ويدعم هذا العمل من قبل HD058629-R01 لIEZ

1. إعداد أطباق ECM الثقافة المغلفة أو Coverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون ECM عن طريق إذابة الركيزة ECM في PBS (Dulbecco في الفوسفات مخزنة المالحة، إينفيتروجن، # 14040-133). تصفية باستخدام حقنة 0.2 ملم فلتر (VWR، # 28145-495) وتجميد مأخوذة في -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الحل ECM الأسهم في PBS إلى التركيز المطلوب. لMaxGel، في تمييع DMEM (لDulbecco معدلة النسر متوسطة، إينفيتروجن، # 11995-065). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان سيتم إجراء المناعي، تعقيم 12 مم coverslips الزجاج الدائرية (VWR، # 89015-724) عن طريق غمس في الإيثانول والسماح للهواء الجاف. وينبغي أن يتم ذلك في غطاء محرك السيارة الصفحي العقيمة. إذا لن يتم تنفيذ المناعي انتقل إلى الخطوة 1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان تعقيم coverslips في كل بئر من لوحة بئر 24 (كورنينج، # 3526). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من محلول مخفف إلى الركيزة كل بئر من 24 لوحة جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح قبالة حل ECM ويغسل ثلاث،ه مرات في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح قبالة PBS واستخدامها على الفور أو ملفوفة في parafilm وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع. </li></ol> 2. إعداد أدوات تشريح يتم إعداد لوحات Sylgard مع الفحم المضافة لكل بروتوكول صناعة لل. الخلفية السوداء للمقاومة هذه اللوحات تقدم الدعم لأسفل تعلق الجنين ولون جيد يقدم النقيض مما يسهل تصور الجنين شفافة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد لوحات تزن مباشرة إلى كأس ثلاثي صب على الجزء التوازن A 150 غ ز السائل الجزء 15 B، و 1 غرام مسحوق الفحم (أدوات دقيقة العالمي، # SYLG184). مزيج معا باستخدام عصا خشبية أو المصاصة اللسان خافضة. تصب في الزجاج أو البلاستيك الأطباق 100 سم. استخدام البوتان الشعلة الصغيرة التي عقدت حوالي 10 إلى 12 بوصة فوق أطباق لحرق أي فقاعات. أغطية مكان على لوحات والسماح للجلوس لا يقل عن 24 ساعة لتعيين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد أدوات تشريح إدراج دبوس Minutien (0.1 مم diameteويمكن استخدام R) إلى حامل دبوس (الأدوات العلمية الجميلة، # # 26018-17 26002-10 و، على التوالي) بدلا من الإبر قياس 26 (BD، # 309597) عازمة بزاوية قائمة مع المعونة من ملقط تشريح والصكوك. شحذ طالب دومون # 5 ملقط (أدوات العلوم الجميلة، # 91150-20) باستخدام الحجر شحذ (الأدوات العلمية الجميلة، # 29008-22). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم جميع الأدوات تشريح مع الايثانول 70٪ قبل الاستخدام. </li></ol> 3. جمع الأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس توقيت الحوامل عند 8.5 coitum آخر أيام وفقا للوائح لجنة استخدام الحيوان وإزالة الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرحم مكان في صحن بتري بلاستيكية مع PBS العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الرحم مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح الجنين إزالة بعناية من deciduas باستخدام زوج من ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأغشية خارج الجنين وانقاذ لالتنميط الجيني إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجنين عن طريق عد somites المرحلة. المراحل المثالية لجعل إإكسبلنتس لتحليل الخلوية بيهوavior خلال الارتفاع أضعاف العصبية أن يكون بين المراحل 6 و 10 الجسيدة عندما طيات العصبية هي مجرد بداية لرفع وقبل التشكل الرئيسية للاللحمة المتوسطة الجمجمة تأخذ مكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الجنين في برنامج تلفزيوني. المكان في لوحة سوداء مع sylgard DMEM التي لا تحتوي على الفينول الحمراء (إينفيتروجن، # 21063-029). إزالة الأغشية خارج الجنين وانقاذ لالتنميط الجيني إذا لزم الأمر. </li></ol> 4. إعداد إإكسبلنتس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تركيز المجهر على التكبير أعلى مستوى ممكن على المنطقة رئيس الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تخفيضات بإبرة تشريح في كل يد. استخدم أحد إبرة لعقد الأنسجة في مكان والآخر لجعل التخفيضات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس الجنين سابقة لrhombomeres. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع على طول خط الوسط لرئيس شطر إلى نصفين متساويين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع حول هامش الخارجي من الرأس وخط الوسط. وهذه التخفيضات إزالة قمة premigratory والأديم الظاهر السطحي على الحدود الخارجي ولوحة أمام القردود في خط الوسط. فإن الأنسجة المتبقية تكون يزدرع وسوف تحتوي على ترحيل قمة العصبية الجمجمة، الأديم المتوسط ​​مجاور للمحور والأديم الظاهر السطحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما يتم قطع الأنسجة، وإزالة الحطام من تشريح الطبق باستخدام معقم باستور ماصة. هذا يمنع الخلط بين يزدرع مع الحطام تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل بلطف بواسطة يزدرع pipeting صعودا وهبوطا مع طرف ماصة ميكرولتر 20 وpipetman. سيؤدي هذا إلى إزالة الخلايا المرفقة فضفاضة ومنع حواف خشنة على إإكسبلنتس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار بعناية كل يزدرع في حوالي 10 ميكرولتر من السائل باستخدام ماصة 20 ميكرولتر نصيحة وpipetman ومكان في مركز للثقافة المغلفة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من وسائل الإعلام تستكمل مع FBS الثقافة 15٪ لتغطية يزدرع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة مكان في حاضنة مرطب زراعة الأنسجة (5٪ CO 2، 37 ° C) لمدة 1-2 ساعة للسماح لليزدرع لنعلق على الجزء السفلي من الطبق. عرض بشكل دوري للتأكد من أن لا تجف يزدرعمن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تولى يزدرع، إضافة إلى كل بعناية DMEM 250 ميكرولتر جيدا تستكمل مع FBS 10٪ التي تم تحسنت إلى 37 ° C في بالحمام المائي. بمجرد أن تعلق إإكسبلنتس أنها لن تتحرك عندما تهتز برفق لوحة تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة إلى صحن زراعة الأنسجة حاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة، سيتم إإكسبلنتس ترتبط بقوة والخلايا تبدأ في الهجرة. يمكن في هذا الوقت أن تضاف كلاء الدوائية الى وسائل الاعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 ساعة بعد الطلاء، وسوف هاجروا من الخلايا إإكسبلنتس. يمكن للمسافة هاجر يمكن تصور والمصورة. نتوقف عادة الثقافة في هذه المرحلة منذ إإكسبلنتس تبدأ تظهر علامات بقاء أطول مع انخفاض حضانات. A ويمكن أيضا وصمة عار الحيوية مثل البرتقال أو الأزرق التريبان أكريدين أن تستخدم للتحقق من صلاحية يزدرع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن في هذه المرحلة الحصول عليها الصور لتوثيق المسافة وعدد الخلايا التي تهاجر من يزدرع. بدلا من ذلك، إذا كانت مطلية إإكسبلنتس على coverslips،يمكن ان تكون ثابتة والتحليلات التي أجريت لتصور المناعى البروتينات المثيرة للاهتمام. </li></ol> الخطوات الحاسمة في البروتوكول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع إإكسبلنتس من حجم تقريبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح كافة الحطام قبالة لوحة تشريح تشريح كما كنت تشريح لتجنب الخلط بين الحطام الأنسجة explanted المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما إإكسبلنتس الطلاء في الآبار أو على coverslips تأكد من وضع قطرة من وسائل الاعلام مع يزدرع في مركز جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح يزدرع الوقت الكافي لإرفاق قبل اغراق بشكل جيد مع وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن تكون موحدة ظروف العلاج لكل الركيزة الاختبار وكيل الدوائية المستخدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن إجراء اثنين من كل إإكسبلنتس الجنين (واحد من اليسار وواحد من حق الأنبوب العصبي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع عند اختبار هجرة الخلايا من خطوط الماوس متحولة تحت ظروف تجريبية مختلفة، واحدة يزدرع متحولة في السيطرة على المجموعة والآخر في المجموعة التي تلقت العلاج. </li></ol> استكشاف الأخطاء وإصلاحها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا إإكسبلنتس لا نعلق، وزيادة الوقت المخصص للمرفق. في تجربتنا، ما يقرب من نصف إإكسبلنتس لا نعلق وأكبر إإكسبلنتس تلتزم بشكل أكثر كفاءة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا إإكسبلنتس نعلق على هامش جيدا سوف يكون من الصعب الصورة. تأكد من وضع إإكسبلنتس في وسط البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من الناحية المثالية سوف يكون إإكسبلنتس نفس الحجم تقريبا. ومع ذلك، يمكن تصحيح التفاوت في حجم يزدرع لاستخدام القطر من إإكسبلنتس كعامل التصحيح عندما quanitating الهجرات من الخلايا من إإكسبلنتس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تلوث يحدث تأكد تستخدم معقمة ظروف العمل. يجب تعقيم جميع الأدوات وأسطح العمل مع الايثانول 70٪. يجب Pipets وأطباق بتري تكون جديدة ومعقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا إإكسبلنتس يتم الحصول على فقدت خلال تشريح، وإزالة الحطام بشكل دوري لمنع فقدان يزدرع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتقان تشريح تستغرق وقتا طويلا، ويأخذ الممارسة. OPTIالمال التكبير، وأدوات تشريح حادة ومساعدة الإبر. </li></ol>

<ol>
	<li>Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurulation+in+the+cranial+region--normal+and+abnormal.">Neurulation in the cranial region--normal and abnormal.</a> Journal of anatomy. 207, 623-635 (2005).</li><li>Fleming, A., Gerrelli, D., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+normal+and+abnormal+neurulation:+evidence+from+embryo+culture+studies.">Mechanisms of normal and abnormal neurulation: evidence from embryo culture studies.</a> The International Journal of Developmental Biology. 41, 199-212 (1997).</li><li>Copp, A. J., Greene, N. D., Murdoch, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+mammalian+neurulation.">The genetic basis of mammalian neurulation.</a> Nat. Rev. Genet. 4, 784-793 (2003).</li><li>Tuckett, F., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+fibronectin,+laminin+and+entactin+in+the+neurulating+rat+embryo+studied+by+indirect+immunofluorescence.">The distribution of fibronectin, laminin and entactin in the neurulating rat embryo studied by indirect immunofluorescence.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 94, 95-112 (1986).</li><li>Tuckett, F., Morriss-Kay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcian+blue+staining+of+glycosaminoglycans+in+embryonic+material:+effect+of+different+fixatives.">Alcian blue staining of glycosaminoglycans in embryonic material: effect of different fixatives.</a> The Histochemical Journal. 20, 174-182 (1988).</li><li>Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+mesenchyme+in+mouse+neural+fold+elevation.+II.+Patterns+of+hyaluronate+synthesis+and+distribution+in+embryos+developing+in+vitro.">The role of the mesenchyme in mouse neural fold elevation. II. Patterns of hyaluronate synthesis and distribution in embryos developing in vitro.</a> The American Journal of Anatomy. 188, 133-147 (1990).</li><li>Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+mesenchyme+in+mouse+neural+fold+elevation.+I.+Patterns+of+mesenchymal+cell+distribution+and+proliferation+in+embryos+developing+in+vitro.">The role of the mesenchyme in mouse neural fold elevation. I. Patterns of mesenchymal cell distribution and proliferation in embryos developing in vitro.</a> The American Journal of Anatomy. 188, 121-132 (1990).</li><li>Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+mesenchymal+cell+and+hyaluronate+distribution+correlate+with+in+vivo+elevation+of+the+mouse+mesencephalic+neural+folds.">Changes in mesenchymal cell and hyaluronate distribution correlate with in vivo elevation of the mouse mesencephalic neural folds.</a> Anat. Rec. 226, 383-395 (1990).</li><li>Yoshida, T., Vivatbutsiri, P., Morriss-Kay, G., Saga, Y., Iseki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+in+mammalian+craniofacial+mesenchyme.">Cell lineage in mammalian craniofacial mesenchyme.</a> Mech. Dev. 125, 797-808 (2008).</li><li>Noden, D. M., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relations+and+interactions+between+cranial+mesoderm+and+neural+crest+populations.">Relations and interactions between cranial mesoderm and neural crest populations.</a> Journal of anatomy. 207, 575-601 (2005).</li><li>Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+origins+and+interactions+in+the+mammalian+skull+vault.">Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault.</a> Dev. Biol. 241, 106-116 (2002).</li><li>Morriss-Kay, G. M., Tuckett, F., Solursh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+Streptomyces+hyaluronidase+on+tissue+organization+and+cell+cycle+time+in+rat+embryos.">The effects of Streptomyces hyaluronidase on tissue organization and cell cycle time in rat embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 98, 59-70 (1986).</li><li>Morriss-Kay, G., Tuckett, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localisation+of+chondroitin+sulphate+proteoglycans+and+the+effects+of+chondroitinase+ABC+in+9-+to+11-day+rat+embryos.">Immunohistochemical localisation of chondroitin sulphate proteoglycans and the effects of chondroitinase ABC in 9- to 11-day rat embryos.</a> Development. , 106-787 (1989).</li><li>Tuckett, F., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparitinase+treatment+of+rat+embryos+during+cranial+neurulation.">Heparitinase treatment of rat embryos during cranial neurulation.</a> Anat. Embryol. (Berl). 180, 393-400 (1989).</li><li>Sarkar, A. A., Zohn, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hectd1+regulates+intracellular+localization+and+secretion+of+Hsp90+to+control+cellular+behavior+of+the+cranial+mesenchyme.">Hectd1 regulates intracellular localization and secretion of Hsp90 to control cellular behavior of the cranial mesenchyme.</a> The Journal of Cell Biology. 196, 789-800 (2012).</li><li>Zohn, I. E., Anderson, K. V., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hectd1+ubiquitin+ligase+is+required+for+development+of+the+head+mesenchyme+and+neural+tube+closure.">The Hectd1 ubiquitin ligase is required for development of the head mesenchyme and neural tube closure.</a> Dev. Biol. 306, 208-221 (2007).</li><li>Chen, Z. F., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist+is+required+in+head+mesenchyme+for+cranial+neural+tube+morphogenesis.">Twist is required in head mesenchyme for cranial neural tube morphogenesis.</a> Genes Dev. 9, 686-699 (1995).</li><li>Tzahor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonists+of+Wnt+and+BMP+signaling+promote+the+formation+of+vertebrate+head+muscle.">Antagonists of Wnt and BMP signaling promote the formation of vertebrate head muscle.</a> Genes Dev. 17, 3087-3099 (2003).</li><li>Lumsden, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+epithelium+and+the+role+of+neural+crest+cells+in+the+initiation+of+the+mammalian+tooth+germ.">Spatial organization of the epithelium and the role of neural crest cells in the initiation of the mammalian tooth germ.</a> Development. 103, 155-169 (1988).</li><li>Newgreen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+explants+of+embryonic+chick+mesenchymes+and+epithelia+on+fibronectin+and+laminin.">Spreading of explants of embryonic chick mesenchymes and epithelia on fibronectin and laminin.</a> Cell and tissue Research. 236, 265-277 (1984).</li><li>Peyton, S. R., Ghajar, C. M., Khatiwala, C. B., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+ECM+mechanics+and+cytoskeletal+tension+as+important+regulators+of+cell+function.">The emergence of ECM mechanics and cytoskeletal tension as important regulators of cell function.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 47, 300-320 (2007).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

طريقة تطبيقها هنا يوفر الفحص قوية لدراسة سلوك خلايا اللحمة المتوسطة الجمجمة. ويمكن استخدام بالإضافة إلى تحليلات ثابت المعروضة هنا، ويعيش التجارب في مجال التصوير مشرق أو بالاشتراك مع التعبير عن البروتينات التي تحمل علامات GFP لدراسة السلوكيات من الخلايا في الوقت الحقيقي كما تهاجر من يزدرع. للتجارب التصوير الحي، يمكن أن توصف إإكسبلنتس مع مبادرة ديزرتك الصناعية أو للتمييز هجرة قمة العصبية الأديم المتوسط ​​مجاور للمحور من، ROSA-YFP؛ يمكن أن تستخدم لجنة المساواة العرقية Wnt1 أو خطوط المعدلة وراثيا الأخرى؛ Mesp1-ROSA لجنة المساواة العرقية أو YFP. ويمكن أيضا الجمجمة اللحمة المتوسطة، ECM التفاعلات أن تدرس الاستفادة من هذا الاختبار يزدرع. نحن هنا لوحة إإكسبلنتس على ركائز ECM المختلفة التي موجودة في الجمجمة اللحمة المتوسطة لإظهار أن الخلايا تهاجر على هذه بدرجات مختلفة وأن يؤثر على ECM مورفولوجيا الخلايا. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ إإكسبلنتس في مصفوفة ثلاثية الأبعاد للوصول إلى سلوكيات سلفي هذا السياق ليرة سورية. هذا الاختبار هو يزدرع قابلة للتعديل لتحليل أثر التلاعب الجيني والدوائي على السلوكيات اللحمة المتوسطة الجمجمة لتحليل الاشارات الجوهرية وخارجي يمكن أن تنظم الهجرة وتعديل. على سبيل المثال، تستخدم في هذا الاختبار نحن دراساتنا أن نستشف دور Hsp90 إفراز فائض في السلوكيات الشاذة الخلوية في اللحمة المتوسطة Hectd1 الجمجمة متحولة 15. في هذه التجارب، وتعامل مع أننا إإكسبلنتس مكافحة Hsp90 الأجسام المضادة، Hsp90 البروتين، وgeldanamycin DMA (amelioride ثنائي ميثيل) لمنع إفراز Hsp90 لإثبات أن سلوك غير طبيعي للخلايا متحولة Hectd1 ومن المقرر أن تتجاوز 15 Hsp90 خارج الخلية. ويمكن استخدام نهج مماثل لتشريح عقاقيري مسارات إضافية الكامنة التشكل طبيعية أو غير طبيعية من اللحمة المتوسطة الجمجمة. بعد الانتهاء من الفحص، يمكن تحليل والخلايا المهاجرة إإكسبلنتس من قبل مجموعة من الأساليب. على سبيل المثال، C التحليلات المناعىأن تستخدم لدراسة وتوطين البروتينات بالغة بالنسبة للتحركات الخلية. ويمكن أيضا أن تستخدم تحليلات Transcriptome لتحديد كيفية العلاج تؤثر التعبير الجيني. واحد الحد كبير من هذه التقنية هو أنه لا السلوكيات نموذج في أبعاد ثلاثة لأنها يمكن أن تحدث في الجسم الحي. ويمكن استخدام التعديل من حيث هي جزء لا يتجزأ بروتوكول إإكسبلنتس في مصفوفة ثلاثية الأبعاد (مثل matrigel) جنبا إلى جنب مع التعبير حجرات البروتين بعلامات الفلورسنت الخلوية اللازمة لمعالجة هذه المسألة. حتى لو أجريت هذه التعديلات، وتجارب أخرى لربط السلوكيات ينظر في هذا الاختبار فيفو السابقين مع تلك الموجودة في الجسم الحي يكون ضروريا. وتشمل القيود الأخرى على عدد كبير من الأجنة اللازمة لتوليد عدد كاف لتوليد بيانات هامة بشكل ثابت. الأهم من ذلك، تشريح بسيط نسبيا، فإنه لا تتطلب الممارسة لاتقان.

إغلاق أنبوب العصبي في المنطقة الجمجمة يحدث بين 8.5 يوم الجنينية (E8.5) و 9.5 في جنين فأر. فشل لإغلاق الأنبوب العصبي بشكل صحيح في نتائج الرئيسي في انعدام الدماغ، وهو عيب خلقي شائع في البشر والهيكلية غير متوافق مع الحياة. يتم إنشاء القوات التي تدفع رأسي إغلاق الأنبوب العصبي من الأنسجة العصبية نفسها على حد سواء والبشرة المحيطة بها واللحمة المتوسطة 3. في التوسع معينة من اللحمة المتوسطة الجمجمة يعتقد أنه ضروري لرفعة لل1،2 أضعاف العصبية الجمجمة. واللحمة المتوسطة الجمجمة غنية في البروتينات البروتينات في الغليكوزيلاتي ECM معينة مثل كبريتات الهيبارين بروتيوغليكان، الكبريتات شوندروتن و 4-8 هيالورونات. خلافا لما حدث في جنين الدجاج حيث الخلايا العصبية قمة الهجرة من الأنبوب العصبي الظهري بعد إغلاق الأنبوب العصبي، وقمة العصبية في جنين فأر يهاجر في نفس الوقت أن نبدأ في طيات العصبية صISE (بعد مرحلة الجسيدة 5). وبالتالي تكون العصيبة خلال الماوس في الجنين، ويتكون من الجمجمة اللحمة المتوسطة الخلايا المشتقة من قمة العصبية الأديم المتوسط ​​ومجاور للمحور. هي التي يسببها قمة العصبية الأديم المتوسط ​​مجاور للمحور والسكان في أوقات مختلفة في التنمية؛ المترجمة في مواقع مختلفة في الجنين وتطوير في الهياكل المختلفة 9،10. والأديم المتوسط ​​مجاور للمحور تنبع من خط البدائية ويهاجر إلى المنطقة الأمامية من الجنين لوحة تكمن وراء المفترض العصبية. هو فعل قمة العصبية عند تقاطع العصبية لوحة الأديم الظاهر والبشرة، ليخضع لالظهارية اللحمة المتوسطة والانتقال delaminates قبيل الارتفاع أضعاف العصبية في الأجنة القوارض. الخلايا العصبية قمة على طول مسارات الهجرة النمطية في الأديم المتوسط ​​مجاور للمحور تحت الأديم الظاهر إلى قوس خيشومي، الجبهية الأنفية واللحمة المتوسطة المحيط بالعين. الأديم المتوسط ​​مجاور للمحور فإن المساهمة في بعض من عظام الجمجمة قبو والعضلات في الوجه، أما الوه العرف العصبي تسهم في عظام الجمجمة أخرى من وجهه بالإضافة إلى الأعصاب القحفية 9-11. ويمكن للالأديم المتوسط ​​مجاور للمحور والأنساب قمة العصبية تتميز بشكل مختلف من قبل لجنة المساواة العرقية، وMesp1 Wnt1-خطوط الماوس المعدلة وراثيا لجنة المساواة العرقية، على التوالي 9. وقد يستدل على الدور الأساسي للاللحمة المتوسطة الجمجمة في إغلاق الأنبوب العصبي من حيث التجارب علاج الأجنة القوارض مع ECM تعطيل عوامل مثل هيالورونيداز، chondroitinase ABC، heparitinase أو ديازو OXO نورلوسين-(DON) خلال ضعاف تكون العصيبة إغلاق الأنبوب العصبي 7، 12-14. في هذه التجارب، وكشف التحليل النسيجي للأقسام ثابتة بعد dysmorphogeneis تكون العصيبة المرتبطة من اللحمة المتوسطة الجمجمة 7،12-14. ومع ذلك، منذ كان وكيل ماسخة الوصول إلى الأنسجة المتعدد، فإنه لا يزال يتعين تحديد إذا كان هو حقا اللحمة المتوسطة الجمجمة والأنسجة المستهدفة. لدعم الاستنتاج بأن هذا النسيجأمر ضروري لتكون العصيبة، ويبدو غير طبيعي في الجمجمة اللحمة المتوسطة على التحليلات النسيجية في بعض المسوخ الماوس مع اختراج الدماغ 15-17. ومع ذلك، في معظم الحالات، لم يتم تأثير الطفرة على سلوك الخلوية من اللحمة المتوسطة الجمجمة معالجتها. وقد وضعت لدينا يزدرع فيفو السابقين لدراسة مقايسة مباشرة نتيجة لطفرة جينية أو التلاعب الدوائية على سلوك الخلايا اللحمة المتوسطة الجمجمة 15. هذا الاختبار هي مماثلة لتلك التي نشرتها Tzahor وآخرون 2003 للوصول إلى إمكانية التفريق من اللحمة المتوسطة الجمجمة الذي يكمن وراء rhombomeres 18 سنة ما عدا لدينا تعديل تشريح يزدرع لدراسة خصائص السكان المهاجرة من أكثر من اللحمة المتوسطة الجمجمة الأمامية التي تكمن وراء العصبية الأمامي لوحة. أسلوبنا هو أيضا تعديل المقايسات يزدرع أجريت في الجنين الدجاج لتحليل السلوك المهاجرة من قمة العصبية مع كهالخلافات ذ. وقد explanted الاستعدادات السابقة للقمة العصبية أو الأديم المتوسط ​​مجاور للمحور الخلفي أكثر 19،20. وعلاوة على ذلك، خلال الارتفاع أضعاف العصبية في الجنين الدجاج، قمة العصبية لم هاجر بعد من أنبوب من العصبية الظهرية، وبالتالي اتخذت من إإكسبلنتس الأديم المتوسط ​​مجاور للمحور الأمامي ولن تحتوي على خلايا العصبية قمة. في مقايسة لدينا، يتم إعداد إإكسبلنتس اللحمة المتوسطة الجمجمة التي تتكون من الأديم المتوسط ​​مجاور للمحور، والأديم الظاهر العصبي قمة السطحية ومطلي على ركيزة. لا يمكن أن يؤديها التلاعب التجريبية بما في ذلك عزل إإكسبلنتس من المسوخ الجينية، تصفيح إإكسبلنتس على ECM مختلفة أو العلاجات الدوائية. ويمكن تحليل الخلايا تهاجر من يزدرع والمسافة، عدد والسلوك ومقارنة بين مجموعات العلاج. وبالإضافة إلى ذلك، هذا هو إعداد قابلة للتعديل لتحليل الهجرة الخلوية بواسطة تقنيات التصوير الحية. بعد التجربة الهجرة، يمكن أن تكون ثابتة إإكسبلنتس وتعرض لتحليل المناعى إلى الفراءTHER توضيح تأثير العلاجات. وعلى العموم، وبروتوكول المعروضة هنا هي فيفو السابقين بسيطة الفحص للتحقيق في سلوك اللحمة المتوسطة الجمجمة. كتجربة ممثل، ونحن الاستفادة من هذه مقايسة لدراسة الهجرة من اللحمة المتوسطة الجمجمة على ركائز مختلفة خارج الخلية.

an explant assay for assessing cellular behavior of the cranial mesenchyme

ويستمد الجهاز العصبي المركزي من لوحة العصبية التي تمر سلسلة من الحركات المعقدة تخلقية مما أدى إلى تشكيل الأنبوب العصبي في عملية تعرف باسم تكون العصيبة. تكون العصيبة أثناء، ويعتقد التشكل من اللحمة المتوسطة والذي أدى إلى لوحة العصبية لدفع أضعاف الارتفاع العصبية. وتتألف الجمجمة من اللحمة المتوسطة الأديم المتوسط ​​مجاور للمحور والخلايا العصبية قمة. خلايا اللحمة المتوسطة شكل الجمجمة وشبكه pourous يتألف من خلايا النجمية الشكل والاختلاط خارج الخلية المصفوفة (ECM) التي تدعم مسارات طيات العصبية. تكون العصيبة خلال واللحمة المتوسطة الجمجمة يخضع النمطية مما أدى إلى إعادة ترتيب توسعها ويعتقد هذه الحركات لتوفير قوة دافعة للارتفاع أضعاف العصبية. ومع ذلك، لا تزال سيئة درس المسارات الخلوية والسلوكيات التي تدفع الجمجمة التشكل اللحمة المتوسطة. التفاعلات بين ECM وخلايا اللحمة المتوسطة تسا الجمجمة underlyالسلوكيات ه الخلية. نحن هنا وصف فيفو السابقين بسيطة مقايسة يزدرع وضعت لوصف سلوك هذه الخلايا. هذا الاختبار هو قابلة للتعديل لتلاعب الدوائية لتشريح إشارات الممرات المشتركة والتحليلات التصوير الحي لوصف سلوك مزيد من هذه الخلايا. نقدم تجربة ممثل مما يدل على فائدة هذا الاختبار في تشخيص خصائص المهاجرة من اللحمة المتوسطة الجمجمة على مجموعة متنوعة من المكونات ECM.

يظهر مظهر خلايا اللحمة المتوسطة المهاجرة من إإكسبلنتس الجمجمة في الشكل 2. نحن اختبار الهجرة على ركائز ECM المختلفة التي موجودة في الجمجمة خلال اللحمة المتوسطة تكون العصيبة بما في ذلك [فيبرونكتين] (100 ملغ / مل؛ سيغما # F1141)، Laminin (100 ملغ / مل؛ سيغما # L2020)، ECM MaxGel (1:500 التخفيف في DMEM ؛ سيغما # E0282) وحمض الهيالورونيك (1 ملغ / مل؛ سيغما، # 53747). الخلايا تفشل في ترحيل من يزدرع عندما لا ECM موجود (البيانات لا تظهر) وجميع ركائز اختبار معتمد من الهجرة الخلايا. كل من الشكل وكذلك أحجام الخلايا التي تهاجر من إإكسبلنتس يعتمد على الركيزة. هذا ومن المتوقع والدراسات السابقة تثبت أن القوات الميكانيكية التي تولدها الخلايا التفاعل مع ECM مختلفة تؤثر على كل شكل وخصائص الخلايا المهاجرة 21. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4245/4245fig1.jpg" fo:contenتي العرض = &quot;5.5in&quot; FO: SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4245/4245fig1highres.jpg&quot; /&gt; الشكل 1. إعداد إإكسبلنتس. (A) إعداد إإكسبلنتس، وتشريح E8.5 من الأجنة والأنسجة deciduas خارج الجنين. (B) يتم تشريح الجنين من رؤساء الأمامي الجسم إلى rhombomeres. يتم إعداد إإكسبلنتس عن طريق إزالة الأنسجة من خط الوسط والحواف الخارجية للرئيس لإزالة لوحة أمام القردود في خط الوسط وقمة العصبية وpremigratory الأديم الظاهر السطحي على الحدود، على التوالي. (C) تعد إإكسبلنتس عن طريق خفض بعيدا نسيج من خط الوسط والحواف الخارجية للرئيس لإزالة لوحة أمام القردود في خط الوسط وقمة العصبية وpremigratory الأديم الظاهر السطحي على الحدود. (D) يتم وضعها في مجلد وإإكسبلنتس صغيرة من وسائل الاعلام على أطباق ECM المغلفة / coverslips وسمح لإرفاق قبل إضافة المزيد من وسائل الإعلام. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4245/4245fig2.jpg" /> الشكل 2. كانت مطلية هجرة الخلايا من اللحمة المتوسطة الجمجمة إإكسبلنتس مطلي على ركائز مختلفة. إإكسبلنتس على [فيبرونكتين]، Laminin، ECM MaxGel أو حمض الهيالورونيك وتصويرها بعد 48 ساعة في الثقافة. شريط حجم = 200 مم.

Watch this Scientific Journal Video about An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme at JoVE.com

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

ويخضع اللحمة المتوسطة الجمجمة الحركات المثيرة التي توفر morphogenic المرجح قوة دافعة للارتفاع طيات العصبية<sup&gt; 1،2</sup&gt;. نحن هنا وصف بسيط<em&gt; خارج الجسم</em&gt; يزدرع مقايسة لتوصيف سلوكيات الخلوية من خلال اللحمة المتوسطة الجمجمة تكون العصيبة. هذا الاختبار لديها العديد من التطبيقات بما في ذلك كونها قابلة للتلاعب الدوائية والتحليلات التصوير الحية.

مقايسة لتقييم سلوك يزدرع الخلوية من اللحمة المتوسطة القحف

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

an-explant-assay-for-assessing-cellular-behavior-cranial

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Views.  Children's National Medical Center. ويخضع اللحمة المتوسطة الجمجمة الحركات المثيرة التي توفر morphogenic المرجح قوة دافعة للارتفاع طيات العصبية 1،2. نحن هنا وصف بسيط خارج الجسم يزدرع مقايسة لتوصيف سلوكيات الخلوية من خلال اللحمة المتوسطة الجمجمة تكون العصيبة. هذا الاختبار لديها العديد ?...

Video: An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

جهاز ميكروفلويديك مع أنماط Groove لدراسة السلوك الخليوي

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based medicine and/or its carrier may elicit cellular toxicity. For assessment of such cytotoxicity, a common methodology is largely dependent upon utilization of the 3-(4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay which has been widely used as a colorimetric approach based on the activity of mitochondrial dehydrogenase enzymes in cells. In this current investigation, MCF-7 cells were inoculated in 96-well plate and at 50% confluency they were treated with different nanopolyplexes and subjected to MTT assay after 24 hours. Water soluble yellow MTT is metabolized by the metabolically active cells to the water insoluble purple formazan, which is further dissolved in dimethylsulfoxide and Sornson s buffer pH 10.5. The resultant product can be quantified by spectrophotometry using a plate reader at 570 nm.

The MTT assay is an easy and reproducible colorimetric assay for evaluation of cell viability based on reduction of yellow MTT and production of water insoluble purple formazan. Here, the viability of MCF-7 cells upon treatment of nanogenomedicine has been evaluated.

سمية Nanogenomedicine الخلوية في الخط الخليوي MCF - 7 : فحص MTT

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical research. The hypoxic chamber offers a simple system to control oxygenation in standard culture vessels, but lacks precise temporal and spatial control over the oxygen concentration at the cell surface, preventing its application in studying a variety of physiological phenomena. Other systems have improved upon the hypoxic chamber, but require specialized knowledge and equipment for their operation, making them intimidating for the average researcher. A microfabricated insert for multiwell plates has been developed to more effectively control the temporal and spatial oxygen concentration to better model physiological phenomena found in vivo. The platform consists of a polydimethylsiloxane insert that nests into a standard multiwell plate and serves as a passive microfluidic gas network with a gas-permeable membrane aimed to modulate oxygen delivery to adherent cells. The device is simple to use and is connected to gas cylinders that provide the pressure to introduce the desired oxygen concentration into the platform. Fabrication involves a combination of standard SU-8 photolithography, replica molding, and defined PDMS spinning on a silicon wafer. The components of the device are bonded after surface treatment using a hand-held plasma system. Validation is accomplished with a planar fluorescent oxygen sensor. Equilibration time is on the order of minutes and a wide variety of oxygen profiles can be attained based on the device design, such as the cyclic profile achieved in this study, and even oxygen gradients to mimic those found in vivo. The device can be sterilized for cell culture using common methods without loss of function. The device's applicability to studying the in vitro wound healing response will be demonstrated.

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

Fabrication and validation of an add-on platform that offers enhanced control over the spatial and temporal oxygenation in a 6-well plate. The device is adaptable to a number of culture systems and can be used to investigate the effects of oxygen on wound healing.

تصنيع وتشغيل إدخال الأوكسجين للثقافات الخلوية منتسب

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

مولد الرمع الفحص : خلايا منتسب

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Electroporation من اللحمة المتوسطة الجمجمة

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

أداة تحليلية يحدد مقدار التغييرات الخلوية الصرف من التقاط صور ثلاثية الأبعاد الإسفار

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

فصل الأدمة الجنينية الماوس الوجه واللحمة المتوسطة

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

يعيش التصوير الفحص لتقييم أدوار كا<sup&gt; 2 +</sup&gt; وSphingomyelinase في إصلاح مسام تشكيل الجروح السمية

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

قياس آثار البكتيريا على<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; السلوك باستخدام مقايسة الاحتفاظ البيض

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate underlying a cell must be manipulated. While hydrogels with graded stiffness and long-term migration assays have proven useful in durotaxis studies, immediate, acute responses to local changes in substrate tension allow focused study of individual cell movements and subcellular signaling events. To repeatably test the ability of cells to sense and respond to the underlying substrate stiffness, a modified method for application of acute gradients of increased tension to individual cells cultured on deformable hydrogels is used which allows for real time manipulation of the strength and direction of stiffness gradients imparted upon cells in question. Additionally, by fine tuning the details and parameters of the assay, such as the shape and dimensions of the micropipette or the relative position, placement, and direction of the applied gradient, the assay can be optimized for the study of any mechanically sensitive cell type and system. These parameters can be altered to reliably change the applied stimulus and expand the functionality and versatility of the assay. This method allows examination of both long term durotactic movement as well as more immediate changes in cellular signaling and morphological dynamics in response to changing stiffness.

Mechanical forces are important for controlling cell migration. This protocol demonstrates the use of elastic hydrogels that can be deformed using a glass micropipette and a micromanipulator to stimulate cells with a local stiffness gradient to elicit changes in cell structure and migration.

فحص Durotaxis خلية واحدة لتقييم السيطرة الميكانيكية للحركة الخلوية والأحداث الإشارات ذات الصلة

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...