המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר הואי ג&#39;נג (יילור לרפואה) לAPP cDNA. עבודה זו מומנה על ידי מענקי NIH R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (עף), קרן ג&#39;ון סילי הזכרון הקרן למחקר ביו (עף), וז&#39;אן וג ויליאם ד ויליס Neuroscience Research קרן (ESS). JMB הוא חוקר בתכנית למלגת מחקר Translational וחבר באוניברסיטת טקסס רפואית סניף קלוד E. פלפל ישן יותר עצמאות מרכז האמריקנים (נתמך על ידי מענקי NIH UL1RR029876 וP30-AG-024832, בהתאמה).

<html> 1. ביטוי של רקומביננטי דומיין התאי APP (AICD) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transform E. coli להתאמץ BL21 עם AICD אדם (שאריות 649-695 של APP, עצבי איזופורם מספור) משובט לתוך וקטור pGEX-4T-1 (GE Healthcare). הווקטור הזה יבטא AICD כמחצית C-המסוף של חלבון היתוך של-transferase גלוטתיון S (GST). וקטור זה גם מקודד רצף מחשוף תרומבין כדי להקל על הסרת מחצית GST. פרטים של שיבוט AICD לpGEX-4T-1 ניתן למצוא בפרסום הקודם שלנו 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממושבה אחת, לחסן 10 מ&quot;ל של מרק LB עם אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל), ו דגירת הלילה בשעת 37 ° C עם רעד בגוף נמרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, לחסן LB 400 מ&quot;ל / אמפיצילין בבקבוק 1 ליטר עם 5 מ&quot;ל של תרבות הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C עם הרעד הנמרץ עד הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר הגיע 0.4-0.6. זה יהיה בדרך כלל לוקח 2-2.5 שעות. </li></ol>&gt; תוכן &quot;בשלב זה עשוי להיות רצוי להוציא מדגם קטן (~ 10 μl) לעקוב טיהור על ידי SDS-PAGE (ראה איור 1 א &#39;, ב&#39;). כל שלב טיהור הבאה צריך גם להסיר aliquot קטן לניתוח על ידי SDS-PAGE. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום לביטוי GST-AICD ידי הוספת 0.4 מ&quot;מ של איזופרופיל-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG). לדגור על 37 ° C עם הרעד נמרץ במשך 5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאי XG ב 6000 במשך 15 דקות ב 4 ° C. תא הגלולה יכולה להיות מאוחסנת ב-80 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים, בשלב זה של ההליך. </li></ol> 2. טיהור של GST-AICD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ תמוגה מ&quot;ל 50 כדלקמן: 1 המ&quot;מ dithiothreitol, 1mm ethylenediaminetetraacetic החומצה (EDTA), 0.1% Triton-x100, פלואוריד 1 מ&quot;מ phenylmethylsulfonyl (PMSF), קוקטייל מעכב פרוטאז שלם (רוש מדע יישומים), ונאגר מלוח פוספט. צ&#39;יל על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשר גלולת חיידקים (אם הוקפא בעבר) עלקרח. </li></ol> בשלב זה, זה קריטי, כי כל הצעדים נעשים ב 4 ° C כדי להגביל proteolysis. כל הצינורות, חוצצים, ומגיב אחרים צריכים להיות מראש מצוננים. אם באמצעות עיתונות או מתחלב לתמוגה צרפתית, אלה צריכים להיות מראש מצוננים גם. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יסודיות resuspend גלולת חיידקים ב20 מ&quot;ל של חיץ תמוגה. שילוב של vortexing וטחינה דקה עם פיפטה 10 מ&quot;ל על קרח יבטיח resuspension המלא של הגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים חיידקיים באמצעות resuspended מתחלב (לדוגמה, Avestin EmulsiFlex-C3) או תא לחץ צרפתי, מראש מצוננים ל4 מעלות צלזיוס ב30,000 psi. תעבור דרך lysate מתחלב בפעם שנייה. איסוף lysate לתוך צינור מראש מקורר 50 מ&quot;ל. </li></ol> היתרון העיקרי של שני המכשירים האלה הוא שהם למזער חימום של המדגם. הטכניקה הנפוצה של sonication מפיק חום משמעותי בקצה של החללית וsonicationיכול לגרום לצבירה של חלבונים רקומביננטיים. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate ב15000 XG למשך 30 דקות. להפריד ולשמור את supernatant לתוך צינור מראש מקורר 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של slurry 50% מגלוטתיון-agarose (סיגמא אולדריץ). סובב למשך 30 דקות ב 4 ° C. בעוד המדגם מסתובב, לעשות חיץ elution טרי: 50 mM טריס 7.8, 0.1% Triton-x100, 0.5 המ&quot;מ dithiothreitol, 10 מ&quot;מ גלוטתיון המופחת. </li></ol> הצעד היחיד של הפרוטוקול שמתבצע בטמפרטורת חדר הוא צעד elution. לכן, חיץ elution נשמר בטמפרטורת חדר. חיץ elution צריך להיות מוכן טרי. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצק lysate ותרחיף ל&quot; עמודת כרומטוגרפיה פנויה 5 עם קלקר (90-130 מיקרומטר) מסננים גסים (מדעי אוורגרין). לשטוף את העמודה 5 פעמים עם 3 מ&quot;ל של פוספט נאגר מלוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את החלק התחתון של העמודה ולהוסיף 500 μl של חיץ elution טמפרטורת חדר. מכסה את החלק העליון שלטור ולסובב למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. איסוף eluate לתוך צינור microfuge מצונן 1.5 מ&quot;ל. חזור elution עוד פעמים (1.5 eluate הכולל מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיאליזת eluate בקרום 10,000 משקל מולקולרי הפסקת דיאליזה (למשל, Thermo Scientific קלטות Slide-A-Lyzer דיאליזה) ב 4 ליטר של פוספט נאגרה מלוחה הלילה ב 4 ° C. הדיאליזה כנגד 4 ליטר נוסף של פוספט נאגרה מלוחה ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ביום המחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החלבון מקלטת הדיאליזה ולבצע בדיקת חלבון כימות לקביעת תשואה של GST-AICD. טיהור טיפוסית מ400 מ&quot;ל של התרבות תגרום לתשואות של&gt; 20 מ&quot;ג של חלבון מטוהר בריכוזים של 10-20 מ&quot;ג / מ&quot;ל. Aliquot החלבון לתוך 200 aliquots והקפאה μl ב -80 ° C. </li></ol> 3. מחשוף של תרומבין GST-AICD וטיהור AICD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200 μl ההפשרה של מטוהרי GST-AICD ולהוסיף 20 μl של thromb 1 U / μlפנימה דגירת הלילה בשעת 37 ° C. </li></ol> האיכות והטוהר של תרומבין משתנים באופן ניכר בין יצרנים, ויכולות להיות מקור משמעותי של זיהום. אנו משתמשים בתרומבין מGE Healthcare (ראה טבלה של חומרים כימיים). לאחר דגירת הלילה,&gt; 95% מחלבון ההיתוך יש בקע (1B איור). <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הלילה עם מחשוף תרומבין, סביר להניח שחלק של AICD המשוחרר עבר צבירה והפתרון יכול להופיע מעונן. נקה את החומר מצטבר ידי צנטריפוגה ב20000 XG למשך 30 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant לתוך צינור microfuge מראש מצונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של 50% גלוטתיון-agarose slurry ו50% μl 50 p-aminobenzamidine-agarose slurry להסיר GST ותרומבין, בהתאמה. דגירה עם רוטציה למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בקצרה למשקעים את חרוזי agarose, ולהסיר את supernatant לתוך צינור טרי. חלץ tהוא GST ארבע פעמים יותר עם גלוטתיון-agarose. חילוץ יחיד עם p-aminobenzamidine-agarose מספיק כדי להסיר את 20 U של תרומבין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע בדיקת quantitation חלבון על 5 μl של AICD המטוהרים. תשואות אופייניות מתרבות מ&quot;ל 400 הן 50-100 מיקרוגרם בריכוז של 0.2-0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל. תשואות גבוהות יותר הן אפשריות על ידי ביקוע בכמויות גדולות של GST-AICD. </li></ol> המטוהר AICD צריך להיות מוכן טרי לאפיון ביוכימי / biophysical. חומרים שאינם בשימוש אמורים להיות מושלכים. אפשר גם להתרכז AICD ידי lyophilizing המדגם וresuspending בנפח קטן יותר של 6 חיץ. אם גילוי AICD דורש סופגים (כגון לאחר מלכודת מסנן או assay כתם הנקודה), אחזור אנטיגן על הקרום צריך להתבצע כפי שמתואר על ידי Pimplikar ו12 Suryanarayana. 4. צבירת AICD למיקרוסקופי כוח אטומי (AFM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל טרי AICD בעמ<html> hosphate נאגר מלוח לריכוז של 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בנפח סופי של 15 μl. בשלב זה, תרכובות שונות ו / או חלבונים ניתן להוסיף על מנת לקבוע אם הם מעכבים צבירת AICD. לדוגמה, יש לנו הראינו כי ריכוזי equimolar של ubiquilin-1 למנוע צבירה של AICD בassay 4 זה. </li></ol> אפשר גם לאמצעי תגובה גדולה יותר הכולל לניסויים ביוכימיים כגון מבחני מלכודת סינון ופיזור אור 4. היינו לנו הצלחה בביצוע מבחני מלכודת סינון על תערובות תגובה גדולה כמו 400 μl עם AICD דילול לריכוזים נמוכים כמו 1 מיקרומטר. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום להצטברות תרמית על ידי דוגר את הדגימות ב 43 ° C עם הרעד ב800 סל&quot;ד באפנדורף Thermomixer עבור 48 שעות. טמפרטורה זו נבחרה על בסיס מבחנים שבוחנים מלווה צבירת התרמית של synthase מודל מלווה מצע ציטראט 4,13. </li></ol>&gt; צבירה תרמית היא שיטה נפוצה לגרום למעבר המבני של חלבון מילידי מבנה שאינו ילידים (שהיא בדרך כלל גיליון ביתא עשיר) אשר גורם להיווצרות של אגרגטים מולקולאריים. צבירה תרמית משמשת גם כדי לבחון את תפקודו של מלווים מולקולריים, שגוננו מגזרים הידרופובי מ טביעת אינטראקציות מולקולאריים בלתי הולמות (ובכך לעכב או למנוע צבירת תרמית). <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל את המדגם 20-לקפל במי deionized ו2 μl המקום אל תציץ טרי בקע. ייבש את הדגימה בdessicator בן לילה. יהיה צורך לקבוע באופן אמפירי הדילול האופטימלי להדמיה, וכך כמה דילולים נעים בין 10 - ל 100-קיפול יהיו זהירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו AICD מצטבר באמצעות הפעלת AFM במצב הקשה 14. את cantilevers משמש הם מנופים מצופים זהב מייקר חד ניטריד (MSNL, ברוקר) עם רדיוס קצה נומינלי של 2 ננומטר. טיפוסי קשה אמפליטודות durבאמצעות הדמיה היא 10-20 ננומטר בתדר התהודה של cantilevers (30-50 קילוהרץ). </li></ol> מצאנו כי איכות תמונה וחדות של אגרגטים חלבון שונים תלויה בכח המופעל ואת משך הניסוי. כדי למזער את הפרעות מדגם על ידי הקצה, שמרנו את הכח המופעל נמוך יחסית על ידי שמירה על יחס קבוע של מעל 95% והגבלת הסריקה של כל דגימה לדקות 5-10. עיבוד תמונה בוצע עם WSxM תוכנה (Nanotec). עיבוד תמונה סטנדרטי הורכב ממטוס החיסור והשטחה. המעבדות שלנו משתמשות ב&quot; הבית נבנה &quot;15 AFM interfaced למערכת מסחרית סריקת בדיקת מיקרוסקופ שליטה (Nanotec). 5. נציג תוצאות הביטוי וההעשרה יחסית של GST-AICD מוצג באיור 1 א. לאחר תמוגה, רוב חלבון ההיתוך נמצא בחלק המסיס, ולכן חילוץ מinclusiעל גופו לא נדרש. חומר eluted מעמודת agarose גלוטתיון הוא&gt; 95% טהורים. בהכנה מוצגת באיור 1, הריכוז של חלבון eluted מהעמודה היה 14.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל, והתשואה הייתה 22 מ&quot;ג (מתרבות מוצא של 400 מ&quot;ל). מחשוף של 200 μl הכנת הלילה עם 20 U של תרומבין זה הביא לכמעט 100% ממחשוף חלבון ההיתוך (1B איור). הסכום של תרומבין המשמש הוא נמוך מספיק כדי לא להתגלות על ידי צביעה הכחולה Coomassie (ראה מסלול, 1B &quot;בקע&quot; איור). הסרת תרומבין וGST ביאה לירידה בחלק מחומר, אולם זה היה&gt; 90% טהור עם תשואה בהכנת השיעורים של 70 מיקרוגרם של AICD בריכוז של 0.35 מ&quot;ג / מ&quot;ל. התרשים 1C מציג את תרשים הזרימה לצבירה של AICD וניתוח שלאחר מכן. אגרגטים AICD צפו בי ידי AFM הם בדרך כלל אליפטית / אמורפי, וטווח בגודל 50-100 ננומטר (1D איור, F). מצטברחומר הוא לא ניתן לגילוי כאשר סכום equimolar של מלווה ubiquilin-1 מתווסף לתגובת הצבירה (האיור 1E) 4. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4204/4204fig1.jpg" /> איור 1. טיהור וצבירה של AICD.) מכתימה Coomassie כחול של דגימות שנאספו בכל שלב של תהליך הטיהור. לדגימות uninduced ומושרות, 20 μl של חיידקים כלל היה לרוץ על ג&#39;ל. לשבריר supernatant, 5 μl של lysate (מנפח כולל של 20 מ&quot;ל) היה לרוץ על ג&#39;ל. לשבריר הגלול, הגלולה הייתה resuspended ב 20 מ&quot;ל של חיץ תמוגה, ו 5 μl של חומר זה היה sonicated בsonicator אמבט מים למשך 30 דקות ב 4 ° C לפני העמיס על ג&#39;ל. לflowthrough, 5 μl היה לרוץ על ג&#39;ל. סכומי eluate הועמסו על ג&#39;ל מצוינים. B) ג&#39;ל הצבעוני הכחול Coomassie של uncleaved ובקע GST-AICD (2 μl) ו1 ו 5 &amp; מ &#39;u; l מטוהרי AICD. ג) תרשים זרימה של טיהור AICD, צבירה, וניתוח. D, E) תמונה של נציג AFM מצטבר תרמית AICD בהעדר (ד &#39;) והנוכחות (ה) של המלווה המולקולרי ubiquilin-1. F) היסטוגרמה של התפלגות הגודל של אגרגטים AICD.

<ol>
	<li>De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretases:+enzymes+with+therapeutic+potential+in+Alzheimer+disease.">The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).</li><li>Chang, K. A., Suh, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+roles+of+amyloid+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein.">Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein.</a> BMB reports. 43, 656-663 (2010).</li><li>McLoughlin, D. M., Miller, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FE65+proteins+and+Alzheimer's+disease.">The FE65 proteins and Alzheimer's disease.</a> J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).</li><li>Stieren, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquilin-1+is+a+molecular+chaperone+for+the+amyloid+precursor+protein.">Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).</li><li>Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+structural+changes+in+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+detected+by+NMR.">Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR.</a> J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).</li><li>Ramelot, T. A., Gentile, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+structure+of+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+indicates+preordering+of+structure+for+binding+to+cytosolic+factors.">Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors.</a> Biochem. 39, 2714-2725 (2000).</li><li>Radzimanowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+intracellular+domain+of+the+amyloid+precursor+protein+in+complex+with+Fe65-PTB2.">Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2.</a> EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).</li><li>Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+alters+gene+expression+and+induces+neuron-specific+apoptosis.">The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis.</a> Gene. 475, 1-9 (2011).</li><li>von Rotz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+APP+intracellular+domain+forms+nuclear+multiprotein+complexes+and+regulates+the+transcription+of+its+own+precursor.">The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor.</a> J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).</li><li>Hamid, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+modulates+cellular+calcium+homeostasis+and+ATP+content.">Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content.</a> J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).</li><li>Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+intracellular+domain+impairs+adult+neurogenesis+in+transgenic+mice+by+inducing+neuroinflammation.">APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation.</a> PLoS ONE. 5, e11866 (2010).</li><li>Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+APP+intracellular+domain+in+brain+tissue.">Detection of APP intracellular domain in brain tissue.</a> Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).</li><li>Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chaperone+function+using+citrate+synthase+as+nonnative+substrate+protein.">Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein.</a> Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).</li><li>Hansma, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+atomic+force+microscopy+of+DNA.">Recent advances in atomic force microscopy of DNA.</a> Scanning. 15, 296-299 (1993).</li><li>Valbuena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasi-simultaneous+imaging/pulling+analysis+of+single+polyprotein+molecules+by+atomic+force+microscopy.">Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).</li><li>Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction,+purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+human+Fe65-PTB2+in+complex+with+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain.">Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain.</a> Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).</li><li>Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein+interacts+with+flotillin-1,+a+lipid+raft+protein.">The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).</li><li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Notch1+signaling+by+the+APP+intracellular+domain+facilitates+degradation+of+the+Notch1+intracellular+domain+and+RBP-Jk.">Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk.</a> J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).</li><li>Lazarov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport,+amyloid+precursor+protein,+kinesin-1,+and+the+processing+apparatus:+revisited.">Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited.</a> J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).</li><li>Kakuda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equimolar+production+of+amyloid+beta-protein+and+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+from+beta-carboxyl-terminal+fragment+by+gamma-secretase.">Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase.</a> J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).</li><li>Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+under+the+atomic+force+microscope.">Amyloid under the atomic force microscope.</a> Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

בפרוטוקול זה גבשנו הליך לקבלת AICD הטהור ביותר עבור ניתוחים מבניים, biophysical, וביוכימיים. הליך זה אינו דורש ציוד מתוחכם כרומטוגרפיה ולכן הוא נגיש לרוב המעבדות. קבוצות אחרות לא מטוהרות AICD 5-7,16, כולל GST-AICD 17-19, לניתוחים ביוכימיים / מבניים. חסרונות לפרוטוקולים קודמ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> pGEX-4T-1 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9545-49 </td><td></td></tr><tr><td> תרומבין </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-0846-01 </td><td></td></tr><tr><td> אמפיצילין </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP1760 </td><td></td></tr><tr><td> מגיב assay חלבון ברדפורד </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Coomassie כחול </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (thiogalactopyranoside איזופרופיל-beta-D) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> I6758 </td><td></td></tr><tr><td> גלוטתיון-agarose </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> G4510 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> p-aminobenzamidine-agarose </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> A7155 </td><td></td></tr><tr><td> קוקטייל מעכב פרוטאז מלא </td><td> רוש </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> קלטות דיאליזת Slide-A-Lyzer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66380 </td><td></td></tr><tr><td> עמודות כרומטוגרפיה </td><td> מדעי אוורגרין </td><td> 208-3367-050 </td><td></td></tr><tr><td> מתחלב </td><td> Avestin, Inc </td><td> EmulsiFlex-C3 </td><td> מומלץ ביותר </td></tr><tr><td> אפנדורף Thermomixer </td><td> אפנדורף </td><td> 022670107 </td><td></td></tr><tr><td> דיסקים יציצו </td><td> טד פלה </td><td> 50-12 </td><td></td></tr><tr><td> cantilevers AFM </td><td> ברוקר </td><td> MSNL-10 </td><td></td></tr><tr><td> WSxM תוכנה </td><td> Nanotec </td><td> N / </td><td> Free הורדה </td></tr></tbody></table>

purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain

חלבון מבשר עמילואיד (APP) הוא חלבון הטרנסממברני אני סוג קשור בפתוגנזה של המחלה (לספירה) אלצהיימר. APP מאופיין בתחום תאי גדול ותחום cytosolic קצר כינה התחום התאי APP (AICD). במהלך התבגרות דרך מסלול ההפרשה, APP ניתן בקע ידי פרוטאזות המכונות α, β, וγ-secretases 1. מחשוף פרוטאוליטי רציף של APP עם β-γ וsecretases מוביל לייצור של פפטיד קטן פרוטאוליטי, Aβ כינה, שהוא amyloidogenic ומרכיב הליבה של פלאק סנילי. AICD גם משוחרר מהקרום לאחר עיבוד סקרטאז, ובאמצעות אינטראקציות עם Fe65 וTip60, יכולה translocate לגרעין להשתתף בויסות שעתוק של גני המטרה מרובים 2,3. אינטראקציות בין חלבונים המעורבים AICD עשויות להשפיע על סחר, עיבוד, ופונקציות סלולריות של הולוגרמות APP וC-terminברי al. אנחנו הראינו לאחרונה שAICD יכול המצרפי במבחנה, ותהליך זה מעוכב על ידי ubiquilin-1 מלווה AD-מעורב מולקולרי 4. באופן עקבי עם ממצאים אלה, AICD חשף תחומים הידרופובי והוא מהותי מופרע במבחנת 5,6, אולם זה מקבל מבנה שניוני יציב כאשר חייב Fe65 7. אנחנו הצענו שubiquilin-1 מונע אינטראקציות בין intramolecular ולא תקינות של AICD, מניעת צבירה במבחנה בתאים שלמים 4. בעוד שרוב המחקרים מתמקדים בתפקידו של APP בפתוגנזה של ספירה, את התפקיד של AICD בתהליך זה אינו ברור. ביטוי של AICD הוכח לגרום לאפופטוזיס 8, לווסת את מסלולי איתות 9, ולהסדיר סיד איתות 10. על הביטוי של AICD וFe65 במודל עכבר מהונדס גורם אלצהיימר כמו 11 פתולוגיה, ולאחרונה AICD זוהה בחזייהבlysates ידי מערבי סופג בעת שימוש בטכניקות אחזור אנטיגן מתאימות 12. כדי להקל על מחקרים מבניים, ביוכימי, וbiophysical של AICD, פתח הליך כדי לייצר כמויות גדולות של חלבון recombinantly AICD הטהור ביותר. בנוסף, אנו מתארים שיטה לזירוז בצבירת תרמית מבחנה של AICD וניתוח על ידי מיקרוסקופ כוח האטומי. בשיטות המתוארות שימושיות לאפיון ביוכימי, biophysical, ומבני של AICD ואת ההשפעות של מלווים מולקולריים על צבירת AICD.

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain at JoVE.com

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

שיטה לטיהור בקנה מידה גדולה של התחום התאי APP (AICD) מתוארת. גם אנו מתארים שיטה כדי לגרום<em&gt; במבחנה</em&gt; צבירת AICD והדמיה על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי. בשיטות המתוארות שימושיות לאפיון ביוכימי / המבני של AICD ואת ההשפעות של מלווים מולקולריים על הצבירה שלו.

טיהור וצבירה של תחום החלבון המבשר עמילואיד התאי

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

purification-aggregation-amyloid-precursor-protein-intracellular

Research

JoVE Journal

Medicine

11.7K Views.  University of Texas Medical Branch. שיטה לטיהור בקנה מידה גדולה של התחום התאי APP (AICD) מתוארת. גם אנו מתארים שיטה כדי לגרום במבחנה צבירת AICD והדמיה על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי. בשיטות המתוארות שימושיות לאפיון ביוכימי / המבני של AICD ואת ההשפעות של מלווים מולקולריים על הצבירה שלו.

Video: Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis. Since the clinical presentation of this disease is so variable and non-specific, the associated risks of these biopsies are too great for the diagnostic yield. Other sites that have a lower biopsy risk, such as skin or gingival, are also relatively invasive and expensive. In addition, these biopsies may not always have sufficient amyloid deposits to establish a diagnosis. Fat pad aspiration has demonstrated good clinical correlation with low cost and minimal morbidity. However, there are no standardized protocols for performing this procedure or processing the aspirated specimen, which leads to variable and nonreproducible results. The most frequently utilized modality for detecting amyloid in tissue is an apple-green birefringence on Congo red stained sections using a polarizing microscope. This technique requires cell block preparation of aspirated material. Unfortunately, patients presenting in early stage of amyloidosis have minimal amounts of amyloid which greatly reduces the sensitivity of Congo red stained cell block sections of fat pad aspirates. Therefore, ultrastructural evaluation of fat pad aspirates by electron microscopy should be utilized, given its increased sensitivity for amyloid detection. This article demonstrates a simple and reproducible procedure for performing anterior fat pad aspiration for the detection of amyloid utilizing both Congo red staining of cell block sections and electron microscopy for ultrastructural identification.

Fat pad aspiration is a preferred, minimally invasive, and low cost approach as compared to other methods to detect amyloid for diagnosis of systemic amyloidosis. This video article demonstrates a procedural outline for performing fat pad aspiration with appropriate processing of the specimen for the optimal diagnostic outcome.

ביצוע ועיבוד FNA של Pad שומן Anterior עבור עמילואיד

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

סמנים ביולוגיים במודל חיה לחשיפה קושרת עצבית, המטולוגית, והתנהגות של PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability in industrialized countries. Replacement of degenerated photoreceptors by cell transplantation represents a possible treatment option in future clinical applications. Indeed, recent preclinical studies demonstrated that immature photoreceptors, isolated from the neonatal mouse retina at postnatal day 4, have the potential to integrate into the adult mouse retina following subretinal transplantation. Donor cells generated a mature photoreceptor morphology including inner and outer segments, a round cell body located at the outer nuclear layer, and synaptic terminals in close proximity to endogenous bipolar cells. Indeed, recent reports demonstrated that donor photoreceptors functionally integrate into the neural circuitry of host mice. For a future clinical application of such cell replacement approach, purified suspensions of the cells of choice have to be generated and placed at the correct position for proper integration into the eye. For the enrichment of photoreceptor precursors, sorting should be based on specific cell surface antigens to avoid genetic reporter modification of donor cells. Here we show magnetic-associated cell sorting (MACS) - enrichment of transplantable rod photoreceptor precursors isolated from the neonatal retina of photoreceptor-specific reporter mice based on the cell surface marker CD73. Incubation with anti-CD73 antibodies followed by micro-bead conjugated secondary antibodies allowed the enrichment of rod photoreceptor precursors by MACS to approximately 90%. In comparison to flow cytometry, MACS has the advantage that it can be easier applied to GMP standards and that high amounts of cells can be sorted in relative short time periods. Injection of enriched cell suspensions into the subretinal space of adult wild-type mice resulted in a 3-fold higher integration rate compared to unsorted cell suspensions.

Cell transplantation represents a strategy for the treatment of retinal degeneration characterized by photoreceptor loss. Here we describe a method for enrichment of transplantable photoreceptors and their subretinal grafting into adult mice.

השתלת Subretinal של MACS מטוהרים פוטורצפטור קודמן תאים לתוך הרשתית עכבר בוגר

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Synergetic Use of Neural Precursor Cells and Self-assembling Peptides in Experimental Cervical Spinal Cord Injury

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. Clinically, more than 50% of SCI affect the cervical spine1. As a consequence of the primary injury, a cascade of secondary mechanisms including inflammation, apoptosis, and demyelination occur finally leading to tissue scarring and development of intramedullary cavities2,3. Both represent physical and chemical barriers to cell transplantation, integration, and regeneration. Therefore, shaping the inhibitory environment and bridging cavities to create a supportive milieu for cell transplantation and regeneration is a promising therapeutic target4. Here, a contusion/compression model of cervical SCI using an aneurysm clip is described. This model is more clinically relevant than other experimental models, since complete transection or ruptures of the cord are rare. Also in comparison to the weight drop model, which in particular damage the dorsum columns, circumferential compression of the spinal cord appears advantageous. Clip closing force and duration can be adjusted to achieve different injury severity. A ring spring facilitates precise calibration and constancy of clip force. Under physiological conditions, synthetic self-assembling peptides (SAP) self-assemble into nanofibers and thus, are appealing for application in SCI5. They can be injected directly into the lesion minimizing damage to the cord. SAPs are biocompatible structures erecting scaffolds to bridge intramedullary cavities and thus, equip the damaged cord for regenerative treatments. K2(QL)6K2 (QL6) is a novel SAP introduced by Dong et al.6 In comparison to other peptides, QL6 self-assembles into &#946;-sheets at neutral pH6.14 days after SCI, after the acute stage, SAPs are injected into the center of the lesion and neural precursor cells (NPC) are injected into adjacent dorsal columns. In order to support cell survival, transplantation is combined with continuous subdural administration of growth factors by osmotic micro pumps for 7 days.

Treating cervical spinal cord injury with both self-assembling peptides (SAP) and neural precursor cells (NPC), together with growth factors, is a promising approach to promote regeneration and recovery. A contusion/compression aneurysm clip rat model of cervical SCI and combined treatment involving SAP injection and NPC transplantation is established.

שימוש סינרגטי של תאים עצביים מבשר ופפטידים עצמי הרכבה בפגיעה בחוט השדרה הניסויית צוואר הרחם

Spinal cord injuries (SCI) cause serious neurological impairment and psychological, economic, and social consequences for patients and their families. ...

Assessment of Spontaneous Alternation, Novel Object Recognition and Limb Clasping in Transgenic Mouse Models of Amyloid-&#946; and Tau Neuropathology

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional motor behaviors in transgenic mouse models of &#946;-amyloidosis and tauopathy. The paradigm includes tests for spontaneous alternation in a Y-maze, novel object recognition, and limb clasping. These tests were selected because they: 1) interrogate function of cognitive or motor domains and the correlate neural circuitry relevant to the human disease state, 2) have clearly defined endpoints, 3) have easily implementable quality control checks, 4) can be run in a moderate throughput format, and 5) require little intervention by the investigator. These methods are designed for investigators looking to screen compounds for activity in short-term and working memory tasks, or functional motor behaviors associated with Alzheimer's disease mouse models. The methods described here use behavioral tests that engage a number of different brain regions including hippocampus and various cortical areas. Investigators that desire cognitive tests that specifically assess cognition mediated by a single brain region could use these techniques to supplement other behavioral tests.

Assessment of Spontaneous Alternation, Novel Object Recognition and Limb Clasping in Transgenic Mouse Models of Amyloid-&amp;#946; and Tau Neuropathology

Described here is a staged, behavioral screening approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional motor behaviors in transgenic mouse models of &#946;-amyloidosis and tauopathy. These methods are optimized to screen compounds for activity in short-term and working memory tasks.

הערכה של חלופה ספונטנית, זיהוי אובייקטים רומנטי ו Clbing איברים מודלים עכבר מהונדס של Amyloid-β ו נוירופתולוגיה טאו

Here we describe a staged, behavioral testing approach that can be used to screen for compounds that exhibit in vivo efficacy on cognitive and functional ...

Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or in buffer (washed platelets), by the use of one or a combination of agonists. The use of washed platelets separated from their plasma environment and in the absence of anticoagulants allows for studying intrinsic platelet properties. Among the large panel of agonists, arachidonic acid (AA), adenosine di-phosphate (ADP), thrombin and collagen are the most frequently used. The aggregation response is quantified by measuring the relative optical density (OD) over time of platelet suspension under continuous stirring. Platelets in homogeneous suspension limit the passage of light after the addition of an agonist, platelet shape change occurs producing a small transitory increase in OD. Following this initial activation step, platelet clots form gradually, allowing the passage of light through the suspension as a result of decreased OD. The aggregation process is ultimately expressed as a percentage, compared to the OD of platelet-poor plasma or buffer. Rigorous calibration is thus essential at the beginning of each experiment. As a general rule: calibration to 0% is set by measuring the OD of a non-stimulated platelet suspension while measuring the OD of the suspension medium containing no platelets represents a value of 100%. Platelet aggregation is generally visualized as a real-time aggregation curve. Turbidimetry is one of the most commonly used laboratory techniques for the investigation of platelet function and is considered as the historical gold standard and used for the development of new pharmaceutical agents aimed at inhibiting platelet aggregation. Here, we describe detailed protocols for 1) preparation of human washed platelets and 2) turbidimetric analysis of collagen-induced aggregation of human washed platelets pretreated with the food dye Brilliant Blue FCF that was recently identified as an inhibitor of Pannexin1 (Panx1) channels.

We describe a straightforward method for the isolation of washed platelets from human blood followed by agonist-induced platelet aggregation measurements by turbidimetry. As an example we apply this method for studying the aggregation response of human platelets to collagen after a pre-incubation with the Pannexin1 channel inhibitor Brilliant Blue FCF.

Turbidimetry על אדם שנשטף טסיות: השפעת מעכבי Pannexin1 FCF הכחול המבריק על צבירה מושרת קולגן

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum (SR) serves as a Ca2+ reservoir for contraction, which reuptakes intracellular Ca2+ during relaxation. The SR Ca2+ reserve available for beats is determinate for cardiac contractibility, and the removal of intracellular Ca2+ is critical for cardiac diastolic function. Under some pathophysiological conditions, such as diabetes and heart failure, impaired calcium clearance and SR Ca2+ store in cardiomyocytes may be involved in the progress of cardiac dysfunction. Here, we describe a protocol to evaluate SRCa2+ reserve and diastolic Ca2+ removal. Briefly, a single cardiomyocyte was enzymatically isolated, and the intracellular Ca2+ fluorescence indicated by Fura-2 was recorded by a calcium imaging system. To employ caffeine for inducing total SR Ca2+ release, we preset an automatic perfusion switch program by interlinking the stimulation system and the perfusion system. Then, the mono-exponential curve fitting was used for analyzing decay time constants of calcium transients and caffeine-induced calcium pulses. Accordingly, the contribution of the SR Ca2+-ATPase (SERCA) and Na+-Ca2+ exchanger (NCX) to diastolic calcium removal was evaluated.

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Here, we describe a protocol to evaluate sarcoplasmic reticulum Ca2+ reserve and diastolic calcium removal function in cardiomyocytes by a calcium imaging system.

הערכה של רשת Sarcoplasmic סידן סידן הדיאסטולי שימור, תאיים הסרת Cardiomyocytes חדרית מבודד

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

אין ויוו הדמיה של עכברים כתב Cx3cr1gfp/gfp עם תחומים הספקטרום טומוגרפיה אופטית קוהרנטית, סריקת לייזר Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier integrity. However, their tissue-specific functions in the heart are not well understood. Moreover, there is currently no protocol utilizing readily accessible materials to isolate and purify pericytes of cardiac origin. Our protocol focuses on using the widely used mammalian model, the mouse, as our source of cells. Using the enzymatic digestion and mechanical dissociation of heart tissue, we obtained a crude cell mixture that was further purified by fluorescence activating cell sorting (FACS) by a plethora of markers. Because there is no single unequivocal marker for pericytes, we gated for cells that were CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Following purification, these primary cells were cultured and passaged multiple times without any changes in morphology and marker expression. With the ability to regularly obtain primary murine cardiac pericytes using our protocol, we hope to further understand the role of pericytes in cardiovascular physiology and their therapeutic potential.

We have optimized a protocol to isolate and purify murine cardiac pericytes for basic research and investigation of their biology and therapeutic potential.

בידוד וטיהור של קרום הלב של מורלין

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

בידוד מבוסס אולטרה-צנטריפוגות של בועיות חוץ-תאיות ממערכות ADSC אנושיות

Purification and Characterization of Extracellular Vesicles from Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research suggests that their regenerative function may be attributed to cell-cell contact and cell paracrine effects. The paracrine effect is an important way for cells to interact and transfer information over short distances, in which extracellular vesicles (EVs) play a functional role as carriers. There is significant potential for ADSC EVs in regenerative medicine. Multiple studies have reported on the effectiveness of these methods. Various methods for extracting and isolating EVs are currently described based on principles such as centrifugation, precipitation, molecular size, affinity, and microfluidics. Ultracentrifugation is regarded as the gold standard for isolating EVs. Nevertheless, a meticulous protocol to highlight precautions during ultracentrifugation is still absent. This study presents the methodology and crucial steps involved in ADSC culture, supernatant collection, and EV ultracentrifugation. However, even though ultracentrifugation is cost-effective and requires no further treatment, there are still some inevitable drawbacks, such as a low recovery rate and EV aggregation.

מחבר זרקור: סטנדרטיזציה ושיפור המיצוי והטיהור של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-ADSCs אנושיים

This protocol describes all procedures, from culturing human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) and collecting supernatant to extracting extracellular vesicles (EVs) using ultracentrifugation.

טיהור ואפיון שלפוחיות חוץ-תאיות מתאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן אנושי

Human adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can promote the regeneration and reconstruction of various tissues and organs. Recent research ...