Yazarlar, rekombinant T7 RNA polimeraz ve Şekil 1 türlerinin hazırlanması için Norman Ebelt hazırlanması için Schermuly Jeanette teşekkür ederiz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) ve Max Planck Topluluğu fonları tarafından finanse edildi.

1. PCR ile uzun ön crRNA substratların Nesil <ol><li> Bir CRISPR küme boşluk bölgeleri hedefleyen Tasarım PCR primerleri. T7 RNA polimeraz ekleme klonlanması için ileri primer ve kısıtlama siteleri (T7RNAP) promoter sekansı (5 &#39;-taatacgactcactata-3&#39;) iki astarın (pUC19 için örneğin, BamHI ve Hind III, Şek. 2A) bir vektör içine PCR ürünü . Not: T7RNAP transkripsiyonun başlatılması için uygun bir guanidin kalıntı gerektirir. </li><li> PCR ile genomik DNA ilgi öncesi crRNA dizisi Amplify. </li><li> Agaroz jel elektroforezi ile PCR ürünleri ayırın ve jel istenen bant ayıklayın. Yapışkan uçları (örneğin, BamHI ve HindIII, Şek. 2A) oluşturmak için sınırlama enzimleri ile sindirmek PCR ürünü. Yan ürünler bölünme ortadan kaldırmak için, bir PCR arıtma kiti ile PCR ürünü, üzerine koyulmuştur. </li><li> Bir T4 DNA ligaz içerir ligasyon reaksiyonu, T4 DNA ligaz tamponu ve kurmayarılan PCR ürünü ve karşılık gelen yapışkan uçları dephosphorylated doğrusal pUC vektörünün bir molar oranı 3:1. 16 ° C&#39;da gece boyunca karışım inkübe edin. Standart protokoller tarafından yetkili Escherichia coli DH5α hücrelerine ligasyon karışımı Dönüşümü ve başarılı ligasyonu tanımlamak için mavi beyaz tarama kullanın. </li><li> Bir plazmid hazırlık seti kullanarak beyaz kolonilerden plazmid izole edin. Plazmid sekanslamasıyla pozitif klonları tanımlamak. Alternatif olarak, koloni PCR ile tarama için kullanılabilir olabilir. </li></ol> 2. DNA oligonükleotidler tavlama yoluyla orta öncesi crRNA substratların Nesil <ol><li> İleri Tasarım ve istenilen CRISPR tekrarlama / boşluk dizisi ile oligonükleotidler tersine. Oligonükleotidler bir T7 promotörü RNAP hem de uç kısıtlama siteleri (pUC19 için örneğin, BamHI ve Hind III) &#39;ün sekansı içerir. (Bkz. Şek. 2B Tavlama sonrası bu yapışkan uçları formu sağlamak için oligonükleotidler Terminate </sTrong&gt;). </li><li> T4 polinükleotid kinaz 5 ul (PNK), T4 PNK 10x tampon, 2 ul ATP (10 mM) ve 2 ul ihtiva eden bir ayrı 20uL reaksiyon bölgesindeki her bir oligonükleotid 5&#39;-fosforile 1 nmol. 37 de 1 saat için her bir örnek inkübe ° C. </li><li> İki fosforile oligonükleotidler melezleşme. Fosforlu ileri oligo karışımı (2.2)., Fosforlu ters oligo karışımı (2.2)., Bir 10 ul reaksiyon 10x T4 DNA ligaz tamponu 1 ul 1 ul 1μl birleştirin. 95 az 5 dakika süreyle örneklerin inkübe ° bir ısıtma bloğu veya kaynar suda C, ısı kaynağını kapatın ve oda sıcaklığında (~ 2-3 saat) aşağı karışımı soğumaya bırakın. Not: Bu kritik adımda, yavaş soğutma işlemi her biri tek bir oligonükleotid içindeki yapıların oluşumu ile karşılaştırıldığında, iki oligonükleotidlerin tavlanması yanadır. </li><li> Sindirilir ve dephosphorylated pUC vektör 1μl hibridizasyon karışımı 4 ul, (Arter 0.1 mikrogram /T4 DNA ligazı, 10x T4 DNA ligaz tampon ve bir 20 mikrolitre ligasyon karışımı içinde, 10 mM ATP) ile ul. 16 ° C&#39;da gece boyunca numune inkübe edin. </li><li> Standart protokoller tarafından yetkili Escherichia coli DH5α hücrelerine bağlanan plazmid Dönüşümü ve mavi beyaz tarama kullanır. Plazmid izole ve sindirim (istenilen büyüklükte uçlar için ekrana) ve sonraki plazmid sekanslamasıyla pozitif klonları tanımlamak. </li></ol> 3. Özel RNA oligonükleotid sentezi yoluyla kısa Cas RNA substratların Nesil Tasarım kısa Cas RNA yüzeylerde (örn. tek tekrar dizileri, Şek. 2C) ve özel RNA oligonükleotid sentezi imkanları kullanmaktadır. Not: RNA oligonükleotid belirtilen bir pozisyonu (Şekil 2C) bir deoksiribonükleotid dahil edilmesi, RNA bölünme yerinde kesin olarak belirlemek için kullanılabilir. 4. In vitro T7 RNA polimeraz transkripsiyon <ol><li> Senin tasarlanmış yapı (1.9. Veya 2.7 &#39;den.) Bir maxiprep plazmid saflaştırma kiti kullanılarak plazmid izole edin. </li><li> Klonlanmış parçası (örneğin Hind III) akış aşağı parçalayarak kısıtlama enzimi ile linearize plazmid. Tam sindirim olun. Not: RNA transkriptinin farklı tanımlanmış bir 3 &#39;terminaline istenirse, tasarlanmış bir yapı HindIII sekans yukarı akış yönünde &quot;run-off&quot; transkripsiyon için ilave bir belirli sınırlandırma bölgesi içermelidir. </li><li> Kloroform (1:1) ekstraksiyon ve etanol yağış: lineerleştirilebilir fenol plazmid arındırın. DEPC işlenmiş steril suda pelet resuspending göre nükleik asitler kurtarma. </li><li> In vitro T7 RNAP içinde bir 40 mM Hepes / KOH (pH 8), 22 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 1 mM spermidin, her bir nükleosit trifosfat 4 mM (ATP, CTP, GTP, UTP içeren transkripsiyon karışım kapalı çalışır ayarlama ), 40-100 ug / ml arasında sindirilmişplazmid ve DEPC işlenmiş su içinde 0.1 mg / ml T7 RNAP. 37 C&#39;de 3 saat için inkübe ° C. </li><li> Bir 8 M üre denatüre% 12 poliakrilamid jel (Şekil 3A) üzerinde elde edilen RNA transkriptleri analiz edin. RNA transkriptleri Mono Q anyon değişim kromatografisi yolu ile saflaştırıldı ve 13 DEPC işlenmiş steril suda RNA fraksiyonu ve pelet yeniden süspanse edilmesi ve etanol çökeltme ile geri kazanılabilir. Gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C&#39;de saklayın RNA </li></ol> 5. Cas6 endonükleaz tahlil <ol><li> Bir ayarlama Vitro T7 RNAP 20 ul 2 mM ATP azaltılmış miktarda içerir ve ile tamamlanmaktadır (4.4) transkripsiyon karışımı kaçıp 2.5 ul α-[32 P]-ATP (10 mCi / ml, 5000 Ci / mmol). Bir denatüre edici 8 M üre,% 12 poliakrilamit jel arasından jel çıkarma yolu ile reaksiyon ürünleri, temizler. Otoradyografi bantları gözünüzde canlandırın. </li><li> İstediğiniz rekombinant Cas proteinler üretin ve arındırmak. Bu örnekte, CClostridium thermocellum dan AS6 ısı çökeltme ve Ni-NTA kromatografi yolu ile saflaştınldı. </li><li> Clostridium thermocellum Cas6 için bir endonükleaz tahlil reaksiyon (örneğin ayarlama, reaksiyon karışımı, 20 mM Hepes (KOH PH8), 250 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 12,000 cpm RNA alt tabaka ve 1 uM enzim içeren ve inkübe edildi 37 ° C&#39;de 30 dakika süre ile). </li><li> 8 M üre, bir% 12 poliakrilamid jel üzerinde reaksiyon karışımı (% 95 formamit ihtiva eden 10 ul + RNA, yükleme tamponu) 5 ul yerleştirin. Otoradyografi elektroforez sonrası parçalanma ürünleri gözünüzde canlandırın. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Cas endonükleaz etkinliği analizi için substrat RNA&#39;nın bir örneği Şekil 3A&#39;da gösterilmiştir. In vitro transkripsiyon reaksiyonunda bir analitik 100 ul 5 ul lik bir örnek yüklendi. RNA üretim verimliliğini Farklı yapıları arasındaki farklılık gösterebileceğini unutmayın. Bazı faktörler tşapka transkripsiyon başlatma için gereken +1 G, transkripsiyon sırasında RNA yapı formasyonu (ii) olasılığı ve üretim için sınırlama alanı (iii) aşağıdaki tercih olup elde edilen RNA miktarı, (i) ilk sıra etki gözlenmiştir run-off bölünme pozisyonunun. RNA endonükleaz aktivite incelemesi hem yüksek oranda saflaştırılmış rekombinant Cas proteinler (Şekil 3B) ve uygun negatif kontroller gerektirir. İdeal olarak, bu negatif kontrol örneği incelenmiştir Cas endonükleaz reaksiyon mümkün olduğunca az farklıdır. Bu ifade Cas (ve aynı arıtma prosedürü izleyerek) olmadan reaksiyon tamponu ve hücre lizatı ile RNA inkübasyon yoluyla elde edilebilir. İdeal bir negatif kontrol önerilen bölünme sitesinin bir deoksiribonükleotid bir eklenmesidir. Şekil 3C, bir 5 &#39;terminal tekrarı etiketli dizisinin bölünme Clostridium thermocellum Cas6 için gösterilir. Altında<html> aynı koşullar, bu tekrar bir deoksiribonükleotid, -9 pozisyonunda tanıtıldıktan sonra artık bir substrat değildir. Bu yöntem aynı zamanda bölünme sitesinin ilgili bilgi sağlar. Son olarak, bir uzun içten etiketli ön crRNA Cas6 ile parçalanır ve iki yarılma parçaları görülmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig1.jpg" /> CRISPR / Cas aktivitesi Şekil 1. Şematik gösterimi. Genel CRISPR küme (adaptasyon), bir Cas6 endonükleaz ile küçük crRNAs içine CRISPR dizi transkripsiyonu ve işleme, Cascade kompleksi içine crRNAs alımını ve müdahalesi bir viral DNA dizisi (protospacer) yerleştirilmesini takip crRNA ve protospacer arasındaki tamamlayıcılık esas viral saldırı tekrarladı. Protospacer bitişik motifler (PAM) işareti viral protospacer dizileri. ŞEKIL 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. Cas proteinleri RNA substratların Nesil. Düzeni (A) uzun ön crRNA substratlar, (B), orta ön crRNA alt tabakalar ve ön-crRNA üretimi için (C) kısa Cas RNA alt tabakalar üretmek için akışı gösterilmektedir. Örnek dizileri Clostridium thermocellum arasında CRISPR dizisi için sunulmuştur. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4277/4277fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig3.jpg" /> Şekil 3. Cas6 endonükleaz denemesi. A.) Toluidin blue ile boyanan poliakrilamid özel tasarlanmış RNA oligonükleotid (250 pmol) jel ve in vitro RNA transkriptleri (tipik 100 ul reaksiyon 5 ul) iki. Isı sonra Clostridium thermocellum bir Cas6 hazırlık (80 pmol) B.) SDS-PAGE jel1 saat ve Ni-NTA kromatografisi için 50 ° C de yağış. 5 &#39;terminal etiketli tekrar sıraları ve in vitro transkriptleri ön crRNA için endonucleolytic Cas6 aktivitesi C) tespit eder. -9 Pozisyonunda bir dNTP tanıtımı kısa Cas RNA substratın (S, Şek. 2C) için Cas6 bölünme ortadan kaldırmaktadır. Bir 5 &#39;terminal 8 nt etiketi de uzun ön crRNA substratlar (L, Şek. 2A) dan crRNA olgunlaşması için oluşturulur. Bantları denatüre 8 M üre% 12 poliakrilamid jel üzerinde ayrılmış ve otoradyografi ile görselleştirilmiş edildi.

<ol>
	<li>Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes.">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315, 1709-1712 (2007).</li><li>Makarova, K. S., Grishin, N. V., Shabalina, S. A., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+RNA-interference-based+immune+system+in+prokaryotes:+computational+analysis+of+the+predicted+enzymatic+machinery,+functional+analogies+with+eukaryotic+RNAi,+and+hypothetical+mechanisms+of+action.">A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action.</a> Biol. Direct. 1, 7 (2006).</li><li>Lillest&#248;l, R. K., Redder, P., Garrett, R. A., Brugger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+viral+defence+mechanism+in+archaeal+cells.">A putative viral defence mechanism in archaeal cells.</a> Archaea. 2, 59-72 (2006).</li><li>Makarova, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+classification+of+the+CRISPR-Cas+systems.">Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9, 467-477 (2011).</li><li>Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes.">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321, 960-964 (2008).</li><li>Carte, J., Pfister, N. T., Compton, M. M., Terns, R. M., Terns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+and+cleavage+of+CRISPR+RNA+by+Cas6.">Binding and cleavage of CRISPR RNA by Cas6.</a> RNA. 16, 2181-2188 (2010).</li><li>Haurwitz, R. E., Jinek, M., Wiedenheft, B., Zhou, K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-+and+structure-specific+RNA+processing+by+a+CRISPR+endonuclease.">Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease.</a> Science. 329, 1355-1358 (2010).</li><li>Gesner, E. M., Schellenberg, M. J., Garside, E. L., George, M. M., Macmillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+maturation+of+effector+RNAs+in+a+CRISPR+interference+pathway.">Recognition and maturation of effector RNAs in a CRISPR interference pathway.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 688-692 (2011).</li><li>Carte, J., Wang, R., Li, H., Terns, R. M., Terns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas6+is+an+endoribonuclease+that+generates+guide+RNAs+for+invader+defense+in+prokaryotes.">Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes.</a> Genes Dev. 22, 3489-3496 (2008).</li><li>Wiedenheft, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+RNA-guided+surveillance+complex+from+a+bacterial+immune+system.">Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system.</a> Nature. 477, 486-489 (2011).</li><li>Garneau, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468, 67-71 (2010).</li><li>Sinkunas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas3+is+a+single-stranded+DNA+nuclease+and+ATP-dependent+helicase+in+the+CRISPR/Cas+immune+system.">Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system.</a> EMBO J. 30, 1335-1342 (2011).</li><li>Jahn, M. J., Jahn, D., Kumar, A. M., S&#246;ll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mono+Q+chromatography+permits+recycling+of+DNA+template+and+purification+of+RNA+transcripts+after+T7+RNA+polymerase+reaction.">Mono Q chromatography permits recycling of DNA template and purification of RNA transcripts after T7 RNA polymerase reaction.</a> Nucleic Acids Res. 19, 2786-2787 (1991).</li><li>Sampson, J. R., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+physical+characterization+of+an+unmodified+yeast+phenylalanine+transfer+RNA+transcribed+in+vitro.">Biochemical and physical characterization of an unmodified yeast phenylalanine transfer RNA transcribed in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 1033-1037 (1988).</li><li>Dreher, T. W., Bujarski, J. J., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+viral+RNAs+synthesized+in+vitro+show+altered+aminoacylation+and+replicase+template+activities.">Mutant viral RNAs synthesized in vitro show altered aminoacylation and replicase template activities.</a> Nature. 311, 171-175 (1984).</li><li>McGinness, K. E., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitution+of+ribonucleotides+in+the+T7+RNA+polymerase+promoter+element.">Substitution of ribonucleotides in the T7 RNA polymerase promoter element.</a> J. Biol. Chem. 277, 2987-2991 (2002).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Sunulan yöntemler farklı boyut aralıkları Cas endonükleaz substratların oluşturmayı etkinleştirmek ve sıra tasarım özgürlüğü değişen. Sentetik RNA oligonükleotid substratların nesil için en düz ileri yaklaşım artık RNA oligomerler oluşturarak artan maliyetler ve teknik sınırlamalar nedeniyle kısa RNA tasarımları ile sınırlıdır. Başarılı RNA sentezi üzerinde 100 nükleotid uzunlukta değiştirilmemiş RNA oligomerleri için rapor edilmiş olsa da, özel RNA sentezi için pratik ve ekonomik azami altında 40 nükleotidler yatıyor. Ancak, herhangi bir sıra sentez edilebilir ve modifiye nükleotidler (örn. deoxyribonucleotides) ve hedeflenen giriş ayrıntılı olarak yarılma bölgeleri analiz etmek için kullanılabilir. Daha uzun ön cRNAs in vitro transkripsiyon kullanılarak oluşturulan olmalıdır. Bir T7 RNA polimeraz promotörü içeren oligonükleotidler ara tavlama uzunluğu önceden crRN üretimi için olanak sağlarGibi. Rutin olarak ve ekonomik olarak sentezlenmiş oligonükleotid DNA&#39;nın maksimum uzunluğu sadece 150 nükleotid üzerinde ve bu yöntem vasıtasıyla sentetik ön crRNAs azami temsil eder. Birbirleri ile yapışkan uçları oluştururlar birkaç tavlı DNA oligonükleotid çiftleri düzeneği bu maksimal uzatmak ancak yapının klonlama artan zorlukları zorunlu olabilir. Bu yöntemin başlıca avantajı, herhangi bir istenen sırada ile ön crRNA yapıları (ve bu nedenle Cas endonükleaz substrat) oluşturmak için yeteneğidir. Bu sentetik crRNA tasarımları test yapılmasını sağlar. Son olarak, daha büyük bir ön crRNAs bunların tüm genomik CRISPR elemanları ya da fraksiyonları PCR amplificates elde edilebilir. In vitro transkripsiyon plasmidi şablon olarak değişiklikler için önceden crRNA varyantlarının üretilmesi için site-yönlendirmeli mütajenez yoluyla sokulabilir. Bu yapı, bir bütün içinde küresel endonucleolytic bölünme kalıp analiz etmek için de kullanılabilirön crRNA. In vitro transkripsiyon içinde T7 RNA polimeraz aracılığıyla değiştirilmemiş RNA üretimi için öncü çalışma devri RNA&#39;lar 14 ve brom mozaik virüs RNA 15 dayanmaktadır. Uzlaşma T7 RNA polimeraz promotörü bir tanıma alanı (-5 ile -17) ve önemli bir guanozin +1 16 de transkripsiyon başlangıcı olan bir inisiyasyon alanı (+6 aracılığıyla -4) oluşmaktadır. +1 Pozisyonlar akış hemen hemen arzu edilen herhangi bir RNA sekansının transkripsiyon olanak sağlayan çeşitli olabilir. In vitro transkripsiyon akıntısı oluşturmak için şablon olarak sunulan yöntemler CRISPR genomik bölge ya da sentetik ön crRNA türevleri neticesinde komple bir ön-crRNAs in vitro sentezi için izin verir. Transkripsiyon reaksiyonu 5 &#39;monofosfat termini 14 elde etmek için GMP ile astarlanmalıdır sürece dökümleri 5&#39;-terminali trifosfat mevcut oluşturulur. Transkript etiketli isteniyorsa, bu tür termini gerekmektedirT4 polinükleotid kinaz ve γ-[32 P]-ATP. sahip Cas6 ve Cas6-benzeri enzim aktivitesi Yarılma 5&#39;-hidroksil ile bir 2 &#39;, 3&#39;-siklik fosfat termini ihtiva crRNA oluşturur. Bu RNA&#39;lar sonra Cascade kompleksi tarafından tanınması için analiz edilebilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Antarktika Fosfataz </td><td> NEB </td><td> M0289L </td><td></td></tr><tr><td> In vitro transkripsiyon Sınıf Ultrasaf Nükleotid trifosfatlar içinde </td><td> Bioscience Jena </td><td> NU-1010 - NU-1013 </td><td></td></tr><tr><td> Sıvı kromatografisi, ktapurifier 100 </td><td> GE Healthcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DNA oligonükleotidler </td><td> MWG Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> RNA oligonükleotidler </td><td> MWG Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Jel Ekstraksiyon Kiti </td><td> QIAGEN </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> PCR saflaştırma Kiti </td><td> QIAGEN </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Spin Miniprep Kiti </td><td> QIAGEN </td><td> 27106 </td><td></td></tr><tr><td> Plazmid Maxi Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 12163 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> NEB </td><td> R0136L </td><td></td></tr><tr><td> HindIII </td><td> NEB </td><td> R0104L </td><td></td></tr><tr><td> T4 DNA Ligaz </td><td> NEB </td><td> M0202S </td><td></td></tr><tr><td> T4 polinükleotid kinaz </td><td> Ambion </td><td> AM2310 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA Polimeraz </td><td> Kendi hazırlığı </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoksinükleotid Çözüm Mix </td><td> NEB </td><td> N0447L </td><td></td></tr><tr><td> Mini Protean Tetra Elektroforez Sistemi </td><td> Bio-Rad </td><td> 165-8001 </td><td></td></tr><tr><td> Fırtına 840 Tarayıcı </td><td&gt; GE Healthcare </td><td> 163723 </td><td></td></tr><tr><td> Depolama Phosphorscreen </td><td> Moleküler Dinamik </td><td> 63-0034-81 </td><td></td></tr><tr><td> Mono Q 5/50 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5166-01 </td><td></td></tr><tr><td> Phusion Yüksek Sadakat DNA Polimeraz </td><td> NEB </td><td> M0530L </td><td> GC tampon kullanın </td></tr><tr><td> Toluidin Blue </td><td> Sigma </td><td> T3260 </td><td></td></tr><tr><td> pUC19 </td><td> NEB </td><td> N3041S </td><td></td></tr><tr><td> γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP </td><td> Hartmann Analitik </td><td> SRP-401, SRP-307 </td><td></td></tr></tbody></table>

substrate generation for endonucleases of crispr/cas systems

Virüsler ve prokaryotik ana etkileşim bakteri ve arke yaşamın evrimini şekillendirdi. Prokaryotlar restriksiyon modifikasyon, başarısız enfeksiyon ve CRISPR / Cas sistemlerini içerir viral saldırılardan kaçınmak için çeşitli stratejiler geliştirilmiştir. C i s hort p alindromic r EPEAT (CRISPR) dizileri ve sociated (Cas) genler olarak C RISPR bir dizi (Şekil 1) 1-3 nterspaced egularly r lüsterli birçok bakteri ve en Archaea bulunan bu adaptif bağışıklık sistemi oluşur. Cas proteinler ve tekrarları farklı setleri CRISPR / Cas sistemleri 4 en az üç büyük farklı türlerini tanımlar. Evrensel proteinler Cas1 ve Cas2 viral DNA almasında rol aldığı öne eminuzayan CRISPR küme 5, 5 &#39;terminalinde iki tekrarlar arasında yeni bir ayırıcı eleman oluşturur. Tüm küme tüm boşluk ve tekrar dizileri içeren bir prekürsör-crRNA dönüştürüldü ve daha sonra küçük crRNAs 6-8 içine farklı Cas6 ailesinin bir enzim tarafından işlenir. Bu crRNAs bir 5 &#39;terminal (8 nükleotidler) ve bir 3&#39; Tekrar dizisi 9 türetilmiş uç etiket ile takviye boşluk sekans içerir. Yeni crRNA viral DNA için Cas protein kompleksi (Cascade) yönettiği ve taban tamamlayıcılık 10 üzerinden bu tür olarak tanımlamak olacak gibi virüsün yinelenen A enfeksiyonu artık bloke edilebilir. Nihayet, CRISPR / Cas tip 1 sistemleri için, nükleaz CAS3 tespit işgalci DNA 11,12 yok edecektir. Bu süreçler prokaryot bir adaptif bağışıklık sistemi gibi CRISPR / Cas tanımlamak ve tutulan Cas proteinlerin çalışması için büyüleyici bir araştırma alanı açıldı.Birçok Cas proteinlerin fonksiyonu hala zor olduğunu ve CRISPR / Cas sistemlerinin belirgin çeşitlilik için nedenleri aydınlatılmaya kalır. Çoğu Cas proteinlerin Potansiyel faaliyetleri detaylı hesap analizleri ile tahmin edilmiştir. Cas proteinlerin önemli bir kısmını Görüntülenen veya 4 endonükleazları olarak işlev önerilmiştir. Burada, Cas endoribonucleases çalışma için crRNAs ve öncü-cRNAs oluşturmak için yöntemler sunuyoruz. Farklı endonükleaz deneyleri doğrudan RNA oligonükleotidler veya run-off transkripsiyon vitro T7 RNA polimeraz aracılığıyla oluşturulan uzun crRNA ve pre-crRNA dizileri olarak sentezlenmiş olabilir ya kısa tekrar dizileri gerektirir. Bu metodoloji dahili etiketli endonükleaz yüzeylerde ve sentetik veya mutant crRNAs oluşturulması nesil için radyoaktif nükleotidlerin birleşme sağlar. Cas6 endonükleaz etkinliği 5&#39;-hidr crRNAs ile içine önceden crRNAs olgunlaşması için kullanılmaktadıroksil ve bir 2 &#39;, 3&#39;-siklik fosfat termini.

Watch this Scientific Journal Video about Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems at JoVE.com

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

Bakteri ve Archaea yılında CRISPR / Cas sistemleri aracılık adaptif bağışıklık. Birçok Cas proteinlerin uzunluğu değişen crRNA öncüllerinin hareket endoribonucleases olarak hareket etmek önerilmektedir. Burada Cas endonuclease aktivitesinin biyokimyasal analiz için önceden crRNA yüzeyler oluşturmak için üç farklı yaklaşımlar sergiler.

CRISPR / Cas Sistemleri Endonükleazlar için Substrat Üretimi

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

substrate-generation-for-endonucleases-of-crisprcas-systems

Research

JoVE Journal

Biology

27.2K Görüntüleme.  Max-Planck-Institute for Terrestrial Microbiology. Bakteri ve Archaea yılında CRISPR / Cas sistemleri aracılık adaptif bağışıklık. Birçok Cas proteinlerin uzunluğu değişen crRNA öncüllerinin hareket endoribonucleases olarak hareket etmek önerilmektedir. Burada Cas endonuclease aktivitesinin biyokimyasal analiz için önceden crRNA yüzeyler oluşturmak için üç farklı yaklaşımlar sergiler.

Video: Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human cells has been low, which prevents the generation of human cell lines at a desired rate. The past two years have witnessed a rapid progression on improving efficiency of genetic manipulation by genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system. This manuscript describes a protocol for generating lineage specific human induced pluripotent stem cell (hiPSC) reporters using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination. Procedures for obtaining necessary components for making neural lineage reporter lines using the CRISPR/Cas system, focusing on construction of targeting vectors and single guide RNAs, are described. This protocol can be extended to platform establishment and mutation correction in hiPSCs.

Genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system have greatly improved gene targeting efficiency in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This manuscript describes a protocol for generating lineage specific hiPSC reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination.

HiPSC Sinir Lineage Özgül Knockin Muhabirleri Verimli Nesil kullanma CRISPR / Cas9 ve Cas9 Çift Nickase Sistemi

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Gelişim Biyolojisi

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Genetik

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates, enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Targeted genome editing in the model system Danio rerio (zebrafish) has been greatly facilitated by the emergence of CRISPR-based approaches. Herein, we describe a streamlined, robust protocol for generation and identification of CRISPR-derived nonsense alleles that incorporates the heteroduplex mobility assay and identification of mutations using next-generation sequencing.

Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been co-opted as a powerful tool for precise eukaryotic genome engineering. Here, we present a rapid and simple method using chimeric single guide RNAs (sgRNA) and CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) for the efficient and precise generation of genomic point mutations in C. elegans. We describe a pipeline for sgRNA target selection, homology-directed repair (HDR) template design, CRISPR-Cas9-RNP complexing and delivery, and a genotyping strategy that enables the robust and rapid identification of correctly edited animals. Our approach not only permits the facile generation and identification of desired genomic point mutant animals, but also facilitates the detection of other complex indel alleles in approximately 4 - 5 days with high efficiency and a reduced screening workload.

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Here, we present a method to engineer the genome of C. elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins and homology dependent repair templates.

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

Candida albicans insan mantar patojen genom düzenleme CRISPR-aracılı

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

CRISPRmass Kullanan Yüksek Verimli UAS-cDNA/ORF Plazmid Kitaplığı Yapısı

CRISPR-Based Modular Assembly for High-Throughput Construction of a UAS-cDNA/ORF Plasmid Library

Functional genomics screening offers a powerful approach to probe gene function and relies on the construction of genome-wide plasmid libraries. Conventional approaches for plasmid library construction are time-consuming and laborious. Therefore, we recently developed a simple and efficient method, CRISPR-based modular assembly (CRISPRmass), for high-throughput construction of a genome-wide upstream activating sequence-complementary DNA/open reading frame (UAS-cDNA/ORF) plasmid library. Here, we present a protocol for CRISPRmass, taking as an example the construction of a GAL4/UAS-based UAS-cDNA/ORF plasmid library. The protocol includes massively parallel two-step test tube reactions followed by bacterial transformation. The first step is to linearize the existing complementary DNA (cDNA) or open reading frame (ORF) cDNA or ORF library plasmids by cutting the shared upstream vector sequences adjacent to the 5&#39; end of cDNAs or ORFs using CRISPR/Cas9 together with single guide RNA (sgRNA), and the second step is to insert a UAS module into the linearized cDNA or ORF plasmids using a single step reaction. CRISPRmass allows the simple, fast, efficient, and cost-effective construction of various plasmid libraries. The UAS-cDNA/ORF plasmid library can be utilized for gain-of-function screening in cultured cells and for constructing a genome-wide transgenic UAS-cDNA/ORF library in Drosophila.&#160;

Yazar Spotlight: CRISPRmass Kullanarak Genom Çapında Plazmid Kütüphanesi Yapımını Basitleştirme

We present a protocol for CRISPR-based modular assembly (CRISPRmass), a method for high-throughput construction of UAS-cDNA/ORF plasmid library in Drosophila using publicly available cDNA/ORF resources. CRISPRmass can be applied to editing various plasmid libraries.

CRISPR / Cas Sistemleri Endonükleazlar için Substrat Üretimi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler