائدة (هنا، LAMP1-mRFP) بجعل أسطح لكل قناة. </li></ol> 4. تحديد حجرة المصب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد ما إذا الجسيمات الحالة (في هذه التجارب) هي مقصورة النهائية، إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني، نفاذية الغشاء لتسبب بروتينات لتتراكم في يحلول.<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لβAPP، استخدم 0.5 ميكرومتر L685، 458 (محدد γ-secretase المانع) بين عشية وضحاها أو 100 ميكرومتر الكلوروكين (deacidifies الجسيمات الحالة) لمدة 30 دقيقة قبل التصوير. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البحث عن الخلايا وphotoactivate كما في الخطوة 3،1-3،8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة الخلية لعدد إضافي من 45 مين (بدون صورة التنشيط) لتحديد حيث يتراكم βAPP-paGFP في غياب الانقسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل إيصال البروتين إلى الجسيمات الحالة (أو غيرها من مقصورة المصب) وإزالة لاحقة وفقا للطريقة هو موضح في الخطوة 6. </li></ol> 5. ضمان دقة صور التنشيط داخل جولجي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاحماء HBSS إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول 2 مل، لكل لوحة مبائر للتصوير، من 66 ميكرومتر نوكودازول (العلاج) أو DMSO (مراقبة) في HBSS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة واحدة مبائر، ماصة 2 مل من 37 درجة مئوية HBSS وإضافة 7.96 ميكرولتر من نوكودازول من 16.60 ملي الأسهم نوكودازول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كعنصر تحكم ذلكlution، ماصة 2 مل من 37 درجة مئوية HBSS في أنبوب 2 مل وإضافة 7.96 ميكرولتر من DMSO. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في HBSS مع نوكودازول أو DMSO لمدة 5 دقائق قبل التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البحث عن الخلايا كما في الخطوة 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تنشيط ضوئي، وإعداد المجهر لاتخاذ Z كومة بعد فترة الصور التنشيط. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على زر &quot;Z المكدس&quot;. بدء المسح الضوئي باستخدام XY سريع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط البؤري مع مقبض تعديل المجهر إلى أعلى الخلية. &#39;مارك الأول &quot;اضغط لتعيين المركز الأول في المكدس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط البؤري مع مقبض تعديل المجهر لأسفل (الأقرب إلى الزجاج) للخلية. اضغط على &quot;مارك آخر&quot; لتحديد المركز الأخير في المكدس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في لوحة كومة Z، اضغط على &quot;Z باجتزاء &#39;زر. تعيين &quot;الفاصل الزمني&quot; إلى 1 ميكرون. ملاحظة: للحصول على أعلى المكاني القرار كومة كومة فاصل زمني أصغر، ولكن سوف تحتاج إلى مزيد من الصورتؤخذ إطالة فترة التصوير لالمكدس. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبييض الخلايا، كما هو موضح في الخطوة 3،7-3،8. صور تنشيط وصورة من 0 دقيقة إلى 15 دقيقة (30 إطارات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توقف التصوير بعد 30 الإطارات. حفظ فورا صورة من شريط الفيديو. تحذير: بعض المجاهر قد الكتابة الفيديو الأول إذا لم يتم حفظها قبل البدء في تسلسل التصوير الثاني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حفظ الفيديو، والحصول على الفور Z كومة، وذلك باستخدام المعلمات من الخطوة 5.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شارك في توطين βAPP-paGFP مع جالت-CFP (أو غيرها من علامة جولجي)، كما هو موضح في الخطوة 6. ملاحظة: CFP photobleaches بسرعة وقد لا تكون واضحة قبل نهاية فترة التصوير. قد لا تكون Colocalization ممكن مع جالت-CFP. إذا كنت بحاجة colocalization، استخدم mRFP لعلامة جالت. </li></ol> 6. الحويصلة تصفية وColocalization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام برنامج تحليل (على سبيل المثال Imaris) لجعل أسطح المقصورة (على سبيل المثال LAMP1-mRFP) وبروتين سالفائدة و (على سبيل المثال βAPP-paGFP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدخل قسم &quot;تفوق&quot; من برنامج تحليل بالضغط على زر تفوق على شريط القائمة العلوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد زر المعالج السطح في الجزء العلوي من معظم اللوحة اليسرى (5 زر عشر من اليسار). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار قناة لتصفية حويصلات (أي βAPP-paGFP مضان، والبروتين من الفائدة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء الطرح الخلفية عن طريق تقديم قطر من أكبر حويصلة في الميدان لالمعالج واضغط التالي. برنامج تحليل تختار تلقائيا - بناء على عتبة المستمدة من أكبر حويصلة في الميدان - منطقة في القناة المثيرة للاهتمام. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط يدويا الخلفية عتبة لصقل التحديد إذا لزم الأمر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الجزء السفلي من الشاشة اختيار عتبة، والتحقق من خيار &quot;كائنات لمس تقسيم&quot; للفصل بين السطوح مجتمعة. ملاحظة: إذا تم تجميع العديد من الحويصلات ارتباطا وثيقانوى، إرادة مجموعة برامج تحليل هذه الكائنات تحت سطح واحد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار 10-15 الحويصلات التمثيلية وحساب متوسط ​​قطر الحويصلة وأدخل إلى المعالج. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد النقاط البذور المختارة عن طريق زيادة أو خفض عتبة على &#39;الجودة&#39; (شدة القناة في منتصف كل بقعة). سيتم إنشاء السطوح للقناة من الفائدة: ملاحظة. مزيد من صقل الأسطح المحدد يمكن أن يؤديها في هذه المرحلة. الحويصلات عتبة استنادا إلى عدد من وحدات البكسل في كل حويصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قناع القناة الأصلية مع هذا السطح. لإخفاء، حدد علامة التبويب 4TH من الناحية اليسرى في معالج إنشاء السطحية (قلم رصاص). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر &#39;قناع جميع &quot;. وسيتم إنشاء قناة جديدة مع الحويصلات من الفائدة. ملاحظة: أثناء عملية قناع، وتقدم خيارا لتكرار قناة الأصلي. حدد هذا الخيار إذا كان يحتاج البيانات الأصلية ليتم حفظها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الصورةteps 6.1 خلال 6.7 للقناة التي لم تتم تصفيتها (أي LAMP1 mRFP، المقصورة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في شريط الأدوات العلوي، حدد أداة colocalization. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اللوحة العلوية، كما تظهر رسوم بيانية للقنوات أن colocalized، اختيار القنوات المقنعة التي أنشئت مؤخرا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد كافة البيانات المتاحة. هناك بكسل السوداء التي عادة ما تكون موجودة بعد التحليل. لم تقم بتحديد هذه بكسل في الرسم البياني، وأنها سوف تؤثر على النتائج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في لوحة اليمين المتطرف، اختر &#39;بناء قناة Coloc. وهذا يخلق قناة جديدة تحتوي فقط بكسل colocalized. سوف تكون البيانات في نفس لوحة تحت زر &quot;الاحصائيات القناة. البيانات يمكن تصديرها كملف CSV.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الإحصائية &quot;النسبة المئوية للمواد colocalized. يأخذ هذا الخيار في الاعتبار كثافة بكسل وحجم الكائن. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Masters, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+plaque+core+protein+in+Alzheimer+disease+and+Down+syndrome.">Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (12), 4245-4249 (1985).</li><li>Vassar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-secretase+cleavage+of+Alzheimer's+amyloid+precursor+protein+by+the+transmembrane+aspartic+protease+BACE.">Beta-secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE.</a> Science. 286 (5440), 735-741 (1999).</li><li>De Strooper, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+presenilin-1+inhibits+the+normal+cleavage+of+amyloid+precursor+protein.">Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein.</a> Nature. 391 (6665), 387-390 (1998).</li><li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+complexes+with+the+C-terminal+fragments+of+amyloid+precursor+protein+at+the+sites+of+amyloid+beta-protein+generation.">Presenilin complexes with the C-terminal fragments of amyloid precursor protein at the sites of amyloid beta-protein generation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (16), 9299-9304 (2000).</li><li>Li, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+1+is+linked+with+gamma-secretase+activity+in+the+detergent+solubilized+state.">Presenilin 1 is linked with gamma-secretase activity in the detergent solubilized state.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (11), 6138-6143 (2000).</li><li>Kim, W., Hecht, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+determinants+of+enhanced+amyloidogenicity+of+Alzheimer+A{beta}42+peptide+relative+to+A{beta}40.">Sequence determinants of enhanced amyloidogenicity of Alzheimer A{beta}42 peptide relative to A{beta}40.</a> J. Biol. Chem. 280 (41), 35069-35076 (2005).</li><li>Pawar, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+'aggregation-prone'+and+"aggregation-susceptible.">Prediction of 'aggregation-prone' and "aggregation-susceptible.</a> J. Mol. Biol. 350 (2), 379-392 (2005).</li><li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VPS35+haploinsufficiency+increases+Alzheimer's+disease+neuropathology.">VPS35 haploinsufficiency increases Alzheimer's disease neuropathology.</a> J. Cell Biol. 195 (5), 765-779 (2011).</li><li>Rogaeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuronal+sortilin-related+receptor+SORL1+is+genetically+associated+with+Alzheimer+disease.">The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease.</a> Nat. Genet. 39 (2), 168-177 (2007).</li><li>Andersen, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+sorting+protein-related+receptor+sorLA/LR11+regulates+processing+of+the+amyloid+precursor+protein.">Neuronal sorting protein-related receptor sorLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (38), 13461-13466 (2005).</li><li>Schmidt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SorLA/LR11+regulates+processing+of+amyloid+precursor+protein+via+interaction+with+adaptors+GGA+and+PACS-1.">SorLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1.</a> J. Biol. Chem. 282 (45), 32956-32964 (2007).</li><li>Moreth, J., Mavoungou, C., Schindowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+anti-amyloid+immunotherapy+in+Alzheimer's+disease:+What+are+the+most+promising+targets.">Passive anti-amyloid immunotherapy in Alzheimer's disease: What are the most promising targets.</a> Immun Ageing. 10 (1), 18 (2013).</li><li>Pasternak, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin-1,+nicastrin,+amyloid+precursor+protein,+and+gamma-secretase+activity+are+co-localized+in+the+lysosomal+membrane.">Presenilin-1, nicastrin, amyloid precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the lysosomal membrane.</a> J. Biol. Chem. 278 (29), 26687-26694 (2003).</li><li>Schrader-Fischer, G., Paganetti, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+alkalizing+agents+on+the+processing+of+the+beta-amyloid+precursor+protein.">Effect of alkalizing agents on the processing of the beta-amyloid precursor protein.</a> Brain Res. 716 (1-2), 91-100 (1996).</li><li>Golde, T., Estus, S., Younkin, L., Selkoe, D., Younkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+the+amyloid+protein+precursor+to+potentially+amyloidogenic+derivatives.">Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives.</a> Science. 255 (5045), 728-730 (1992).</li><li>Higaki, J., Quon, D., Zhong, Z., Cordell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+beta-amyloid+formation+identifies+proteolytic+precursors+and+subcellular+site+of+catabolism.">Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolytic precursors and subcellular site of catabolism.</a> Neuron. 14 (3), 651-659 (1995).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxyl-terminal+Fragments+of+Alzheimer+beta+-Amyloid+Precursor+Protein+Accumulate+in+Restricted+and+Unpredicted+Intracellular+Compartments+in+Presenilin+1-deficient+Cells.">Carboxyl-terminal Fragments of Alzheimer beta -Amyloid Precursor Protein Accumulate in Restricted and Unpredicted Intracellular Compartments in Presenilin 1-deficient Cells.</a> J. Biol. Chem. 275 (47), 36794-36802 (2000).</li><li>Perez, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+identifies+new+signals+for+beta-amyloid+precursor+protein+endocytosis,+turnover,+and+the+generation+of+secreted+fragments,+including+Abeta42.">Mutagenesis identifies new signals for beta-amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42.</a> J. Biol. Chem. 274 (27), 18851-18856 (1999).</li><li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+Is+Required+for+Synaptic+Activity-Dependent+Release+of+Amyloid-&#946;+In+Vivo.">Endocytosis Is Required for Synaptic Activity-Dependent Release of Amyloid-&#946; In Vivo.</a> Neuron. 58 (1), 42-51 (2008).</li><li>Carey, R. M., Balcz, B. A., Lopez-Coviella, I., Slack, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+dynamin-dependent+endocytosis+increases+shedding+of+the+amyloid+precursor+protein+ectodomain+and+reduces+generation+of+amyloid+beta+protein.">Inhibition of dynamin-dependent endocytosis increases shedding of the amyloid precursor protein ectodomain and reduces generation of amyloid beta protein.</a> BMC Cell Biol. 6, 30 (2005).</li><li>Traub, L. M., Kornfeld, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trans-Golgi+network:+a+late+secretory+sorting+station.">The trans-Golgi network: a late secretory sorting station.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 9 (4), 527-533 (1997).</li><li>Vieira, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieval+of+the+Alzheimer's+amyloid+precursor+protein+from+the+endosome+to+the+TGN+is+S655+phosphorylation+state-dependent+and+retromer-mediated.">Retrieval of the Alzheimer's amyloid precursor protein from the endosome to the TGN is S655 phosphorylation state-dependent and retromer-mediated.</a> Mol Neurodegener. 5 (1), 40 (2010).</li><li>Sullivan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer+disruption+promotes+amyloidogenic+APP+processing.">Retromer disruption promotes amyloidogenic APP processing.</a> Neurobiol. Dis. 43 (2), 338-3345 (2011).</li><li>Fjorback, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer+binds+the+FANSHY+sorting+motif+in+SorLA+to+regulate+amyloid+precursor+protein+sorting+and+processing.">Retromer binds the FANSHY sorting motif in SorLA to regulate amyloid precursor protein sorting and processing.</a> J. Neurosci. 32 (4), 1467-1480 (2012).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Photoactivatable+GFP+for+Selective+Photolabeling+of+Proteins+and+Cells.">A Photoactivatable GFP for Selective Photolabeling of Proteins and Cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+photolabeling+of+proteins+using+photoactivatable+GFP.">Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP.</a> Methods. 32 (4), 445-450 (2004).</li><li>Hirschberg, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+secretory+protein+traffic+and+characterization+of+golgi+to+plasma+membrane+transport+intermediates+in+living+cells.">Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells.</a> J. Cell Biol. 143 (6), 1485-1503 (1998).</li><li>Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+maintenance+of+mammalian+peroxisomes+involves+a+de+novo+PEX16-dependent+pathway+from+the+ER.">The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER.</a> J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).</li><li>Hailey, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+supply+membranes+for+autophagosome+biogenesis+during+starvation.">Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation.</a> Cell. 141 (4), 656-667 (2010).</li><li>Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyloid+Precursor+Protein+is+rapidly+transported+from+the+Golgi+apparatus+to+the+lysosome+and+where+it+is+processed+into+beta-amyloid.">The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid.</a> Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).</li><li>Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+logic+underlying+the+axonal+transport+of+cytosolic+proteins.">Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins.</a> Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).</li><li>Herl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+amyloid+precursor+protein+affect+its+interactions+with+presenilin/gamma-secretase.">Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase.</a> Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).</li><li>Lorenzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Direct+Transport+of+Cell+Surface+APP+to+the+Lysosome+defines+a+novel+selective+pathway.">Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway.</a> Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).</li><li>Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+'Swedish'+amyloid+precursor+protein+variant+in+neuro2a+(N2a)+cells.+Evidence+that+cleavage+at+the+beta-secretase";site+occurs+in+the+golgi+apparatus.">Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus.</a> J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).</li><li>Thinakaran, G., Koo, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+Precursor+Protein+Trafficking,+Processing,+and+Function.">Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function.</a> J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).</li><li>Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Activation+and+Excitation+Properties+of+PA-GFP+in+the+720-920-nm+Region.">Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region.</a> Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).</li><li>Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+export+of+the+vesicular+stomatitis+virus+G+protein+from+the+endoplasmic+reticulum+requires+a+signal+in+the+cytoplasmic+tail+that+includes+both+tyrosine-based+and+di-acidic.">Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic.</a> 11 (1), 13-22 (2000).</li><li>Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cleavage+products+of+amyloid-beta+precursor+protein+are+sorted+to+distinct+carrier+vesicles+that+are+independently+transported+within+neurites.">The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites.</a> J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم مصالح أو تضارب المصالح المالية المتنافسة.

توضح هذه التقنية على دقة الصور تفعيل بروتينات غشاء الموسومة ب paGFP في TGN لتصور الاتجار والانقسام لاحق. في حين تم إنشاء paGFP أكثر من عشر سنوات 25، وهذا هو المثال الأول من دقيق الصور تفعيل لمتابعة الاتجار البروتينات الوليدة إلى حجرات المصب. الدراسات السابقة باستخدام A...

السمة المميزة لمرض الزهايمر (AD) هي وجود لويحات خرف والتشابك الليفي العصبي (NFTS) في الدماغ. الرئيسية المكونة لويحات خرف هو بيتا اميلويد (Aβ). مشتق Aβ من السلائف. بروتين اميلويد السلائف (APP) 1. الانقسام amyloidogenic من APP يبدأ مع إزالة ectodomain من APP التي كتبها β-secretase 2. ما تبقى من 99 محطة بقايا الكربوكسيل جزء (CTF) يمكن المشقوق من قبل γ-secretase لإنتاج Aβ 3-7. بينما العديد من التجارب وقد وثقت الانقسام من سطح الخلية APP بعد استيعاب من سطح الخلية في نظام endosomal / الليزوزومية، وعدد من الدراسات الحديثة قد اقترح أن الاتجار داخل الخلايا APP مهم أيضا في تنظيم التجهيز لها 8-11. كان هناك عدد من محاولات تحوير مستويات Aβ مع مثبطات-γ secretase وAβ إمانotherapies. ومع ذلك، أظهرت التجارب السريرية الأخيرة مع هذه العلاجات لا فائدة، وفي بعض الحالات تسبب الضرر 12. استراتيجية غير المستغلة لتعديل إنتاج Aβ هو تغيير التعريب شبه الخلوية من APP والتفاعل γ secretase. كلها قد اقترح جولجي، غشاء البلازما، والإندوسومات / الجسيمات الحالة كما غات الممكنة لγ-انشقاق من APP. البحث عن المختبر لدينا تشير إلى أن APP وγ-secretase هي البروتينات المقيمة للغشاء الليزوزومية 13. وعلاوة على ذلك، وجدنا أن الليزوزومية γ-secretase لديه درجة الحموضة المثلى الحمضية 13. بالإضافة إلى ذلك، قلونة النظام endosomal / الليزوزومية مع الكلوروكين أو NH 4 الكلورين، وقد تبين أن ينخفض ​​إنتاج Aβ 14. جاما-secretase تثبيط أو بالضربة القاضية أو Presenilin يؤدي إلى تراكم APP-كتفس في يحلول 15-17. وعلاوة على ذلك، وتعطيل APP الإلتقام يخفض Aβ إنتاج 18-20. وعلى الرغم من أهمية جولجي كمحطة الفرز للبروتينات الوليدة والبروتينات المعاد تدويرها من النظام endosomal / الليزوزومية، لم يدرس الاتجار داخل الخلايا APP بالتفصيل 21. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة التي APP يمكن إعادة تدويرها إلى الشبكة العابرة للجولجي (TGN) عن طريق التفاعل مع مجمع retromer. تنظيم الأسفل من مجمع retromer ينخفض ​​إنتاج Aβ 8،22-24. ومع ذلك، فإن الخروج من APP من جولجي لم يتم دراستها جيدا. بينما بعد الإلتقام من البروتينات على سطح الخلية، مثل مستقبلات ترانسفيرين، وصفت بسهولة وتلت ذلك، في أعقاب الاتجار البروتينات داخل الخلايا هو أكثر تحديا. في الواقع، فإن القليل من البروتينات الاتجار بهم داخل الخلايا تصوير. وقد وفرت ظهور علامات بروتين فلوري، مثل الصورة activatable-GFP (paGFP)، وأدوات جديدة لدراسة الاتجار داخل الخلايا. الصور activatable-GFP هو شكل من أشكال GFP التي هي غير مرئية تقريبا بعد التوليف، ولكن تطور قوي الأخضر (GFP) مضان بعد أن تفعيلها من خلال 413 نانومتر ضوء الليزر وهذه إشارة غير مستقرة لعدة أيام 25،26. وقد استخدمت بنيات باستخدام paGFP للتدليل على الاتجار intralysosomal من البروتين الليزوزومية بروتين الغشاء 1 (LAMP1) 25، وتسليم سطح الخلية من إلتهاب الفم التقرحي الفيروسات البروتين السكري (VSVG، علامة على مسار إفرازية) 27، ودوران peroxisomes 28 وautophagosomes 29. من أجل تصور فرز APP من TGN في الخلايا الحية، قمنا بتصميم البلازميد معربا عن مشاركة 112 الأحماض الأمينية من APP بالإضافة إلى الصور activatable (paGFP) على C-محطة (المشار إليها باسم βAPP-paGFP) 30. لقد قمنا أيضا هذه التجارب مع كامل طول APP وحققت نتائج مماثلة؛ يتم استخدام بناء ΒAPP هنا لأنها توفر صورا أكثر إشراقا. نحن بعد ذلك الصور وتفعيل# 946؛ APP-paGFP فقط في TGN، كما رسمتها TGN علامة Galactosyltransferase (جالت). على الرغم من APP تم الموسومة ب paGFP لتصور النقل محواري السريع لAPP والتخليص من منطقة محيط بالنواة، وهذا هو اول دليل على الاتجار APP من احد المقصورة محددة بعناية ل11،31،32 آخر. هنا، علينا أن نظهر دقة الصورة التنشيط داخل TGN والخروج من APP إلى أقسام المصب والانقسام اللاحق والتخليص من الجسيمات الحالة 30. في دقيقة الصور التنشيط داخل جولجي ينطبق على نطاق واسع لأنظمة البروتين الأخرى.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom culture dishes&#160;</td>
			<td>Matek</td>
			<td>P-35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibutyrl cyclic AMP</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat in activated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Microscopy stage insert P</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempcontrol 37&#8211;2 digital 2-channel</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 63&#215; 1.4 numerical aperture oil immersion lens&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L685, 458&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565771</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholorquine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6628&#160;</td>
			<td>dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1404</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>with colocalization package&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging the intracellular trafficking of app with photoactivatable gfp

بيتا اميلويد (Aβ) هو المكون الرئيسي لويحات خرف وجدت في أدمغة مرضى الزهايمر. مشتق Aβ من انشقاق متتابعة من اميلويد السلائف البروتين (APP) من خلال β وγ-secretases. وعلى الرغم من أهمية Aβ إلى AD علم الأمراض، لا راسخة توطين التحت خلوية من هذه الانقسامات. العمل في مختبرنا وغيرها توريط النظام endosomal / الليزوزومية في معالجة APP بعد استيعاب من سطح الخلية. ومع ذلك، فإن الاتجار داخل الخلايا APP هو دراسة سلوكه نسبيا. بينما البروتينات على سطح الخلية قابلة للتعديل إلى العديد من التقنيات وصفها، لا توجد طرق بسيطة لمتابعة الاتجار بروتينات الغشاء من جولجي. تحقيقا لهذه الغاية، أنشأنا بنيات APP التي تم الموسومة ب-صورة activatable GFP (paGFP) في محطة سي. بعد التوليف، paGFP ديها منخفضة مضان القاعدية، ولكن يمكن حفز مع 413 نانومتر ضوء رس إنتاج، مخضر قوي مستقر. باستخدام جولجي علامة Galactosyl ترانسفيراز بالإضافة إلى البروتين سماوي نيون (جالت-CFP) كهدف، ونحن قادرون على APP photoactivate بدقة في شبكة عابرة للجولجي. تنشيط الصور APP-paGFP ثم يمكن اتباعها لأنها بالاتجار إلى حجرات المصب تحديدها مع الموسومة fluorescently البروتينات علامة المقصورة لالاندوسوم في وقت مبكر (Rab5)، المرحوم الاندوسوم (Rab9) ويحلول (LAMP1). وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام مثبطات لمعالجة APP بما في ذلك الكلوروكين أو γ-secretase المانع L685، 458، ونحن قادرون على إجراء تجارب نبض مطاردة لدراسة تجهيز APP في الخلايا وحيدة. نجد أن نسبة كبيرة من APP يتحرك بسرعة ليحلول دون الظهور على سطح الخلية، ومن ثم يتم مسح من يحلول من قبل الانشقاقات مثل secretase. توضح هذه التقنية فائدة paGFP لمتابعة الاتجار وتصنيع البروتينات داخل الخلايا جيئة وذهابام غولجي إلى حجرات المصب.

وتشير النتائج النموذجية βAPP ترك TGN ويبدو أن حركة المرور بسرعة لLAMP1 (الشكل 1a و ب). خلال الفترة الصور التنشيط، يمكن أن ينظر إلى الحويصلات مغادرة جولجي الموجهة للالجسيمات الحالة (الشكل 1B). بدون العلاج المانع، وpaGFP مضان تكون مرئية في الجسيمات الحالة في حين...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP at JoVE.com

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

في حين يتم نقل البروتينات سطح الخلية درس بسهولة نسبيا، تصور الاتجار البروتينات داخل الخلايا هو أكثر صعوبة بكثير. هنا، فإننا نستخدم بنيات دمج GFP photoactivatable ويبرهن على وجود طريقة لمتابعة بدقة بروتين اميلويد السلائف من جهاز جولجي إلى المقصورات أسفل مجرى وتابع إزالة لها.

تصوير الاتجار بين الخلايا من APP مع GFP Photoactivatable

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

imaging-the-intracellular-trafficking-of-app-with-photoactivatable-gfp

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Views.  Western University.  في حين يتم نقل البروتينات سطح الخلية درس بسهولة نسبيا، تصور الاتجار البروتينات داخل الخلايا هو أكثر صعوبة بكثير. هنا، فإننا نستخدم بنيات دمج GFP photoactivatable ويبرهن على وجود طريقة لمتابعة بدقة بروتين اميلويد السلائف من جهاز جولجي إلى المقصورات...

Video: Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

ووضع العلامات hESCs hMSCs مع أوكسيد الحديد النانوية لعدم الغازية في تعقب المجراة مع التصوير بالرنين المغناطيسي

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

وسم الخلايا الجذعية مع الأصباغ نيون للمنظمات غير الغازية مع الكشف عن التصوير الضوئي

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

زرع GFP - معربا عن Blastomeres للتصوير لايف التنمية الشبكية والدماغ في الجنين اسماك الزرد همي

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية المستحثة إلى الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) استخدام ناقلات فيروسات الرجعية مع GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

وظيفية التصوير الشحوم البنية في الفئران مع micro-PET/CT FDG

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

يعيش التصوير من البروتينات التي تحمل علامات GFP في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; البويضات

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

والطماطم / GFP-FLP / FRT الطريقة للتصوير لايف من الفسيفساء الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the structure of native control circuits. In both cases, the ability to program gene expression in a rapid and tunable fashion, with no off-target effects, can be useful. We have constructed yeast strains containing the ACT1 promoter upstream of a URA3 cassette followed by the ligand-binding domain of the human estrogen receptor and VP16. By transforming this strain with a linear PCR product containing a DNA binding domain and selecting against the presence of URA3, a constitutively expressed artificial transcription factor (ATF) can be generated by homologous recombination. ATFs engineered in this fashion can activate a unique target gene in the presence of inducer, thereby eliminating both the off-target activation and nonphysiological growth conditions found with commonly used conditional gene expression systems. A simple method for the rapid construction of GFP reporter plasmids that respond specifically to a native or artificial transcription factor of interest is also provided.

This protocol describes an experimental procedure for the rapid construction of artificial transcription factors (ATFs) with cognate GFP reporters&#160;and quantification of the ATFs ability to stimulate GFP expression via flow cytometry.

التجميعي السريع وفحص عوامل النسخ المنشط كيميائيا مع مراسلون القائم GFP

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.