עבודה זו נתמכת על ידי R01-HD058629 לIEZ

1. הכנת מאכלי ECM המצופים תרבות או Coverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון מניית ECM ידי המסת מצע ECM ב PBS (של Dulbecco פוספט שנאגר מלוח, Invitrogen, # 14040-133). סנן באמצעות מזרק 0.2 מ&quot;מ מסנן (VWR, # 28145-495) וקיפאון בaliquots ב-80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל פתרון מניית ECM ב PBS לריכוז רצוי. לMaxGel, לדלל בDMEM (שינוי הנשר הבינוני של Dulbecco, Invitrogen, # 11995-065). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יבוצע immunofluorescence, לעקר 12 coverslips זכוכית עגולה מ&quot;מ (VWR, # 89015-724) על ידי הטבילה באתנול ולאפשר לייבוש באוויר. זה צריך להיעשות בברדס מינרית סטרילי. אם immunofluorescence לא יבוצע דלג לשלב 1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום לעקר coverslips בכל אחד גם מצלחת גם 24 (קורנינג, # 3526). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל של תמיסה מדוללת מצע לכל אחד גם מצלחת 24 היטב ולדגור בטמפרטורת חדר למשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון ECM ולשטוף threזמני דואר בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את PBS ולהשתמש באופן מיידי או עטוף בparafilm ומאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות. </li></ol> 2. הכנת כלים לנתיחה צלחות Sylgard עם פחם הוסיף מוכנות לפרוטוקול של הייצור. הרקע השחור העמיד בלוחות אלה מספק תמיכה עבור מצמיד את העובר והצבע מציע ניגודיות טובה המאפשרת לדמיין את העובר השקוף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין צלחות שוקלים ישירות לתוך כוס שלוש לשפוך על חלק איזון 150 גרם נוזלי 15 גר &#39;חלק ב&#39; וגרם אבקת פחם 1 (מכשירי Precision העולם, # SYLG184). מערבב יחד בעזרת מקל ארטיק מעץ או depressor לשון. יוצק לתוך כוס או 100 סנטימטר מנות פלסטיק. השתמש במבער גז קטן שנערך בערך 10 עד 12 סנטימטרים מעל את הכלים כדי לשרוף את כל בועות. מכסי מקום על צלחות ותנו לו לשבת לפחות 24 שעות כדי להגדיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את כלי נתיחה להוסיף Minutien סיכה (0.1 המ&quot;מ diameter) לבעל סיכה (כלים מדעיים, יפים # # 26002-10 ו26018-17, בהתאמה) לחלופין 26 מחטי מד (BD, # 309597) הכפופות בזווית ישרה בעזרת מלקחיים עשוי לשמש כביתור מכשירים. דומונט # 5 מלקחיים חדדו סטודנטים (כלי מדע פיין, # 91150-20) באמצעות אבן השחזה (כלים מדעיים פיין, # 29008-22). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל כלי הנתיחה עם אתנול 70% לפני השימוש. </li></ol> 3. אוסף של עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את עכבר ההריון תזמן בימי ההודעה coitum 8.5 בהתאם לתקנות ועדה לשימוש בבעלי חיים ולהסיר רחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רחם מקום בצלחת פטרי פלסטיק עם סטרילי PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרחם פעם עם PBS סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ נתיחת עובר להסיר בזהירות מdeciduas באמצעות זוג המלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת קרומי extraembryonic ולשמור לgenotyping במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב עובר על ידי ספירת somites. השלבים האידיאליים לעשות explants לנתח הסלולרי Behאביאור בגובה קיפול עצבי יהיה בין 6 ל 10 שלבי somite כאשר הקפלים העצביים רק מתחילים לרומם ולפני המורפוגנזה העיקרית של mesenchyme הגולגולת מתרחשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את העובר בPBS. מקום בצלחת sylgard שחורה עם DMEM המכיל לא אדום פנול (Invitrogen, # 21063-029). הסר את קרומי extraembryonic ולשמור לgenotyping במידת הצורך. </li></ol> 4. הכנת explants <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקד מחדש מיקרוסקופ בהגדלה הגבוהה ביותר האפשרית על אזור הראש של העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע חתכים עם מחט לנתיחה בכל יד. השתמש במחט אחת להחזיק את הרקמה במקום ואחר לקיצוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הראש של העובר הקדמי לrhombomeres. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך לאורך קו האמצע לחוצה את הראש לשני חצי שווים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך סביב לשולי הראש וקו האמצע. קיצוצים אלה יסירו את פסגת premigratory ואקטודרם פני שטח בגבול החיצוני וצלחת prechordal בקו האמצע. הרקמה הנותרת תהיה explant ותכיל פסגה נודדת גולגולת העצבית, מזודרם ואקטודרם הפרקסיאלית פני שטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כרקמה היא לחתוך, להסיר שאריות גזורות מהתבשיל באמצעות פיפטה פסטר סטרילי. זה מונע מבלבל explant עם הפסולת הגזורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות explant ידי pipeting מעלה ומטה עם 20 פיפטה קצה μl וpipetman. זו תסיר תאים רופפים מצורפים ולמנוע קצוות משוננים על explants. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להרים את כל explant בכ 10 μl של נוזל בעזרת 20 טיפ פיפטה μl וpipetman ומקום במרכז התרבות המצופית היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של תקשורת התרבות והשלמה עם 15% FBS לכסות explant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת מקום בתרבות רקמות חממת humidified (5% CO 2, 37 המעלות צלזיוס) במשך 1-2 שעות כדי לאפשר explant לצרף לתחתית הקערה. צפו תקופתי כדי לוודא שלא יתייבש explantהחוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר explant צרף, מוסיף בזהירות לכל גם 250 DMEM μl השלים עם FBS 10% שכבר חמם עד 37 מעלות צלזיוס בwaterbath. ברגע explants צרף הם לא יזוזו בעת הצלחת מתערערת בעדינות מתחת למיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר מנה לרקמות תרבות חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, את explants יהיה מחובר היטב ותאים יתחילו להגר. בשלב זה סוכנים תרופתיים ניתן להוסיף לתקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 שעות לאחר ציפוי, תאים הגרו מexplants. המרחק הגר יכול להיות חזותי והדמיה. אנחנו בדרך כלל לעצור את התרבות בשלב זה מאז explants מתחיל להראות סימנים של כדאיות פחתה עם incubations הארוך יותר. יכול לשמש גם חיוני כתם כגון acridine כתום או כחול trypan כדי לבדוק את הכדאיות של explant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה ניתן לרכוש תמונות לתעד את המרחק ומספר התאים שנודדים מexplant. לחלופין, אם explants היה מצופה על coverslips,הם יכולים להיות קבועים וניתוחי immunohistochemical בצעו לדמיין חלבונים של עניין. </li></ol> צעדים קריטיים בפרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך explants של בערך באותו הגודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות את כל פסולת הנתיחה מהצלחת לנתח כמו שאתה לנתח כדי להימנע מפסולת מבלבל עם רקמת explanted הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר explants ציפוי בבארות או בcoverslips מקפיד להציב טיפה של תקשורת עם explant במרכז היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר explant מספיק זמן כדי לצרף לפני ההצפה היטב עם תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנאי טיפול צריכים להיות אחידים לכל מצע מבחן ותרופתי בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני explants יכול להתבצע מכל עובר (אחד מימין ואחד מהימין של הצינור העצבי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשבדוק הגירה של תאים מקווי עכבר מוטציה תחת תנאי ניסוי שונים, לשים explant 1 מוטציה בקבוצת הביקורת והשנייה בקבוצה שטופלה. </li></ol> פתרון בעיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ייכשל explants לצרף, להגדיל את הזמן המוקצב לקובץ מצורף. מניסיוננו, כמחצית מexplants לא לצרף וexplants הגדול יותר לדבוק בצורה יעילה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם explants לצרף לפריפריה של באר שזה יהיה קשה לתמונה. הקפד למקם explants במרכז הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן אידיאלי explants יהיה בערך באותו הגודל. עם זאת, הבדלים בגודל explant ניתן לתקן לשימוש בקוטר של explants כגורם תיקון כאשר quanitating נדידה של תאים מexplants. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם זיהום מתרחש להיות בטוח תנאי עבודה סטריליים נמצאים בשימוש. כל הכלים ומשטחי עבודה צריכים להיות מעוקרים עם אתנול 70%. Pipets וצלחות פטרי צריך להיות חדשים וסטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם explants מקבל אבד במהלך הנתיחה, מעת לעת להסיר פסולת כדי למנוע לאבד explant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאסטרינג הנתיחה היא גוזל זמן ודורשת תרגול. Optimal גדלה, כלים חדים נתיחה ועזרת מחטים. </li></ol>

<ol>
	<li>Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurulation+in+the+cranial+region--normal+and+abnormal.">Neurulation in the cranial region--normal and abnormal.</a> Journal of anatomy. 207, 623-635 (2005).</li><li>Fleming, A., Gerrelli, D., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+normal+and+abnormal+neurulation:+evidence+from+embryo+culture+studies.">Mechanisms of normal and abnormal neurulation: evidence from embryo culture studies.</a> The International Journal of Developmental Biology. 41, 199-212 (1997).</li><li>Copp, A. J., Greene, N. D., Murdoch, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+mammalian+neurulation.">The genetic basis of mammalian neurulation.</a> Nat. Rev. Genet. 4, 784-793 (2003).</li><li>Tuckett, F., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+fibronectin,+laminin+and+entactin+in+the+neurulating+rat+embryo+studied+by+indirect+immunofluorescence.">The distribution of fibronectin, laminin and entactin in the neurulating rat embryo studied by indirect immunofluorescence.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 94, 95-112 (1986).</li><li>Tuckett, F., Morriss-Kay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcian+blue+staining+of+glycosaminoglycans+in+embryonic+material:+effect+of+different+fixatives.">Alcian blue staining of glycosaminoglycans in embryonic material: effect of different fixatives.</a> The Histochemical Journal. 20, 174-182 (1988).</li><li>Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+mesenchyme+in+mouse+neural+fold+elevation.+II.+Patterns+of+hyaluronate+synthesis+and+distribution+in+embryos+developing+in+vitro.">The role of the mesenchyme in mouse neural fold elevation. II. Patterns of hyaluronate synthesis and distribution in embryos developing in vitro.</a> The American Journal of Anatomy. 188, 133-147 (1990).</li><li>Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+mesenchyme+in+mouse+neural+fold+elevation.+I.+Patterns+of+mesenchymal+cell+distribution+and+proliferation+in+embryos+developing+in+vitro.">The role of the mesenchyme in mouse neural fold elevation. I. Patterns of mesenchymal cell distribution and proliferation in embryos developing in vitro.</a> The American Journal of Anatomy. 188, 121-132 (1990).</li><li>Morris-Wiman, J., Brinkley, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+mesenchymal+cell+and+hyaluronate+distribution+correlate+with+in+vivo+elevation+of+the+mouse+mesencephalic+neural+folds.">Changes in mesenchymal cell and hyaluronate distribution correlate with in vivo elevation of the mouse mesencephalic neural folds.</a> Anat. Rec. 226, 383-395 (1990).</li><li>Yoshida, T., Vivatbutsiri, P., Morriss-Kay, G., Saga, Y., Iseki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+in+mammalian+craniofacial+mesenchyme.">Cell lineage in mammalian craniofacial mesenchyme.</a> Mech. Dev. 125, 797-808 (2008).</li><li>Noden, D. M., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relations+and+interactions+between+cranial+mesoderm+and+neural+crest+populations.">Relations and interactions between cranial mesoderm and neural crest populations.</a> Journal of anatomy. 207, 575-601 (2005).</li><li>Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+origins+and+interactions+in+the+mammalian+skull+vault.">Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault.</a> Dev. Biol. 241, 106-116 (2002).</li><li>Morriss-Kay, G. M., Tuckett, F., Solursh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+Streptomyces+hyaluronidase+on+tissue+organization+and+cell+cycle+time+in+rat+embryos.">The effects of Streptomyces hyaluronidase on tissue organization and cell cycle time in rat embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 98, 59-70 (1986).</li><li>Morriss-Kay, G., Tuckett, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+localisation+of+chondroitin+sulphate+proteoglycans+and+the+effects+of+chondroitinase+ABC+in+9-+to+11-day+rat+embryos.">Immunohistochemical localisation of chondroitin sulphate proteoglycans and the effects of chondroitinase ABC in 9- to 11-day rat embryos.</a> Development. , 106-787 (1989).</li><li>Tuckett, F., Morriss-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparitinase+treatment+of+rat+embryos+during+cranial+neurulation.">Heparitinase treatment of rat embryos during cranial neurulation.</a> Anat. Embryol. (Berl). 180, 393-400 (1989).</li><li>Sarkar, A. A., Zohn, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hectd1+regulates+intracellular+localization+and+secretion+of+Hsp90+to+control+cellular+behavior+of+the+cranial+mesenchyme.">Hectd1 regulates intracellular localization and secretion of Hsp90 to control cellular behavior of the cranial mesenchyme.</a> The Journal of Cell Biology. 196, 789-800 (2012).</li><li>Zohn, I. E., Anderson, K. V., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hectd1+ubiquitin+ligase+is+required+for+development+of+the+head+mesenchyme+and+neural+tube+closure.">The Hectd1 ubiquitin ligase is required for development of the head mesenchyme and neural tube closure.</a> Dev. Biol. 306, 208-221 (2007).</li><li>Chen, Z. F., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist+is+required+in+head+mesenchyme+for+cranial+neural+tube+morphogenesis.">Twist is required in head mesenchyme for cranial neural tube morphogenesis.</a> Genes Dev. 9, 686-699 (1995).</li><li>Tzahor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonists+of+Wnt+and+BMP+signaling+promote+the+formation+of+vertebrate+head+muscle.">Antagonists of Wnt and BMP signaling promote the formation of vertebrate head muscle.</a> Genes Dev. 17, 3087-3099 (2003).</li><li>Lumsden, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+epithelium+and+the+role+of+neural+crest+cells+in+the+initiation+of+the+mammalian+tooth+germ.">Spatial organization of the epithelium and the role of neural crest cells in the initiation of the mammalian tooth germ.</a> Development. 103, 155-169 (1988).</li><li>Newgreen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+explants+of+embryonic+chick+mesenchymes+and+epithelia+on+fibronectin+and+laminin.">Spreading of explants of embryonic chick mesenchymes and epithelia on fibronectin and laminin.</a> Cell and tissue Research. 236, 265-277 (1984).</li><li>Peyton, S. R., Ghajar, C. M., Khatiwala, C. B., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+ECM+mechanics+and+cytoskeletal+tension+as+important+regulators+of+cell+function.">The emergence of ECM mechanics and cytoskeletal tension as important regulators of cell function.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 47, 300-320 (2007).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

השיטה מיושמת כאן מספקת assay חזק כדי לבחון את התנהגותם של תאי mesenchyme גולגולת. בנוסף לניתוחים סטטיים שהוצגו כאן, לחיות ניסויי הדמיה בשדה בהיר או בשילוב עם ביטוי של חלבוני ה-GFP שכותרתו, יכול להיות מועסק על מנת לבחון את התנהגותם של תאים בזמן אמת כפי שהם נודדים מexplant. לניסויי הדמיה חיים, explants יכול להיות מתויג עם DiI או להבדיל הגירה של רכס עצבי ממזודרם הפרקסיאלית, רוזה-YFP; Mesp1-cre או Rosa-YFP; Wnt1-cre או קווים הטרנסגניים אחרים יכול לשמש. אינטראקציות גולגולת mesenchyme-ECM גם ניתן לבחון ניצול assay explant זה. כאן אנו explants צלחת על מצעי ECM שונים שנמצאים בmesenchyme גולגולתי להראות כי תאים נודדים על אלה בדרגות שונות ושECM משפיע על המורפולוגיה של התאים. יתר על כן, explants יכול להיות מוטבע במטריצה ​​תלת ממדים כדי לגשת להתנהגויות של cells בהקשר זה. assay explant זה amendable לניתוח של ההשפעה של מניפולציות גנטיות ותרופתיות על התנהגויות mesenchyme גולגולת לניתוח אותות פנימיים וחיצוניים שיכול לווסת ולשנות הגירה. לדוגמה, אנו מנוצלים assay זה במחקרים שלנו להבחין בתפקיד של Hsp90 הפרשה עודפת בהתנהגויות החריגות בסלולריות mesenchyme גולגולתי מוטצית Hectd1 15. בניסויים אלה, התייחסו explants עם נוגדן אנטי Hsp90, Hsp90 חלבון, geldanamycin וDMA (amelioride דימתיל) כדי לחסום את ההפרשה של Hsp90 להוכיח כי ההתנהגות החריגה של תאים מוטנטים Hectd1 נובעת Hsp90 15 תאיים עודפים. גישות דומות יכולות לשמש פרמקולוגית לנתח מסלולים נוספים העומדים בבסיס המורפוגנזה נורמלית או לא נורמלית של mesenchyme גולגולתי. לאחר הבדיקה תושלם, explants ותאים נודדים יכולים להיות מנותח על ידי שורה של שיטות. לדוגמה, ג ניתוחים immunohistochemicalלהיות מועסק על מנת לבחון את הלוקליזציה של חלבונים חשובים לתנועות תא. ניתוחי transcriptome גם יכולים להיות מועסקים על מנת לקבוע כיצד ישפיע טיפול על ביטוי גנים. מגבלה משמעותית אחד של טכניקה זו היא שזה לא התנהגויות מודל בשלושה ממדים כפי שהם מתרחשים בגוף חי. השינוי של הפרוטוקול בי explants מוטבע במטריצה ​​תלת ממדים (למשל matrigel), יחד עם ביטוי של תאים סלולריים חלבון מסומן ניאון יכול להיות מועסק הכרחי כדי לטפל בבעיה זו. גם אם שינויים אלה בוצעו, ניסויים נוספים כדי לקשר בין התנהגויות שנראו בassay זה vivo לשעבר עם אלה in vivo יהיו צורך בכך. מגבלות אחרות כוללות מספר הגדול של עוברים הנדרשים כדי לייצר כמות מספקת כדי להפיק נתונים סטטי משמעותיים. והכי חשוב, הנתיחה היא פשוטה יחסית, זה דורש תרגול כדי לשלוט.

סגירת צינור עצבית באזור הגולגולת מתרחשת בין 8.5 עובריים היום (E8.5) ו -9.5 בעבר העכבר. כישלון לסגור כראוי הצינור העצבי בתוצאות הראש בanencephaly, מום מלידה מבנית נפוץ בבני אדם ואינו מתיישב עם חיים. הכוחות המניעים את סגירת צינור עצבית cephalic נוצרים משתי רקמות העצביות עצמו וסביבתו והאפידרמיס mesenchyme 3. בהרחבה מסוימת של mesenchyme הגולגולת נחשב לחיוני לגובה של 1,2 הקפלים העצבי קרניאלי. Mesenchyme גולגולתי הוא עשיר בחלבוני ECM בחלבונים מסוימים, כגון glycosylated proteoglycans ההפרין סולפט, כונדרואיטין סולפטים ו4-8 hyaluronate. שלא כמו בעובר העוף שבו תאי רכס עצביים להגר מצינור העצבי הגבה לאחר סגירת צינור עצבית, הרכס העצבי בעובר העכבר נודד באותו הזמן שהקפלים העצביים מתחילים rISE (אחרי שלב 5 somite). כך במהלך neurulation בעבר העכבר, mesenchyme הגולגולת מורכב מתאים שמקורם ברכס העצבי ומזודרם הפרקסיאלית. רכס עצבי ואוכלוסיות מזודרם הפרקסיאלית מושרים בזמנים שונים בהתפתחות; מקומי בתפקידים שונים בעובר להתפתח במבנים שונים 9,10. מזודרם הפרקסיאלית מקורו התכונה הראשונית ונודד לאזור הקדמי של העובר שבבסיס כל הצלחת העצבית המשוערת. הרכס העצבי מושרה בצומת של הצלחת העצבית ואקטודרם אפידרמיס, עובר לאפיתל mesenchyme מעבר וdelaminates רק לקראת גובה קיפול עצבי בעובר המכרסם. תאי רכס עצביים נודדים לאורך שבילים סטריאוטיפיים במזודרם הפרקסיאלית subectodermal לקשת branchial, frontonasal וmesenchyme periocular. מזודרם הפרקסיאלית יתרום לחלק מעצמותיו של קמרון הגולגולת ושרירים של פן, ואילו הדואר עצבי פסגה תתרום לעצמות אחרות של הגולגולת והפנים, בנוסף לעצבי גולגולת 9-11. מזודרם הפרקסיאלית ושושלות רכס עצביות יכולים להיות מסומן באופן דיפרנציאלי, על ידי Mesp1-cre וקווי עכבר מהונדס Wnt1-cre, בהתאמה 9. התפקיד החיוני של mesenchyme הגולגולת בסגירת צינור עצבית כבר הסיק מניסויים שבו טיפול בעוברים עם מכרסמי ECM שיבוש סוכנים כגון hyaluronidase, chondroitinase ABC, heparitinase או Diazo-אוקסו-norleucine (דון) במהלך סגירת neurulation הלקויה העצבית צינור 7, 12-14. בניסויים אלה, ניתוח היסטולוגית של קטעים סטטיים בעקבות neurulation חשף dysmorphogeneis קשורים של mesenchyme גולגולתי 7,12-14. עם זאת, מאחר שסוכן טרטוגנים היה גישה לרקמות מרובות, עדיין לא נקבע אם mesenchyme הגולגולת הוא באמת רקמת המטרה. בתמיכה למסקנה שרקמה זוחיוני לneurulation, mesenchyme גולגולתי מופיע חריג על ניתוחים היסטולוגיים בכמה עכברים עם מוטציות exencephaly 15-17. ובכל זאת, ברוב המקרים, ההשפעה של המוטציה על ההתנהגות התאית של mesenchyme גולגולתי לא טופלה. אנחנו פתחנו assay explant vivo לשעבר ישירות לבחון את התוצאה של מוטציה גנטית או מניפולציה תרופתית על התנהגותם של תאי mesenchyme גולגולת 15. בדיקה זו דומה לזו שפורסמה על ידי צחור et al 2003 לגשת פוטנציאל ההתמיינות של mesenchyme הגולגולת שנמצאה בבסיס את rhombomeres 18 מלבד ששונינו נתיחת explant כדי ללמוד את מאפייני הנדידה של אוכלוסיות קדמיות יותר של mesenchyme גולגולתי שבבסיס העצבי קדמי צלחת. השיטה שלנו היא גם שינוי של מבחני explant מבוצע בעובר העוף כדי לנתח את התנהגות הנדידה של הרכס העצבי עם keהבדלי y. הכנות קודמות explanted רכס העצבי או מזודרם הפרקסיאלית האחורי יותר 19,20. כמו כן, במהלך גובה קיפול עצבי בעובר העוף, הפסגה העצבית עדיין לא הגרה מצינור העצבי הגבה ובכך explants נלקח ממזודרם הפרקסיאלית הקדמי לא מכיל תאי רכס עצביים. בבדיקה שלנו, explants mesenchyme גולגולת מורכבת ממזודרם הפרקסיאלית, רכס עצבי ואקטודרם משטח מוכן ומצופה על מצע. מניפולציה ניסויית כולל בידוד של מוטציות גנטיות explants מ, ציפוי explants על ECM השונה או טיפולים תרופתיים יכולה להתבצע. תאים נודדים מexplant והמרחק, מספר וההתנהגות יכולים להיות מנותחים והשוואה בין קבוצות טיפול. בנוסף, הכנה זו היא amendable לניתוחים של נדידה סלולרית על ידי שיטות הדמיה בשידור חייה. לאחר ניסוי ההגירה, explants יכול להיות קבוע ונתונים לניתוחי immunohistochemical לפרווהTher להבהיר את ההשפעה של טיפולים. באופן כללי, הפרוטוקול שהוצג כאן הוא assay vivo לשעבר פשוט כדי לחקור את ההתנהגות של mesenchyme גולגולתי. כניסוי מייצג, אנו מנצלים assay זה לבחון את ההגירה של mesenchyme גולגולת על מצעים תאיים שונים.

an explant assay for assessing cellular behavior of the cranial mesenchyme

מערכת העצבים המרכזית נובעת מהצלחת העצבית שעוברת סדרה של תנועות המוךפו&quot;גנטי המורכבות וכתוצאה מכך ההיווצרות של הצינור העצבי בתהליך המכונה neurulation. במהלך neurulation, המורפוגנזה של mesenchyme שעומד בבסיס הצלחת העצבית האמינה לנהוג גובה קיפול עצבי. Mesenchyme הגולגולת מורכב ממזודרם הפרקסיאלית ותאי רכס עצביים. התאים של צורת גולגולת mesenchyme meshwork pourous המורכב מתאי stellate ומתערב בצורת גדילים תאיים מטריקס (ECM) התומכים הקפלים העצביים. במהלך neurulation, mesenchyme הגולגולת עובר שחלופים סטריאוטיפיים וכתוצאה מההתרחבות שלה ותנועות אלה הם האמינו כדי לספק כוח מניע לגובה קיפול עצבי. עם זאת, בשבילים ובהתנהגויות המניעות סלולריות המורפוגנזה mesenchyme גולגולתי נותרים למדו בצורה גרועה. אינטראקציות בין ECM והתאים של thes בבסיס גולגולת mesenchymeהתנהגויות תא דואר. כאן אנו מתארים assay פשוט vivo לשעבר explant המציא כדי לאפיין את התנהגותם של תאים אלה. בדיקה זו היא amendable למניפולציות תרופתיות לנתח ניתוחי הדמיה חיות האותות המעורבים ולאפיין את התנהגותם של תאים אלה עוד יותר. אנו מציגים ניסוי נציג מדגים את התועלת של בדיקה זו באפיון מאפייני הנדידה של mesenchyme גולגולתי במגוון של רכיבי ECM.

המראה של תאים הנודדים מexplants mesenchyme גולגולת מוצג באיור 2. בדקנו הגירה על מצעי ECM שונים שנמצאים בmesenchyme הגולגולת במהלך neurulation כוללים פיברונקטין (100 מ&quot;ג / מ&quot;ל; סיגמא # F1141), laminin (100 מ&quot;ג / מ&quot;ל; סיגמא # L2020), MaxGel ECM (1:500 דילול בDMEM ; סיגמא # E0282) וחומצה היאלורונית (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל; סיגמא, # 53747). תאים מצליחין להעביר מexplant כאשר אין ECM הוא הווה (נתונים לא מוצגים) ואת כל המצעים נבדקו הגירה נתמכת של התאים. גם צורתה, כמו גם את הגודל של תאים שנודדים מexplants תלויה במצע. זה צפוי כמו מחקרים קודמים מראים כי הכוחות המכאניים שנוצרו על ידי אינטראקציה של תאים עם ECM השונה להשפיע היא על הצורה ומאפייני נדידה של תאים 21. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4245/4245fig1.jpg" fo:content-width = &quot;5.5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4245/4245fig1highres.jpg&quot; /&gt; איור 1. הכנת explants. () להכין explants, E8.5 עוברים הם גזורים מdeciduas ורקמות extraembryonic. (ב) ראשי Embryo הם גזורים מקדמיים לגוף rhombomeres. Explants מוכן על ידי הסרת רקמה מקו האמצע והשולים החיצוניים של הראש להסיר את צלחת prechordal בקו האמצע והרכס העצבי premigratory ואקטודרם פני שטח בגבול, בהתאמה. (ג) explants מוכן על ידי גזירה מרקמות מקצות קו האמצע וחיצוניים של הראש להסיר את צלחת prechordal בקו האמצע ופסגת premigratory העצבית ואקטודרם משטח בגבולות. (ד) explants ממוקם בנפח קטן של מדיה במנות / coverslips מצופות ECM ואפשר לצרף לפני התוספת של מדיה נוספת. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4245/4245fig2.jpg" /> איור 2. Explants ההגירה של תאי mesenchyme גולגולת מexplants מצופה על מצעים שונים. היה מצופה על פיברונקטין, laminin, MaxGel ECM או חומצה היאלורונית וצלם אחרי 48 שעות בתרבות. בר גודל = 200 מ&quot;מ.

Watch this Scientific Journal Video about An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme at JoVE.com

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

Mesenchyme הגולגולת עובר תנועות morphogenic דרמטיות שעשויים מספקת כוח מניע לגובה של הקפלים העצביים<sup&gt; 1,2</sup&gt;. כאן אנו מתארים פשוטים<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Explant assay לאפיין את ההתנהגויות הסלולר של mesenchyme הגולגולת במהלך neurulation. בדיקה זו יש יישומים רבים, בין היותך נוח למניפולציות תרופתיות וניתוחי הדמיה חיות.

Assay Explant להערכת התנהגות ניידת של mesenchyme הגולגולת

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

an-explant-assay-for-assessing-cellular-behavior-cranial

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Views.  Children's National Medical Center. Mesenchyme הגולגולת עובר תנועות morphogenic דרמטיות שעשויים מספקת כוח מניע לגובה של הקפלים העצביים 1,2. כאן אנו מתארים פשוטים Vivo לשעבר Explant assay לאפיין את ההתנהגויות הסלולר של mesenchyme הגולגולת במהלך neurulation. בדיקה זו יש יישומים רבים, בין היותך נוח למניפולציות ת?...

Video: An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

מכשיר microfluidic עם דפוסי Groove לחקר התנהגות נייד

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based medicine and/or its carrier may elicit cellular toxicity. For assessment of such cytotoxicity, a common methodology is largely dependent upon utilization of the 3-(4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay which has been widely used as a colorimetric approach based on the activity of mitochondrial dehydrogenase enzymes in cells. In this current investigation, MCF-7 cells were inoculated in 96-well plate and at 50% confluency they were treated with different nanopolyplexes and subjected to MTT assay after 24 hours. Water soluble yellow MTT is metabolized by the metabolically active cells to the water insoluble purple formazan, which is further dissolved in dimethylsulfoxide and Sornson s buffer pH 10.5. The resultant product can be quantified by spectrophotometry using a plate reader at 570 nm.

The MTT assay is an easy and reproducible colorimetric assay for evaluation of cell viability based on reduction of yellow MTT and production of water insoluble purple formazan. Here, the viability of MCF-7 cells upon treatment of nanogenomedicine has been evaluated.

רעילות נייד של Nanogenomedicine בקו MCF-7 נייד: assay MTT

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical research. The hypoxic chamber offers a simple system to control oxygenation in standard culture vessels, but lacks precise temporal and spatial control over the oxygen concentration at the cell surface, preventing its application in studying a variety of physiological phenomena. Other systems have improved upon the hypoxic chamber, but require specialized knowledge and equipment for their operation, making them intimidating for the average researcher. A microfabricated insert for multiwell plates has been developed to more effectively control the temporal and spatial oxygen concentration to better model physiological phenomena found in vivo. The platform consists of a polydimethylsiloxane insert that nests into a standard multiwell plate and serves as a passive microfluidic gas network with a gas-permeable membrane aimed to modulate oxygen delivery to adherent cells. The device is simple to use and is connected to gas cylinders that provide the pressure to introduce the desired oxygen concentration into the platform. Fabrication involves a combination of standard SU-8 photolithography, replica molding, and defined PDMS spinning on a silicon wafer. The components of the device are bonded after surface treatment using a hand-held plasma system. Validation is accomplished with a planar fluorescent oxygen sensor. Equilibration time is on the order of minutes and a wide variety of oxygen profiles can be attained based on the device design, such as the cyclic profile achieved in this study, and even oxygen gradients to mimic those found in vivo. The device can be sterilized for cell culture using common methods without loss of function. The device's applicability to studying the in vitro wound healing response will be demonstrated.

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

Fabrication and validation of an add-on platform that offers enhanced control over the spatial and temporal oxygenation in a 6-well plate. The device is adaptable to a number of culture systems and can be used to investigate the effects of oxygen on wound healing.

ייצור והפעלת הוספת חמצן עבור תרבויות נייד חסיד

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Assay Clonogenic: תאים חסיד

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Electroporation של Mesenchyme Craniofacial

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

כלי אנליטי שמכמת שינויי מורפולוגיה תאיים מתמונות פלואורסצנציה תלת ממדים

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

הפרדת אקטודרם עכבר העוברי פן וmesenchyme

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

לחיות ההדמיה Assay להערכת התפקידים של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; וSphingomyelinase בתיקון פצעי רעלן נקבובית יוצרי

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

מדידת ההשפעות של חיידקים על<em&gt; ג Elegans</em&gt; התנהגות באמצעות Assay שימור ביצה

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate underlying a cell must be manipulated. While hydrogels with graded stiffness and long-term migration assays have proven useful in durotaxis studies, immediate, acute responses to local changes in substrate tension allow focused study of individual cell movements and subcellular signaling events. To repeatably test the ability of cells to sense and respond to the underlying substrate stiffness, a modified method for application of acute gradients of increased tension to individual cells cultured on deformable hydrogels is used which allows for real time manipulation of the strength and direction of stiffness gradients imparted upon cells in question. Additionally, by fine tuning the details and parameters of the assay, such as the shape and dimensions of the micropipette or the relative position, placement, and direction of the applied gradient, the assay can be optimized for the study of any mechanically sensitive cell type and system. These parameters can be altered to reliably change the applied stimulus and expand the functionality and versatility of the assay. This method allows examination of both long term durotactic movement as well as more immediate changes in cellular signaling and morphological dynamics in response to changing stiffness.

Mechanical forces are important for controlling cell migration. This protocol demonstrates the use of elastic hydrogels that can be deformed using a glass micropipette and a micromanipulator to stimulate cells with a local stiffness gradient to elicit changes in cell structure and migration.

מערכת בודדת של תא להערכת בקרה מכנית של התנועה הסלולרית ואירועי איתות קשורים

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...