فإن الكتاب أود أن أشكر جانيت Schermuly لإعداد المؤتلف بوليميراز RNA T7 ونورمان Ebelt للمساعدة في إعداد الشكل 1. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل أموال من جمعية الألمانية للبحوث (DFG FOR1680) وماكس بلانك.

1. جيل من ركائز قبل crRNA طويل المدى عبر PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصميم الاشعال PCR استهداف المناطق التبادل من مجموعة CRISPR. إضافة بوليميراز RNA T7 (T7RNAP) تسلسل المروج (5 &#39;-taatacgactcactata-3 &quot;) إلى الأمام ومواقع التمهيدي لتقييد المنتج PCR الاستنساخ في ناقلات على حد سواء الاشعال (مثل BamHI والثالث للهند pUC19، الشكل. 2A) . ملاحظة: يتطلب T7RNAP بقايا الجوانيدين لبدء النسخ السليم لل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم الخاص بك قبل crRNA تسلسل الحمض النووي الجيني الاهتمام من قبل PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل المنتجات PCR بواسطة الكهربائي للهلام الاغاروز جل واستخراج الفرقة المطلوب. هضم المنتجات PCR مع الانزيمات التقييد لإنشاء نهايات لزجة (مثل BamHI وHindIII، الشكل. 2A). تنقية المنتج PCR مع مجموعة تنقية PCR للقضاء على الانقسام والمنتجات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء رد فعل الذي يحتوي ربط T4 يغاز DNA، T4 العازلة يغاز DNA ونسبة 03:01 المولي للمنتج PCR المشقوق وتقوم تقنية dephosphorylated ناقلات الخطية مع نهايات لزجة ذات الصلة. احتضان الخليط في 16 ° C بين عشية وضحاها. تحويل الخليط إلى ربط الخلايا المختصة القولونية DH5α بواسطة بروتوكولات القياسية واستخدام الفحص الأبيض الأزرق لتحديد ربط ناجحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل البلازميدات من المستعمرات الأبيض باستخدام إعداد ملف البلازميد. تحديد التسلسل استنساخ الإيجابية التي بلازميد. وبدلا من ذلك، يمكن استخدام PCR مستعمرة لفرزها. </li></ol> 2. جيل من المتوسط ​​قبل crRNA ركائز الصلب عن طريق الحمض النووي من أليغنوكليوتيد] <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصميم الأمام وعكس أليغنوكليوتيد] مع تكرار تسلسل المطلوب / CRISPR التبادل. وأليغنوكليوتيد] تحتوي على تسلسل مروج RNAP T7 فضلا عن تقييد مواقع الطرفي (مثل BamHI والثالث للهند pUC19). إنهاء أليغنوكليوتيد] لضمان أن ينتهي شكل لزجة بعد الصلب (انظر الشكل 2B </sترونج&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5&#39;-1 الفوسفات نانومول لكل قليل النوكليوتيد في رد فعل منفصل 20μl تحتوي على 5 ميكرولتر من كيناز عديد النوكليوتيد T4 (PNK)، 2 ميكرولتر من العازلة 10X PNK T4، 2 ميكرولتر ATP (10 ملم). احتضان كل عينة لمدة 1 ساعة عند 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هجن في أليغنوكليوتيد] 2 فسفرته. الجمع بين 1μl من الخليط بنسبة ضئيلة إلى الأمام فسفرته (من 2.2.)، 1 ميكرولتر من خليط بنسبة ضئيلة عكس فسفرته (من 2.2.)، 1 ميكرولتر من العازلة T4 DNA يغاز 10X في رد فعل 10 ميكرولتر. احتضان العينات لمدة 5 دقائق في 95 ° C على كتلة التدفئة أو في الماء المغلي، إيقاف مصدر الحرارة، والسماح للخليط يبرد إلى درجة حرارة الغرفة (~ 2-3 ساعات). ملاحظة: في هذه الخطوة الهامة، عملية التبريد البطيئة تفضل الصلب من أليغنوكليوتيد] 2 بالمقارنة مع تشكيل هياكل داخل كل واحد قليل النوكليوتيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ligate 4 ميكرولتر من مزيج التهجين، 1μl من ناقلات تقوم تقنية هضمها وdephosphorylated (0.1 ميكروغرام /ميكرولتر) مع يغاز DNA T4، T4 العازلة 10X يغاز DNA و 10 ملي ATP في خليط ربط 20 ميكرولتر. احتضان العينة في 16 درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل البلازميدات ligated في الخلايا المختصة القولونية DH5α بواسطة بروتوكولات القياسية والاستفادة من الفحص بيضاء اللون الأزرق. عزل البلازميدات وتحديد استنساخ إيجابية من قبل الهضم (للكشف عن إدراج من الحجم المطلوب) والتسلسل البلازميد اللاحقة. </li></ol> 3. جيل من ركائز قصيرة عبر RNA كاس العرف التوليف قليل النوكليوتيد RNA تصميم كاس قصيرة RNA ركائز (مثل تكرار تسلسل واحد، الشكل 2C) والاستفادة من مرافق مخصصة التوليف قليل النوكليوتيد RNA. ملاحظة: يمكن استخدام إدراج ديوكسي ريبونوكليوتيد في الموضع المحدد من قليل النوكليوتيد RNA (الشكل 2C) لتحديد موقع من الانقسام RNA. 4. في المختبر T7 النسخ RNA بوليميراز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل البلازميدات مع بناء الخاصة بك تصميم (من 1.9. أو 2.7.) باستخدام مجموعة maxiprep تنقية البلازميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطي البلازميد مع انزيم تقييد أن يشق المصب جزء مستنسخ (مثل HindIII). ضمان الهضم الكامل. ملاحظة: إذا كان المطلوب محطة لمدة 3 متباينة تعريف &#39;من محضر RNA، وينبغي أن يتضمن تصميم بناء إضافية محددة لتقييد موقع النسخ &quot;جولة الاعادة&quot; المنبع من تسلسل HindIII. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية البلازميد خطي من الفينول: كلوروفورم استخراج (1:1) وهطول الأمطار الإيثانول. استرداد الأحماض النووية من resuspending بيليه في المياه المعالجة العقيمة DEPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء المختبر في T7 RNAP الاعادة خليط النسخ التي تحتوي على 40 ملي Hepes / KOH (الرقم الهيدروجيني 8)، 22 ملم MgCl 2 و 5 dithiothreitol مم، 1 مم سبيرمدين، 4 مم لكل ثلاثي الفوسفات نوكليوزيد (ATP، CTP، GTP، UTP )، 40-100 ميكروغرام / مل من هضمهاالبلازميد و 0.1 ملغ / مل في الماء T7 RNAP DEPC المعالجة. احتضان لمدة 3 ساعات في 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل النصوص الحصول على هلام RNA يبدل طبيعة 8 M اليوريا 12٪ بولكرلميد (الشكل 3A). يمكن تنقيته من النصوص RNA عن طريق تبادل أنيون أحادي س اللوني 13 و تعافى من الهطول الإيثانول من الكسور وإعادة تعليق RNA من بيليه في الماء المعقم DEPC المعالجة. لاستخدامها في المستقبل، تخزين RNA في -80 ° C. </li></ol> 5. Cas6 نوكلياز داخلية مقايسة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء 20 ميكرولتر T7 RNAP في المختبر خليط من تشغيل النسخ (انظر 4.4) الذي يحتوي على المبلغ المخفض من ATP مم 2 ويتم استكمال مع 2.5 ميكرولتر α-[32 P]-ATP (10 ميلي كوري / مل، 5000 تسى / ملمول). تنقية منتجات التفاعل عبر استخراج جل من اليوريا يبدل طبيعة M 8 هلام بولكرلميد 12٪. تصور من قبل عصابات تصوير الإشعاع الذاتي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنتاج وتنقية البروتينات المؤتلف المطلوب كاس. في هذا المثال، Cوتنقيته من as6 thermocellum المطثية عبر هطول الأمطار والحرارة ني NTA اللوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مقايسة رد فعل نوكلياز داخلية (مثل كلوستريديوم thermocellum Cas6، خليط التفاعل تحتوي على 20 ملي Hepes (KOH pH8)، 250 مم بوكل، 2 ملم MgCl 2، 1 ملم DTT، 12،000 نسخة في الدقيقة الركيزة RNA و 1 ميكرومتر انزيم وحضنت في 37 ° C لمدة 30 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 5 ميكرولتر من خليط التفاعل (+ 10 ميكرولتر العازلة RNA التحميل التي تحتوي على 95٪ الفورماميد) على اليوريا M 8 هلام بولكرلميد 12٪. تصور المنتجات الانقسام بعد الكهربائي من تصوير الإشعاع الذاتي. </li></ol> 6. ممثل النتائج ويرد مثال على ركائز RNA لتحليل النشاط نوكلياز داخلية في كاس 3A الشكل. تم تحميل وقسامة من 5 ميكرولتر من 100 ميكرولتر التحليلية في رد فعل النسخ المختبر. يرجى ملاحظة أن كفاءة الإنتاج RNA يتراوح بين بنيات مختلفة. بعض العوامل روقد لوحظت قبعة للتأثير على كمية من الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها هي (ط) التسلسل الأولي بعد G +1 اللازمة لبدء النسخ، (الثاني) إمكانية تشكيل هيكل RNA خلال النسخ و(الثالث) اختيار الموقع تقييد للجيل للموقف الانقسام جولة الاعادة. التحقيق في النشاط نوكلياز داخلية RNA يتطلب عالي النقاء المؤتلف كاس البروتينات (الشكل 3B) والضوابط السلبية المناسبة. ومن الناحية المثالية، هذه العينة المراقبة السلبية يختلف أقل قدر ممكن من رد الفعل التحقيق نوكلياز داخلية كاس. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق حضانة RNA مع العازلة رد فعل الخلية والمحللة من دون التعبير CAS (وبعد إجراء تنقية متطابقة). عنصر تحكم مثالي السلبية هو إضافة ديوكسي ريبونوكليوتيد في موقع الانقسام المقترحة. في الشكل 3C، يظهر الانقسام من سلسلة المحطة رقم 5 &#39;تكرار مرقوم للthermocellum المطثية Cas6. تحت<html> ظروف مماثلة، وهذا تكرار ليست الركيزة بعد الآن عندما تنشأ ديوكسي ريبونوكليوتيد في موقف -9. هذا الأسلوب يوفر أيضا معلومات عن الموقع الانقسام. وأخيرا، هو المشقوق وصفت داخليا طويلة قبل crRNA من Cas6 ويلاحظ شظايا الانقسام اثنين. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig1.jpg" /> نظرة عامة على الرقم التخطيطي 1. من CRISPR / كاس النشاط. نظرة عامة يلي إدراج تسلسل الحمض النووي الفيروسي (protospacer) في الكتلة CRISPR (التكيف)، والنسخ وتجهيز مجموعة CRISPR في crRNAs الصغيرة من قبل نوكلياز داخلية Cas6، وامتصاص crRNAs في مجمع تتالي وتدخل على تكرار الهجوم الفيروسي على أساس التكامل بين crRNA وprotospacer. زخارف Protospacer المجاورة (PAM) تسلسل علامة protospacer الفيروسية. igure 2 &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. الجيل من ركائز RNA البروتينات لكاس. مخطط يبين سير العمل لتوليد (A) لفترة طويلة قبل crRNA ركائز، (B) وسيطة قبل crRNA ركائز و (C) RNA قصيرة كاس ركائز لمرحلة ما قبل الإنتاج crRNA. يتم عرض تسلسل سبيل المثال لمجموعة من CRISPR thermocellum المطثية. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4277/4277fig2large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig3.jpg" /> الشكل 3. Cas6 مقايسة نوكلياز داخلية. A.) هلام بولكرلميد زرقة الطولويدين الملون من قليل النوكليوتيد RNA مصمم خصيصا (250 بمول) واثنين في المختبر RNA النصوص (5 ميكرولتر من رد فعل نموذجي 100 ميكرولتر). B.) SDS-PAGE هلام لإعداد Cas6 (80 بمول) من المطثية بعد thermocellum الحرارةهطول الأمطار في 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة و ني NTA اللوني. C.) الكشف عن النشاط Cas6 endonucleolytic لمحطة 5 &#39;تسلسل تكرار وصفت وقبل crRNA في محاضر المختبر. الأخذ في موقف dNTP -9 تلغي الانقسام Cas6 لركيزة قصيرة RNA CAS (S، الشكل. 2C). كما يتم إنشاء A 5 &#39;علامة محطة NT 8 لنضوج crRNA من ركائز قبل crRNA طويلة (L، الشكل 2A). تم فصل العصابات على تغيير طبيعة اليوريا M 8 هلام بولكرلميد 12٪ من تصور وتصوير الإشعاع الذاتي.

<ol>
	<li>Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes.">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315, 1709-1712 (2007).</li><li>Makarova, K. S., Grishin, N. V., Shabalina, S. A., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+RNA-interference-based+immune+system+in+prokaryotes:+computational+analysis+of+the+predicted+enzymatic+machinery,+functional+analogies+with+eukaryotic+RNAi,+and+hypothetical+mechanisms+of+action.">A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action.</a> Biol. Direct. 1, 7 (2006).</li><li>Lillest&#248;l, R. K., Redder, P., Garrett, R. A., Brugger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+viral+defence+mechanism+in+archaeal+cells.">A putative viral defence mechanism in archaeal cells.</a> Archaea. 2, 59-72 (2006).</li><li>Makarova, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+classification+of+the+CRISPR-Cas+systems.">Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9, 467-477 (2011).</li><li>Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes.">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321, 960-964 (2008).</li><li>Carte, J., Pfister, N. T., Compton, M. M., Terns, R. M., Terns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+and+cleavage+of+CRISPR+RNA+by+Cas6.">Binding and cleavage of CRISPR RNA by Cas6.</a> RNA. 16, 2181-2188 (2010).</li><li>Haurwitz, R. E., Jinek, M., Wiedenheft, B., Zhou, K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-+and+structure-specific+RNA+processing+by+a+CRISPR+endonuclease.">Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease.</a> Science. 329, 1355-1358 (2010).</li><li>Gesner, E. M., Schellenberg, M. J., Garside, E. L., George, M. M., Macmillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+maturation+of+effector+RNAs+in+a+CRISPR+interference+pathway.">Recognition and maturation of effector RNAs in a CRISPR interference pathway.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 688-692 (2011).</li><li>Carte, J., Wang, R., Li, H., Terns, R. M., Terns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas6+is+an+endoribonuclease+that+generates+guide+RNAs+for+invader+defense+in+prokaryotes.">Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes.</a> Genes Dev. 22, 3489-3496 (2008).</li><li>Wiedenheft, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+RNA-guided+surveillance+complex+from+a+bacterial+immune+system.">Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system.</a> Nature. 477, 486-489 (2011).</li><li>Garneau, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468, 67-71 (2010).</li><li>Sinkunas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas3+is+a+single-stranded+DNA+nuclease+and+ATP-dependent+helicase+in+the+CRISPR/Cas+immune+system.">Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system.</a> EMBO J. 30, 1335-1342 (2011).</li><li>Jahn, M. J., Jahn, D., Kumar, A. M., S&#246;ll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mono+Q+chromatography+permits+recycling+of+DNA+template+and+purification+of+RNA+transcripts+after+T7+RNA+polymerase+reaction.">Mono Q chromatography permits recycling of DNA template and purification of RNA transcripts after T7 RNA polymerase reaction.</a> Nucleic Acids Res. 19, 2786-2787 (1991).</li><li>Sampson, J. R., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+physical+characterization+of+an+unmodified+yeast+phenylalanine+transfer+RNA+transcribed+in+vitro.">Biochemical and physical characterization of an unmodified yeast phenylalanine transfer RNA transcribed in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 1033-1037 (1988).</li><li>Dreher, T. W., Bujarski, J. J., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+viral+RNAs+synthesized+in+vitro+show+altered+aminoacylation+and+replicase+template+activities.">Mutant viral RNAs synthesized in vitro show altered aminoacylation and replicase template activities.</a> Nature. 311, 171-175 (1984).</li><li>McGinness, K. E., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitution+of+ribonucleotides+in+the+T7+RNA+polymerase+promoter+element.">Substitution of ribonucleotides in the T7 RNA polymerase promoter element.</a> J. Biol. Chem. 277, 2987-2991 (2002).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الأساليب قدم تمكين الجيل من ركائز نوكلياز داخلية كاس يتراوح حجم مختلفة وبدرجات حرية في تصميم التسلسل. ويقتصر النهج الأكثر مباشرة إلى الأمام لتوليد الاصطناعية ركائز قليل النوكليوتيد RNA RNA لتصاميم قصيرة بسبب زيادة التكاليف والقيود التقنية في خلق أطول oligomers RNA. في حين تم الإبلاغ عن نجاح RNA RNA تجميعي للoligomers معدلة أكثر من طول النيوكليوتيدات 100، الحد الأقصى عمليا واقتصاديا لتخليق RNA مخصص تقع أقل من 40 النيوكليوتيدات. ومع ذلك، يمكن توليفها أي تسلسل معين، ويمكن استخدامها في مقدمة المستهدفة من النيوكليوتيدات تعديل (على سبيل المثال ريبوزية) لتحليل المواقع الانقسام بالتفصيل. يجب أن يكون إنشاء أطول قبل cRNAs عبر النسخ في المختبر. والصلب من أليغنوكليوتيد] التي تحتوي على الحمض النووي الريبي بوليميراز T7 المروج يسمح لإنتاج طول وسيطة قبل crRNكما. الحد الأقصى لطول بشكل روتيني واقتصاديا أليغنوكليوتيد] DNA هو مجرد تجميع فوق 150 النيوكليوتيدات ويمثل الحد الأقصى لcrRNAs الاصطناعية قبل عبر هذه الطريقة. يمكن للجمعية العديد من صلب قليل النوكليوتيد أزواج DNA التي تشكل نهايات لزجة مع بعضها البعض تمديد هذه المدة القصوى لكن يتطلب التحديات المتزايدة في الاستنساخ للبناء. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة هو القدرة على توليد ما قبل crRNA بنيات (وبالتالي كاس نوكلياز داخلية ركائز) مع أي تسلسل المطلوب. وهذا يسمح للاختبار تصاميم crRNA الاصطناعية. وأخيرا، يمكن الحصول على أكبر ما قبل crRNAs من amplificates PCR من كامل العناصر الجينية CRISPR أو جزيئاتها. ويمكن إدخال تعديلات على قالب النسخ في المختبر عن طريق الطفرات البلازميد في الموقع موجهة للجيل السابق للcrRNA المتغيرات. ويمكن استخدام هذه التركيبات لتحليل نمط العالمية انشقاق داخل endonucleolytic كاملقبل crRNA. واستند عمل رائدة لإنتاج RNA بوليميراز RNA معدلة عبر T7 في النسخ المختبر على نقل الرناوات 14 و RNA فيروس فسيفساء بروم 15. بوليميراز RNA توافق T7 المروج يتكون من مجال الاعتراف (-17 من خلال -5) والشروع مجال (-4 من خلال +6) مع بدء النسخ في لغوانوزين الأساسية +1 16. يمكن أن تختلف المواقف من المصب +1 الذي يسمح للنسخ من ما يقرب من أي تسلسل الحمض النووي الريبي المطلوب. الأساليب قدمت لتوليد المختبر في قوالب النسخ جولة الاعادة تسمح لفي تركيب المختبر من قبل كاملة crRNAs التي تطابق المناطق CRISPR الجيني أو الاصطناعية المتغيرات قبل crRNA. يتم إنشاء النسخ الحالية مع ثلاثي الفوسفات 5&#39;-محطة ما لم يتم معبي رد فعل النسخ مع GMP للحصول على الأدينوزين 5 &#39;تيرميني 14. ويلزم مصطلحات من هذا القبيل إذا النصوص أن يكون المسمىمع كيناز عديد النوكليوتيد T4-γ و[32 P].-ATP النشاط الانقسام من Cas6 والإنزيمات مثل Cas6 يولد crRNA التي تحتوي على 5&#39;-الهيدروكسيل و &#39;2، تيرميني الفوسفات 3&#39;-دوري. ويمكن بعد هذه الرناوات يتم تحليلها لاعتراف المجمع تتالي.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> الفوسفاتيز القطب الجنوبي </td><td> NEB </td><td> M0289L </td><td></td></tr><tr><td> في المختبر Triphosphates التدوين النقاوة الصف النكليوتيد </td><td> العلوم البيولوجية جينا </td><td> NU-1010 - NU-1013 </td><td></td></tr><tr><td> السائل اللوني، ktapurifier 100 </td><td> GE للرعاية الصحية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DNA أليغنوكليوتيد] </td><td> MWG OPERON </td><td></td><td></td></tr><tr><td> [أليغنوكليوتيد] RNA </td><td> MWG OPERON </td><td></td><td></td></tr><tr><td> هلام استخراج كيت </td><td> QIAGEN </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> PCR تنقية كيت </td><td> QIAGEN </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> تدور Miniprep كيت </td><td> QIAGEN </td><td> 27106 </td><td></td></tr><tr><td> بلازميد ماكسي كيت </td><td> QIAGEN </td><td> 12163 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> NEB </td><td> R0136L </td><td></td></tr><tr><td> HindIII </td><td> NEB </td><td> R0104L </td><td></td></tr><tr><td> T4 DNA يغاز </td><td> NEB </td><td> M0202S </td><td></td></tr><tr><td> T4 عديد النوكليوتيد كيناز </td><td> Ambion </td><td> AM2310 </td><td></td></tr><tr><td> T7 بوليميريز RNA </td><td> إعداد الخاصة </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoxynucleotide الحل ميكس </td><td> NEB </td><td> N0447L </td><td></td></tr><tr><td> ميني متلون نظام تيترا الكهربائي </td><td> بيو راد </td><td> 165-8001 </td><td></td></tr><tr><td> العاصفة 840 ماسح </td><td&gt; GE للرعاية الصحية </td><td> 163723 </td><td></td></tr><tr><td> تخزين Phosphorscreen </td><td> الجزيئية حيوية </td><td> 63-0034-81 </td><td></td></tr><tr><td> أحادية س 5/50 GL </td><td> GE للرعاية الصحية </td><td> 17-5166-01 </td><td></td></tr><tr><td> Phusion البلمرة DNA عالية الدقة </td><td> NEB </td><td> M0530L </td><td> استخدام المخزن المؤقت GC </td></tr><tr><td> زرقة الطولويدين </td><td> سيجما </td><td> T3260 </td><td></td></tr><tr><td> pUC19 </td><td> NEB </td><td> N3041S </td><td></td></tr><tr><td> γ-[32 P]-ATP، α-[32 P]-ATP </td><td> هارتمان تحليلية </td><td> SRP-401، SRP-307 </td><td></td></tr></tbody></table>

substrate generation for endonucleases of crispr/cas systems

تفاعل الفيروسات والمضيفين على شكل بروكاريوتيك تطور الحياة الجرثومية وarchaeal. بدائيات النوى وضعت عدة استراتيجيات لتجنب الهجمات الفيروسية التي تشمل تقييد التعديل، والعدوى فاشلة ونظم CRISPR / كاس. هذه النظم على التكيف المناعي وجدت في العديد من أنواع البكتيريا ومعظم الأركيا تتكون من ج ص مصقول egularly ط ق هورت nterspaced ص ص alindromic EPEAT (CRISPR) تسلسل وعدد من الجينات كما RISPR C (CAS) sociated (الشكل 1) 1-3. مجموعات مختلفة من البروتينات استراتيجية المساعدة القطرية ويكرر تحديد ما لا يقل عن ثلاثة أنواع متباينة من CRISPR الرئيسية / كاس نظم 4. ويقترح البروتينات العالمية Cas1 وCas2 أن تشارك في امتصاص DNA فيروسيسيتم إنشاء عنصر جديد التبادل بين اثنين في محطة يكرر 5 &#39;من كتلة CRISPR تمتد 5. وكتب الكتلة بأكملها إلى crRNA-السلائف يحتوي على جميع متواليات التبادل وتكرار وتتم معالجتها لاحقا من قبل انزيم من عائلة متنوعة Cas6 إلى أصغر crRNAs 6-8. هذه crRNAs تتكون من تسلسل التبادل يحيط بها &#39;محطة (8 النيوكليوتيدات) و3&#39; لمدة 5 العلامة النهائية المستمدة من تكرار تسلسل 9. ويمكن الآن للعدوى المتكررة من الفيروس يكون قد تم حظره كما سيتم توجيه crRNA جديدة من مجمع البروتين CAS (تتالي) إلى الحمض النووي الفيروسي والتعرف عليه على هذا النحو من خلال التكامل الأساس 10. وأخيرا، لCRISPR / كاس أنظمة من النوع 1، فإن Cas3 نوكلياز تدمير الغازي الكشف عن الحمض النووي 11،12. هذه العمليات تحديد CRISPR / كاس نظام المناعة والتكيف بدائيات النوى وفتح مجال البحوث رائعة لدراسة البروتينات كاس المعنية.وظيفة البروتينات كاس العديد من لا يزال بعيد المنال، والأسباب واضحة للتنوع أنظمة CRISPR / كاس يزال يتعين مضيئة. وتوقع الأنشطة المحتملة من البروتينات معظم التحليلات الحسابية عن طريق كاس تفصيلا. وتظهر إما جزءا كبيرا من البروتينات أو المقترحة لكاس تعمل كما endonucleases 4. هنا، نقدم طرق لتوليد crRNAs والسلائف cRNAs من أجل دراسة endoribonucleases كاس. المقايسات نوكلياز داخلية مختلفة تتطلب تكرار متواليات قصيرة إما مباشرة يمكن أن توليفها كما أليغنوكليوتيد] RNA أو تسلسل أطول crRNA وقبل crRNA-التي يتم إنشاؤها عن طريق البلمرة في المختبر RNA T7 جولة الاعادة النسخ. هذه المنهجية يسمح إدماج من النيوكليوتيدات المشعة لتوليد ركائز نوكلياز داخلية المسمى داخليا وإنشاء crRNAs تركيبية أو متحولة. ويستخدم Cas6 النشاط نوكلياز داخلية لتنضج قبل crRNAs في crRNAs مع 5&#39;-HYDRoxyl و &#39;2، تيرميني الفوسفات 3&#39;-دوري.

Watch this Scientific Journal Video about Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems at JoVE.com

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

CRISPR / كاس أنظمة المناعة التكيفية التوسط في البكتيريا والعتيقة. ويقترح العديد من البروتينات لتكون بمثابة كاس endoribonucleases تعمل على السلائف crRNA ذات أطوال متباينة. نحن هنا توضيح ثلاثة أساليب مختلفة لتوليد ما قبل crRNA ركائز لتحليل كيميائي حيوي من النشاط نوكلياز داخلية كاس.

الجيل الركيزة لEndonucleases من CRISPR / كاس أنظمة

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

substrate-generation-for-endonucleases-of-crisprcas-systems

Research

JoVE Journal

Biology

27.2K Views.  Max-Planck-Institute for Terrestrial Microbiology. CRISPR / كاس أنظمة المناعة التكيفية التوسط في البكتيريا والعتيقة. ويقترح العديد من البروتينات لتكون بمثابة كاس endoribonucleases تعمل على السلائف crRNA ذات أطوال متباينة. نحن هنا توضيح ثلاثة أساليب مختلفة لتوليد ما قبل crRNA ركائز لتحليل كيميائي حيوي من النشاط نوكلياز داخلية ك?...

Video: Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

باستخدام مايكرو سيستمز الكهربائية والميكانيكية (ممس) لتطوير أدوات التشخيص

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of cells (approximately 25 in C. borealis) which are well characterized. The cells in the STG exhibit a broad range of outputs and are responsible for the motor actions of the stomach. The stomach contains the gastric mill which breaks down food with three internal teeth, and the pylorus which filters the food before it reaches the midgut. The STG produces two rhythmic outputs to control the gastric mill and pylorus known as central pattern generators (CPGs). Each cell in the STG can participate in one or both of these rhythms. These CPGs allow for the study of neuromodulation, homeostasis, cellular and network variability, network development, and network recovery.
The dissection of the stomatogastric nervous system (STNS) from the Jonah crab (Cancer borealis) is done in two parts; the gross and fine dissection. In the gross dissection the entire stomach is dissected from the crab. During the fine dissection the STNS is extracted from the stomach using a dissection microscope and micro-dissection tools (see figure 1). The STNS includes the STG, the oesophageal ganglion (OG), and the commissural ganglia (CoG) as well as the nerves that innervate the stomach muscles. Here, we show how to perform a complete dissection of the STNS in preparation for an electrophysiology experiment where the cells in the STG would be recorded from intracellularly and the peripheral nerves would be used for extracellular recordings. The proper technique for finding the desired nerves is shown as well as our technique of desheathing the ganglion to reveal the somata and neuropil.

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric nervous system (STNS) of the Jonah crab (C. borealis) can be used for electrophysiology, immunohistochemistry, and cell culture studies. The STNS extraction is done in two parts: the gross and fine dissection.

سرطان بورياليس فموي معدي تشريح الجهاز العصبي

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

إجمالي تشريح المعدة من جراد البحر ، Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

جيل من الخلايا البشرية باء تنشيط CD40

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

مضان الفرز الخلية النباتية المنشط من Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

التوليف ومعايرة Nanoprobes الفسفورية للتصوير الأوكسجين في النظم البيولوجية

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

البيوفيزيائية فحوصات للتحقيق في الخواص الميكانيكية للنواة الخلية الطور البيني : الركيزة التطبيق الانفعال والتلاعب Microneedle

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

استخدام الكيموستات في الميكروبية بيولوجيا الأنظمة

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

جيل من Myospheres من hESCs بواسطة إعادة برمجة جينية

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...