המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר הואי ג&#39;נג (יילור לרפואה) לAPP cDNA. עבודה זו מומנה על ידי מענקי NIH R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (עף), קרן ג&#39;ון סילי הזכרון הקרן למחקר ביו (עף), וז&#39;אן וג ויליאם ד ויליס Neuroscience Research קרן (ESS). JMB הוא חוקר בתכנית למלגת מחקר Translational וחבר באוניברסיטת טקסס רפואית סניף קלוד E. פלפל ישן יותר עצמאות מרכז האמריקנים (נתמך על ידי מענקי NIH UL1RR029876 וP30-AG-024832, בהתאמה).

<html> 1. ביטוי של רקומביננטי דומיין התאי APP (AICD) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transform E. coli להתאמץ BL21 עם AICD אדם (שאריות 649-695 של APP, עצבי איזופורם מספור) משובט לתוך וקטור pGEX-4T-1 (GE Healthcare). הווקטור הזה יבטא AICD כמחצית C-המסוף של חלבון היתוך של-transferase גלוטתיון S (GST). וקטור זה גם מקודד רצף מחשוף תרומבין כדי להקל על הסרת מחצית GST. פרטים של שיבוט AICD לpGEX-4T-1 ניתן למצוא בפרסום הקודם שלנו 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממושבה אחת, לחסן 10 מ&quot;ל של מרק LB עם אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל), ו דגירת הלילה בשעת 37 ° C עם רעד בגוף נמרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, לחסן LB 400 מ&quot;ל / אמפיצילין בבקבוק 1 ליטר עם 5 מ&quot;ל של תרבות הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C עם הרעד הנמרץ עד הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר הגיע 0.4-0.6. זה יהיה בדרך כלל לוקח 2-2.5 שעות. </li></ol>&gt; תוכן &quot;בשלב זה עשוי להיות רצוי להוציא מדגם קטן (~ 10 μl) לעקוב טיהור על ידי SDS-PAGE (ראה איור 1 א &#39;, ב&#39;). כל שלב טיהור הבאה צריך גם להסיר aliquot קטן לניתוח על ידי SDS-PAGE. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום לביטוי GST-AICD ידי הוספת 0.4 מ&quot;מ של איזופרופיל-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG). לדגור על 37 ° C עם הרעד נמרץ במשך 5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאי XG ב 6000 במשך 15 דקות ב 4 ° C. תא הגלולה יכולה להיות מאוחסנת ב-80 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים, בשלב זה של ההליך. </li></ol> 2. טיהור של GST-AICD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ תמוגה מ&quot;ל 50 כדלקמן: 1 המ&quot;מ dithiothreitol, 1mm ethylenediaminetetraacetic החומצה (EDTA), 0.1% Triton-x100, פלואוריד 1 מ&quot;מ phenylmethylsulfonyl (PMSF), קוקטייל מעכב פרוטאז שלם (רוש מדע יישומים), ונאגר מלוח פוספט. צ&#39;יל על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשר גלולת חיידקים (אם הוקפא בעבר) עלקרח. </li></ol> בשלב זה, זה קריטי, כי כל הצעדים נעשים ב 4 ° C כדי להגביל proteolysis. כל הצינורות, חוצצים, ומגיב אחרים צריכים להיות מראש מצוננים. אם באמצעות עיתונות או מתחלב לתמוגה צרפתית, אלה צריכים להיות מראש מצוננים גם. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יסודיות resuspend גלולת חיידקים ב20 מ&quot;ל של חיץ תמוגה. שילוב של vortexing וטחינה דקה עם פיפטה 10 מ&quot;ל על קרח יבטיח resuspension המלא של הגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים חיידקיים באמצעות resuspended מתחלב (לדוגמה, Avestin EmulsiFlex-C3) או תא לחץ צרפתי, מראש מצוננים ל4 מעלות צלזיוס ב30,000 psi. תעבור דרך lysate מתחלב בפעם שנייה. איסוף lysate לתוך צינור מראש מקורר 50 מ&quot;ל. </li></ol> היתרון העיקרי של שני המכשירים האלה הוא שהם למזער חימום של המדגם. הטכניקה הנפוצה של sonication מפיק חום משמעותי בקצה של החללית וsonicationיכול לגרום לצבירה של חלבונים רקומביננטיים. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate ב15000 XG למשך 30 דקות. להפריד ולשמור את supernatant לתוך צינור מראש מקורר 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של slurry 50% מגלוטתיון-agarose (סיגמא אולדריץ). סובב למשך 30 דקות ב 4 ° C. בעוד המדגם מסתובב, לעשות חיץ elution טרי: 50 mM טריס 7.8, 0.1% Triton-x100, 0.5 המ&quot;מ dithiothreitol, 10 מ&quot;מ גלוטתיון המופחת. </li></ol> הצעד היחיד של הפרוטוקול שמתבצע בטמפרטורת חדר הוא צעד elution. לכן, חיץ elution נשמר בטמפרטורת חדר. חיץ elution צריך להיות מוכן טרי. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצק lysate ותרחיף ל&quot; עמודת כרומטוגרפיה פנויה 5 עם קלקר (90-130 מיקרומטר) מסננים גסים (מדעי אוורגרין). לשטוף את העמודה 5 פעמים עם 3 מ&quot;ל של פוספט נאגר מלוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את החלק התחתון של העמודה ולהוסיף 500 μl של חיץ elution טמפרטורת חדר. מכסה את החלק העליון שלטור ולסובב למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. איסוף eluate לתוך צינור microfuge מצונן 1.5 מ&quot;ל. חזור elution עוד פעמים (1.5 eluate הכולל מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיאליזת eluate בקרום 10,000 משקל מולקולרי הפסקת דיאליזה (למשל, Thermo Scientific קלטות Slide-A-Lyzer דיאליזה) ב 4 ליטר של פוספט נאגרה מלוחה הלילה ב 4 ° C. הדיאליזה כנגד 4 ליטר נוסף של פוספט נאגרה מלוחה ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ביום המחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החלבון מקלטת הדיאליזה ולבצע בדיקת חלבון כימות לקביעת תשואה של GST-AICD. טיהור טיפוסית מ400 מ&quot;ל של התרבות תגרום לתשואות של&gt; 20 מ&quot;ג של חלבון מטוהר בריכוזים של 10-20 מ&quot;ג / מ&quot;ל. Aliquot החלבון לתוך 200 aliquots והקפאה μl ב -80 ° C. </li></ol> 3. מחשוף של תרומבין GST-AICD וטיהור AICD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200 μl ההפשרה של מטוהרי GST-AICD ולהוסיף 20 μl של thromb 1 U / μlפנימה דגירת הלילה בשעת 37 ° C. </li></ol> האיכות והטוהר של תרומבין משתנים באופן ניכר בין יצרנים, ויכולות להיות מקור משמעותי של זיהום. אנו משתמשים בתרומבין מGE Healthcare (ראה טבלה של חומרים כימיים). לאחר דגירת הלילה,&gt; 95% מחלבון ההיתוך יש בקע (1B איור). <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הלילה עם מחשוף תרומבין, סביר להניח שחלק של AICD המשוחרר עבר צבירה והפתרון יכול להופיע מעונן. נקה את החומר מצטבר ידי צנטריפוגה ב20000 XG למשך 30 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant לתוך צינור microfuge מראש מצונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של 50% גלוטתיון-agarose slurry ו50% μl 50 p-aminobenzamidine-agarose slurry להסיר GST ותרומבין, בהתאמה. דגירה עם רוטציה למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בקצרה למשקעים את חרוזי agarose, ולהסיר את supernatant לתוך צינור טרי. חלץ tהוא GST ארבע פעמים יותר עם גלוטתיון-agarose. חילוץ יחיד עם p-aminobenzamidine-agarose מספיק כדי להסיר את 20 U של תרומבין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע בדיקת quantitation חלבון על 5 μl של AICD המטוהרים. תשואות אופייניות מתרבות מ&quot;ל 400 הן 50-100 מיקרוגרם בריכוז של 0.2-0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל. תשואות גבוהות יותר הן אפשריות על ידי ביקוע בכמויות גדולות של GST-AICD. </li></ol> המטוהר AICD צריך להיות מוכן טרי לאפיון ביוכימי / biophysical. חומרים שאינם בשימוש אמורים להיות מושלכים. אפשר גם להתרכז AICD ידי lyophilizing המדגם וresuspending בנפח קטן יותר של 6 חיץ. אם גילוי AICD דורש סופגים (כגון לאחר מלכודת מסנן או assay כתם הנקודה), אחזור אנטיגן על הקרום צריך להתבצע כפי שמתואר על ידי Pimplikar ו12 Suryanarayana. 4. צבירת AICD למיקרוסקופי כוח אטומי (AFM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל טרי AICD בעמ<html> hosphate נאגר מלוח לריכוז של 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בנפח סופי של 15 μl. בשלב זה, תרכובות שונות ו / או חלבונים ניתן להוסיף על מנת לקבוע אם הם מעכבים צבירת AICD. לדוגמה, יש לנו הראינו כי ריכוזי equimolar של ubiquilin-1 למנוע צבירה של AICD בassay 4 זה. </li></ol> אפשר גם לאמצעי תגובה גדולה יותר הכולל לניסויים ביוכימיים כגון מבחני מלכודת סינון ופיזור אור 4. היינו לנו הצלחה בביצוע מבחני מלכודת סינון על תערובות תגובה גדולה כמו 400 μl עם AICD דילול לריכוזים נמוכים כמו 1 מיקרומטר. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום להצטברות תרמית על ידי דוגר את הדגימות ב 43 ° C עם הרעד ב800 סל&quot;ד באפנדורף Thermomixer עבור 48 שעות. טמפרטורה זו נבחרה על בסיס מבחנים שבוחנים מלווה צבירת התרמית של synthase מודל מלווה מצע ציטראט 4,13. </li></ol>&gt; צבירה תרמית היא שיטה נפוצה לגרום למעבר המבני של חלבון מילידי מבנה שאינו ילידים (שהיא בדרך כלל גיליון ביתא עשיר) אשר גורם להיווצרות של אגרגטים מולקולאריים. צבירה תרמית משמשת גם כדי לבחון את תפקודו של מלווים מולקולריים, שגוננו מגזרים הידרופובי מ טביעת אינטראקציות מולקולאריים בלתי הולמות (ובכך לעכב או למנוע צבירת תרמית). <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל את המדגם 20-לקפל במי deionized ו2 μl המקום אל תציץ טרי בקע. ייבש את הדגימה בdessicator בן לילה. יהיה צורך לקבוע באופן אמפירי הדילול האופטימלי להדמיה, וכך כמה דילולים נעים בין 10 - ל 100-קיפול יהיו זהירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו AICD מצטבר באמצעות הפעלת AFM במצב הקשה 14. את cantilevers משמש הם מנופים מצופים זהב מייקר חד ניטריד (MSNL, ברוקר) עם רדיוס קצה נומינלי של 2 ננומטר. טיפוסי קשה אמפליטודות durבאמצעות הדמיה היא 10-20 ננומטר בתדר התהודה של cantilevers (30-50 קילוהרץ). </li></ol> מצאנו כי איכות תמונה וחדות של אגרגטים חלבון שונים תלויה בכח המופעל ואת משך הניסוי. כדי למזער את הפרעות מדגם על ידי הקצה, שמרנו את הכח המופעל נמוך יחסית על ידי שמירה על יחס קבוע של מעל 95% והגבלת הסריקה של כל דגימה לדקות 5-10. עיבוד תמונה בוצע עם WSxM תוכנה (Nanotec). עיבוד תמונה סטנדרטי הורכב ממטוס החיסור והשטחה. המעבדות שלנו משתמשות ב&quot; הבית נבנה &quot;15 AFM interfaced למערכת מסחרית סריקת בדיקת מיקרוסקופ שליטה (Nanotec). 5. נציג תוצאות הביטוי וההעשרה יחסית של GST-AICD מוצג באיור 1 א. לאחר תמוגה, רוב חלבון ההיתוך נמצא בחלק המסיס, ולכן חילוץ מinclusiעל גופו לא נדרש. חומר eluted מעמודת agarose גלוטתיון הוא&gt; 95% טהורים. בהכנה מוצגת באיור 1, הריכוז של חלבון eluted מהעמודה היה 14.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל, והתשואה הייתה 22 מ&quot;ג (מתרבות מוצא של 400 מ&quot;ל). מחשוף של 200 μl הכנת הלילה עם 20 U של תרומבין זה הביא לכמעט 100% ממחשוף חלבון ההיתוך (1B איור). הסכום של תרומבין המשמש הוא נמוך מספיק כדי לא להתגלות על ידי צביעה הכחולה Coomassie (ראה מסלול, 1B &quot;בקע&quot; איור). הסרת תרומבין וGST ביאה לירידה בחלק מחומר, אולם זה היה&gt; 90% טהור עם תשואה בהכנת השיעורים של 70 מיקרוגרם של AICD בריכוז של 0.35 מ&quot;ג / מ&quot;ל. התרשים 1C מציג את תרשים הזרימה לצבירה של AICD וניתוח שלאחר מכן. אגרגטים AICD צפו בי ידי AFM הם בדרך כלל אליפטית / אמורפי, וטווח בגודל 50-100 ננומטר (1D איור, F). מצטברחומר הוא לא ניתן לגילוי כאשר סכום equimolar של מלווה ubiquilin-1 מתווסף לתגובת הצבירה (האיור 1E) 4. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4204/4204fig1.jpg" /> איור 1. טיהור וצבירה של AICD.) מכתימה Coomassie כחול של דגימות שנאספו בכל שלב של תהליך הטיהור. לדגימות uninduced ומושרות, 20 μl של חיידקים כלל היה לרוץ על ג&#39;ל. לשבריר supernatant, 5 μl של lysate (מנפח כולל של 20 מ&quot;ל) היה לרוץ על ג&#39;ל. לשבריר הגלול, הגלולה הייתה resuspended ב 20 מ&quot;ל של חיץ תמוגה, ו 5 μl של חומר זה היה sonicated בsonicator אמבט מים למשך 30 דקות ב 4 ° C לפני העמיס על ג&#39;ל. לflowthrough, 5 μl היה לרוץ על ג&#39;ל. סכומי eluate הועמסו על ג&#39;ל מצוינים. B) ג&#39;ל הצבעוני הכחול Coomassie של uncleaved ובקע GST-AICD (2 μl) ו1 ו 5 &amp; מ &#39;u; l מטוהרי AICD. ג) תרשים זרימה של טיהור AICD, צבירה, וניתוח. D, E) תמונה של נציג AFM מצטבר תרמית AICD בהעדר (ד &#39;) והנוכחות (ה) של המלווה המולקולרי ubiquilin-1. F) היסטוגרמה של התפלגות הגודל של אגרגטים AICD.

<ol>
	<li>De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretases:+enzymes+with+therapeutic+potential+in+Alzheimer+disease.">The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).</li><li>Chang, K. A., Suh, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+roles+of+amyloid+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein.">Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein.</a> BMB reports. 43, 656-663 (2010).</li><li>McLoughlin, D. M., Miller, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FE65+proteins+and+Alzheimer's+disease.">The FE65 proteins and Alzheimer's disease.</a> J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).</li><li>Stieren, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquilin-1+is+a+molecular+chaperone+for+the+amyloid+precursor+protein.">Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).</li><li>Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+structural+changes+in+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+detected+by+NMR.">Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR.</a> J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).</li><li>Ramelot, T. A., Gentile, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+structure+of+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+indicates+preordering+of+structure+for+binding+to+cytosolic+factors.">Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors.</a> Biochem. 39, 2714-2725 (2000).</li><li>Radzimanowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+intracellular+domain+of+the+amyloid+precursor+protein+in+complex+with+Fe65-PTB2.">Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2.</a> EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).</li><li>Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+alters+gene+expression+and+induces+neuron-specific+apoptosis.">The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis.</a> Gene. 475, 1-9 (2011).</li><li>von Rotz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+APP+intracellular+domain+forms+nuclear+multiprotein+complexes+and+regulates+the+transcription+of+its+own+precursor.">The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor.</a> J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).</li><li>Hamid, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+modulates+cellular+calcium+homeostasis+and+ATP+content.">Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content.</a> J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).</li><li>Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APP+intracellular+domain+impairs+adult+neurogenesis+in+transgenic+mice+by+inducing+neuroinflammation.">APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation.</a> PLoS ONE. 5, e11866 (2010).</li><li>Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+APP+intracellular+domain+in+brain+tissue.">Detection of APP intracellular domain in brain tissue.</a> Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).</li><li>Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chaperone+function+using+citrate+synthase+as+nonnative+substrate+protein.">Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein.</a> Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).</li><li>Hansma, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+atomic+force+microscopy+of+DNA.">Recent advances in atomic force microscopy of DNA.</a> Scanning. 15, 296-299 (1993).</li><li>Valbuena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasi-simultaneous+imaging/pulling+analysis+of+single+polyprotein+molecules+by+atomic+force+microscopy.">Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).</li><li>Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction,+purification,+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+human+Fe65-PTB2+in+complex+with+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain.">Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain.</a> Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).</li><li>Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein+interacts+with+flotillin-1,+a+lipid+raft+protein.">The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).</li><li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Notch1+signaling+by+the+APP+intracellular+domain+facilitates+degradation+of+the+Notch1+intracellular+domain+and+RBP-Jk.">Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk.</a> J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).</li><li>Lazarov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport,+amyloid+precursor+protein,+kinesin-1,+and+the+processing+apparatus:+revisited.">Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited.</a> J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).</li><li>Kakuda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equimolar+production+of+amyloid+beta-protein+and+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+from+beta-carboxyl-terminal+fragment+by+gamma-secretase.">Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase.</a> J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).</li><li>Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+under+the+atomic+force+microscope.">Amyloid under the atomic force microscope.</a> Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

בפרוטוקול זה גבשנו הליך לקבלת AICD הטהור ביותר עבור ניתוחים מבניים, biophysical, וביוכימיים. הליך זה אינו דורש ציוד מתוחכם כרומטוגרפיה ולכן הוא נגיש לרוב המעבדות. קבוצות אחרות לא מטוהרות AICD 5-7,16, כולל GST-AICD 17-19, לניתוחים ביוכימיים / מבניים. חסרונות לפרוטוקולים קודמ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> pGEX-4T-1 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9545-49 </td><td></td></tr><tr><td> תרומבין </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-0846-01 </td><td></td></tr><tr><td> אמפיצילין </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP1760 </td><td></td></tr><tr><td> מגיב assay חלבון ברדפורד </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Coomassie כחול </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0786 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (thiogalactopyranoside איזופרופיל-beta-D) </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> I6758 </td><td></td></tr><tr><td> גלוטתיון-agarose </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> G4510 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> p-aminobenzamidine-agarose </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> A7155 </td><td></td></tr><tr><td> קוקטייל מעכב פרוטאז מלא </td><td> רוש </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> קלטות דיאליזת Slide-A-Lyzer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66380 </td><td></td></tr><tr><td> עמודות כרומטוגרפיה </td><td> מדעי אוורגרין </td><td> 208-3367-050 </td><td></td></tr><tr><td> מתחלב </td><td> Avestin, Inc </td><td> EmulsiFlex-C3 </td><td> מומלץ ביותר </td></tr><tr><td> אפנדורף Thermomixer </td><td> אפנדורף </td><td> 022670107 </td><td></td></tr><tr><td> דיסקים יציצו </td><td> טד פלה </td><td> 50-12 </td><td></td></tr><tr><td> cantilevers AFM </td><td> ברוקר </td><td> MSNL-10 </td><td></td></tr><tr><td> WSxM תוכנה </td><td> Nanotec </td><td> N / </td><td> Free הורדה </td></tr></tbody></table>

purification and aggregation of the amyloid precursor protein intracellular domain

חלבון מבשר עמילואיד (APP) הוא חלבון הטרנסממברני אני סוג קשור בפתוגנזה של המחלה (לספירה) אלצהיימר. APP מאופיין בתחום תאי גדול ותחום cytosolic קצר כינה התחום התאי APP (AICD). במהלך התבגרות דרך מסלול ההפרשה, APP ניתן בקע ידי פרוטאזות המכונות α, β, וγ-secretases 1. מחשוף פרוטאוליטי רציף של APP עם β-γ וsecretases מוביל לייצור של פפטיד קטן פרוטאוליטי, Aβ כינה, שהוא amyloidogenic ומרכיב הליבה של פלאק סנילי. AICD גם משוחרר מהקרום לאחר עיבוד סקרטאז, ובאמצעות אינטראקציות עם Fe65 וTip60, יכולה translocate לגרעין להשתתף בויסות שעתוק של גני המטרה מרובים 2,3. אינטראקציות בין חלבונים המעורבים AICD עשויות להשפיע על סחר, עיבוד, ופונקציות סלולריות של הולוגרמות APP וC-terminברי al. אנחנו הראינו לאחרונה שAICD יכול המצרפי במבחנה, ותהליך זה מעוכב על ידי ubiquilin-1 מלווה AD-מעורב מולקולרי 4. באופן עקבי עם ממצאים אלה, AICD חשף תחומים הידרופובי והוא מהותי מופרע במבחנת 5,6, אולם זה מקבל מבנה שניוני יציב כאשר חייב Fe65 7. אנחנו הצענו שubiquilin-1 מונע אינטראקציות בין intramolecular ולא תקינות של AICD, מניעת צבירה במבחנה בתאים שלמים 4. בעוד שרוב המחקרים מתמקדים בתפקידו של APP בפתוגנזה של ספירה, את התפקיד של AICD בתהליך זה אינו ברור. ביטוי של AICD הוכח לגרום לאפופטוזיס 8, לווסת את מסלולי איתות 9, ולהסדיר סיד איתות 10. על הביטוי של AICD וFe65 במודל עכבר מהונדס גורם אלצהיימר כמו 11 פתולוגיה, ולאחרונה AICD זוהה בחזייהבlysates ידי מערבי סופג בעת שימוש בטכניקות אחזור אנטיגן מתאימות 12. כדי להקל על מחקרים מבניים, ביוכימי, וbiophysical של AICD, פתח הליך כדי לייצר כמויות גדולות של חלבון recombinantly AICD הטהור ביותר. בנוסף, אנו מתארים שיטה לזירוז בצבירת תרמית מבחנה של AICD וניתוח על ידי מיקרוסקופ כוח האטומי. בשיטות המתוארות שימושיות לאפיון ביוכימי, biophysical, ומבני של AICD ואת ההשפעות של מלווים מולקולריים על צבירת AICD.

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain at JoVE.com

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

שיטה לטיהור בקנה מידה גדולה של התחום התאי APP (AICD) מתוארת. גם אנו מתארים שיטה כדי לגרום<em&gt; במבחנה</em&gt; צבירת AICD והדמיה על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי. בשיטות המתוארות שימושיות לאפיון ביוכימי / המבני של AICD ואת ההשפעות של מלווים מולקולריים על הצבירה שלו.

טיהור וצבירה של תחום החלבון המבשר עמילואיד התאי

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

purification-aggregation-amyloid-precursor-protein-intracellular

Research

JoVE Journal

Medicine

11.8K Views.  University of Texas Medical Branch. שיטה לטיהור בקנה מידה גדולה של התחום התאי APP (AICD) מתוארת. גם אנו מתארים שיטה כדי לגרום במבחנה צבירת AICD והדמיה על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי. בשיטות המתוארות שימושיות לאפיון ביוכימי / המבני של AICD ואת ההשפעות של מלווים מולקולריים על הצבירה שלו.

Video: Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis difficult1. Definite AD diagnosis is achieved only postmortem, thus establishing presymptomatic, early diagnosis of AD is crucial for developing and administering effective therapies2,3.
Amyloid &beta;-protein (A&beta;) is central to AD pathogenesis. Soluble, oligomeric A&beta; assemblies are believed to affect neurotoxicity underlying synaptic dysfunction and neuron loss in AD4,5. Various forms of soluble A&beta; assemblies have been described, however, their interrelationships and relevance to AD etiology and pathogenesis are complex and not well understood6. Specific molecular recognition tools may unravel the relationships amongst A&beta; assemblies and facilitate detection and characterization of these assemblies early in the disease course before symptoms emerge. Molecular recognition commonly relies on antibodies. However, an alternative class of molecular recognition tools, aptamers, offers important advantages relative to antibodies7,8. Aptamers are oligonucleotides generated by in-vitro selection: systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX)9,10. SELEX is an iterative process that, similar to Darwinian evolution, allows selection, amplification, enrichment, and perpetuation of a property, e.g., avid, specific, ligand binding (aptamers) or catalytic activity (ribozymes and DNAzymes).
Despite emergence of aptamers as tools in modern biotechnology and medicine11, they have been underutilized in the amyloid field. Few RNA or ssDNA aptamers have been selected against various forms of prion proteins (PrP)12-16. An RNA aptamer generated against recombinant bovine PrP was shown to recognize bovine PrP-&beta;17, a soluble, oligomeric, &beta;-sheet-rich conformational variant of full-length PrP that forms amyloid fibrils18. Aptamers generated using monomeric and several forms of fibrillar &beta;2-microglobulin (&beta;2m) were found to bind fibrils of certain other amyloidogenic proteins besides &beta;2m fibrils19. Ylera et al. described RNA aptamers selected against immobilized monomeric A&beta;4020. Unexpectedly, these aptamers bound fibrillar A&beta;40. Altogether, these data raise several important questions. Why did aptamers selected against monomeric proteins recognize their polymeric forms? Could aptamers against monomeric and/or oligomeric forms of amyloidogenic proteins be obtained? To address these questions, we attempted to select aptamers for covalently-stabilized oligomeric A&beta;4021 generated using photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP)22,23. Similar to previous findings17,19,20, these aptamers reacted with fibrils of A&beta; and several other amyloidogenic proteins likely recognizing a potentially common amyloid structural aptatope21. Here, we present the SELEX methodology used in production of these aptamers21.

Selection of Aptamers for Amyloid &#946;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

Aptamers are short ribo-/deoxyribo-oligonucleotides selected by in-vitro evolution methods based on affinity for a specific target. Aptamers are molecular recognition tools with versatile therapeutic, diagnostic, and research applications. We demonstrate methods for selection of aptamers for amyloid &beta;-protein, the causative agent of Alzheimer's disease.

מבחר Aptamers עבור חלבון β עמילואיד, הסוכן סיבתי של מחלת אלצהיימר

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

Neuroscience

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (A&#946;42) and amyloid beta 40 (A&#946;40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase - styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (&gt;95%) A&#946;42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the A&#946;40 peptide with identical success and without the need to alter the method.

Herein we report a tailored HPLC purification protocol that yields high-purity amyloid beta 42 (A&#946;42) and amyloid beta 40 (A&#946;40) peptides, capable of oligomer formation. Amyloid beta is a highly aggregation prone, hydrophobic peptide implicated in Alzheimer&#39;s disease. The amyloidogenic nature of the peptide makes its purification a challenge.

פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי תשואות גבוהות טוהר עמילואיד בטא 42 ו עמילואיד בטא 40 פפטידים, מסוגל גיבוש oligomer

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Biochemistry

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain. The ionic detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) effectively solubilizes natively folded proteins in brain tissue allowing the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from a wide range of neurodegenerative proteinopathies, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease and amyotrophic lateral sclerosis, and prion diseases. Human control and AD postmortem brain tissues were homogenized and sedimented by ultracentrifugation in the presence of sarkosyl to enrich detergent-insoluble protein aggregates including pathologic phosphorylated tau, the core component of neurofibrillary tangles in AD. Western blotting demonstrated the differential solubility of aggregated phosphorylated-tau and the detergent-soluble protein, Early Endosome Antigen 1 (EEA1) in control and AD brain. Proteomic analysis also revealed enrichment of &#946;-amyloid (A&#946;), tau, snRNP70 (U1-70K), and apolipoprotein E (APOE) in the sarkosyl-insoluble fractions of AD brain compared to those of control, consistent with previous tissue fractionation strategies. Thus, this simple enrichment protocol is ideal for a wide range of experimental applications ranging from Western blotting and functional protein co-aggregation assays to mass spectrometry-based proteomics.

An abbreviated fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain is described.

העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. The ability to readily detect the formation of these fibers under various experimental conditions is essential for understanding their potential function. Many methods have been used to detect the fibers, but not without some drawbacks. For example, electron microscopy (EM), or staining with Congo Red or Thioflavin T often requires purification of the fibers. On the other hand, semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis (SDD-AGE) allows detection of the SDS-resistant amyloid-like fibers in the cell extracts without purification. In addition, it allows the comparison of the size difference of the fibers. More importantly, it can be used to identify specific proteins within the fibers by Western blotting. It is less time consuming and more easily accessible to a wider number of labs. SDD-AGE results often show variable degree of heterogeneity. It raises the question whether part of the heterogeneity results from the dissociation of the protein complex during the electrophoresis in the presence of SDS. For this reason, we have employed a second dimension of SDD-AGE to determine if the size heterogeneity seen in SDD-AGE is truly a result of fiber heterogeneity in vivo and not a result of either degradation or dissociation of some of the proteins during electrophoresis. This method allows fast, qualitative confirmation that the amyloid or amyloid-like fibers are not partially dissociating during the SDD-AGE process.

Here we use two-dimensional semi-denaturing agarose gel electrophoresis to confirm the presence of amyloid-like fibers of heterogeneous size and exclude the possibility that the size heterogeneity is due to dissociation of the amyloid fibers during the gel running process.

השימוש בג'ל מימדי Agarose דטרגנט למחצה denaturing שני לאשר גודל הטרוגניות של סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer is widely accepted as the leading neurotoxin in the progress of Alzheimer&#39;s disease (AD) and is considered to be the crucial event in the pathogenesis of AD. Therefore, A&#946; oligomer inhibitors might prevent neurodegeneration and have the potential to be developed as disease-modifying treatments of AD. However, different formation protocols of A&#946; oligomer might lead to oligomers with different characteristics. Moreover, there are not many methods to effectively screen A&#946;1-42 oligomer inhibitors. An A11 antibody can react with a subset of toxic A&#946;1-42 oligomer with anti-parallel &#946;-sheet structures. In this protocol, we describe how to prepare an A11-positive A&#946;1-42 oligomer-rich sample from a synthetic A&#946;1-42 peptide in vitro and to evaluate relative amounts of A11-positive A&#946;1-42 oligomer in samples by a dot blotting analysis using A11 and A&#946;1-42-specific 6E10 antibodies. Using this protocol, inhibitors of A11-positive A&#946;1-42 oligomer can also be screened from semi-quantitative experimental results.

This protocol describes how to prepare A&#946; oligomers from a synthetic peptide in vitro and to evaluate relative amounts of A&#946; oligomer by a dot blotting analysis.

הכנה A11-חיוביות β-עמילואיד אוליגומר והערכה באמצעות נקודה סופג ניתוח

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג&#39;ל

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Biology

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

טיהור Hsp104, Disaggregase חלבון

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

דור מהיר של עמילואיד מחלבונים שפת אם<em&gt; במבחנה</em

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease (AD), amyloid-beta peptides form protofibrils in the extracellular space, which act as seeds that gradually grow and mature into large amyloid plaques. Despite this basic understanding, current knowledge of the amyloid fibril structure, composition, and deposition patterns in the brain is limited. One major barrier has been the inability to isolate highly purified amyloid fibrils from brain extracts. Affinity purification and laser capture microdissection-based approaches have been previously used to isolate amyloids but are limited by the small quantity of material that can be recovered. This novel, robust protocol describes the biochemical purification of amyloid plaque cores using sodium dodecyl sulfate (SDS) solubilization with sucrose density gradient ultracentrifugation and ultrasonication and yields highly pure fibrils from AD patients and AD model brain tissues. Mass spectrometry (MS)-based bottom-up proteomic analysis of the purified material represents a robust strategy to identify nearly all the primary protein components of amyloid fibrils. Previous proteomic studies of proteins in the amyloid coronae have revealed an unexpectedly large and functionally diverse collection of proteins. Notably, after refining the purification strategy, the number of co-purifying proteins was reduced by more than 10-fold, indicating the high purity of the isolated SDS insoluble material. Negative staining and immuno-gold electron microscopy allowed confirmation of the purity of these preparations. Further studies are required to understand the spatial and biological attributes that contribute to the deposition of these proteins into amyloid inclusions. Taken together, this analytical strategy is well-positioned to increase the understanding of amyloid biology.

This biochemical purification method with mass spectrometry-based proteomic analysis facilitates the robust characterization of amyloid fibril cores, which may accelerate the identification of targets for preventing Alzheimer's disease.

טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות פיבריל עמילואידיות מהמוח

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the sequential cleavage of Amyloid Precursor Protein (APP) by &#946; and &#947;-secretases. Despite the importance of A&#946; to AD pathology, the subcellular localization of these cleavages is not well established. Work in our laboratory and others implicate the endosomal/lysosomal system in APP processing after internalization from the cell surface. However, the intracellular trafficking of APP is relatively understudied.
While cell-surface proteins are amendable to many labeling techniques, there are no simple methods for following the trafficking of membrane proteins from the Golgi. To this end, we created APP constructs that were tagged with photo-activatable GFP (paGFP) at the C-terminus. After synthesis, paGFP has low basal fluorescence, but it can be stimulated with 413 nm light to produce a strong, stable green fluorescence. By using the Golgi marker Galactosyl transferase coupled to Cyan Fluorescent Protein (GalT-CFP) as a target, we are able to accurately photoactivate APP in the trans-Golgi network. Photo-activated APP-paGFP can then be followed as it traffics to downstream compartments identified with fluorescently tagged compartment marker proteins for the early endosome (Rab5), the late endosome (Rab9) and the lysosome (LAMP1). Furthermore, using inhibitors to APP processing including chloroquine or the &#947;-secretase inhibitor L685, 458, we are able to perform pulse-chase experiments to examine the processing of APP in single cells.
We find that a large fraction of APP moves rapidly to the lysosome without appearing at the cell surface, and is then cleared from the lysosome by secretase-like cleavages. This technique demonstrates the utility of paGFP for following the trafficking and processing of intracellular proteins from the Golgi to downstream compartments.

While the transport of cell surface proteins is relatively easily studied, visualizing the trafficking of intracellular proteins is much more difficult. Here, we use constructs incorporating photoactivatable GFP and demonstrate a method to accurately follow the amyloid precursor protein from the Golgi apparatus to down-stream compartments and follow its clearance.

הדמיה הסחר תאיים של APP עם GFP Photoactivatable

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

טיהור וצבירה של תחום החלבון המבשר עמילואיד התאי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video