Yazarlar, rekombinant T7 RNA polimeraz ve Şekil 1 türlerinin hazırlanması için Norman Ebelt hazırlanması için Schermuly Jeanette teşekkür ederiz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) ve Max Planck Topluluğu fonları tarafından finanse edildi.

1. PCR ile uzun ön crRNA substratların Nesil <ol><li> Bir CRISPR küme boşluk bölgeleri hedefleyen Tasarım PCR primerleri. T7 RNA polimeraz ekleme klonlanması için ileri primer ve kısıtlama siteleri (T7RNAP) promoter sekansı (5 &#39;-taatacgactcactata-3&#39;) iki astarın (pUC19 için örneğin, BamHI ve Hind III, Şek. 2A) bir vektör içine PCR ürünü . Not: T7RNAP transkripsiyonun başlatılması için uygun bir guanidin kalıntı gerektirir. </li><li> PCR ile genomik DNA ilgi öncesi crRNA dizisi Amplify. </li><li> Agaroz jel elektroforezi ile PCR ürünleri ayırın ve jel istenen bant ayıklayın. Yapışkan uçları (örneğin, BamHI ve HindIII, Şek. 2A) oluşturmak için sınırlama enzimleri ile sindirmek PCR ürünü. Yan ürünler bölünme ortadan kaldırmak için, bir PCR arıtma kiti ile PCR ürünü, üzerine koyulmuştur. </li><li> Bir T4 DNA ligaz içerir ligasyon reaksiyonu, T4 DNA ligaz tamponu ve kurmayarılan PCR ürünü ve karşılık gelen yapışkan uçları dephosphorylated doğrusal pUC vektörünün bir molar oranı 3:1. 16 ° C&#39;da gece boyunca karışım inkübe edin. Standart protokoller tarafından yetkili Escherichia coli DH5α hücrelerine ligasyon karışımı Dönüşümü ve başarılı ligasyonu tanımlamak için mavi beyaz tarama kullanın. </li><li> Bir plazmid hazırlık seti kullanarak beyaz kolonilerden plazmid izole edin. Plazmid sekanslamasıyla pozitif klonları tanımlamak. Alternatif olarak, koloni PCR ile tarama için kullanılabilir olabilir. </li></ol> 2. DNA oligonükleotidler tavlama yoluyla orta öncesi crRNA substratların Nesil <ol><li> İleri Tasarım ve istenilen CRISPR tekrarlama / boşluk dizisi ile oligonükleotidler tersine. Oligonükleotidler bir T7 promotörü RNAP hem de uç kısıtlama siteleri (pUC19 için örneğin, BamHI ve Hind III) &#39;ün sekansı içerir. (Bkz. Şek. 2B Tavlama sonrası bu yapışkan uçları formu sağlamak için oligonükleotidler Terminate </sTrong&gt;). </li><li> T4 polinükleotid kinaz 5 ul (PNK), T4 PNK 10x tampon, 2 ul ATP (10 mM) ve 2 ul ihtiva eden bir ayrı 20uL reaksiyon bölgesindeki her bir oligonükleotid 5&#39;-fosforile 1 nmol. 37 de 1 saat için her bir örnek inkübe ° C. </li><li> İki fosforile oligonükleotidler melezleşme. Fosforlu ileri oligo karışımı (2.2)., Fosforlu ters oligo karışımı (2.2)., Bir 10 ul reaksiyon 10x T4 DNA ligaz tamponu 1 ul 1 ul 1μl birleştirin. 95 az 5 dakika süreyle örneklerin inkübe ° bir ısıtma bloğu veya kaynar suda C, ısı kaynağını kapatın ve oda sıcaklığında (~ 2-3 saat) aşağı karışımı soğumaya bırakın. Not: Bu kritik adımda, yavaş soğutma işlemi her biri tek bir oligonükleotid içindeki yapıların oluşumu ile karşılaştırıldığında, iki oligonükleotidlerin tavlanması yanadır. </li><li> Sindirilir ve dephosphorylated pUC vektör 1μl hibridizasyon karışımı 4 ul, (Arter 0.1 mikrogram /T4 DNA ligazı, 10x T4 DNA ligaz tampon ve bir 20 mikrolitre ligasyon karışımı içinde, 10 mM ATP) ile ul. 16 ° C&#39;da gece boyunca numune inkübe edin. </li><li> Standart protokoller tarafından yetkili Escherichia coli DH5α hücrelerine bağlanan plazmid Dönüşümü ve mavi beyaz tarama kullanır. Plazmid izole ve sindirim (istenilen büyüklükte uçlar için ekrana) ve sonraki plazmid sekanslamasıyla pozitif klonları tanımlamak. </li></ol> 3. Özel RNA oligonükleotid sentezi yoluyla kısa Cas RNA substratların Nesil Tasarım kısa Cas RNA yüzeylerde (örn. tek tekrar dizileri, Şek. 2C) ve özel RNA oligonükleotid sentezi imkanları kullanmaktadır. Not: RNA oligonükleotid belirtilen bir pozisyonu (Şekil 2C) bir deoksiribonükleotid dahil edilmesi, RNA bölünme yerinde kesin olarak belirlemek için kullanılabilir. 4. In vitro T7 RNA polimeraz transkripsiyon <ol><li> Senin tasarlanmış yapı (1.9. Veya 2.7 &#39;den.) Bir maxiprep plazmid saflaştırma kiti kullanılarak plazmid izole edin. </li><li> Klonlanmış parçası (örneğin Hind III) akış aşağı parçalayarak kısıtlama enzimi ile linearize plazmid. Tam sindirim olun. Not: RNA transkriptinin farklı tanımlanmış bir 3 &#39;terminaline istenirse, tasarlanmış bir yapı HindIII sekans yukarı akış yönünde &quot;run-off&quot; transkripsiyon için ilave bir belirli sınırlandırma bölgesi içermelidir. </li><li> Kloroform (1:1) ekstraksiyon ve etanol yağış: lineerleştirilebilir fenol plazmid arındırın. DEPC işlenmiş steril suda pelet resuspending göre nükleik asitler kurtarma. </li><li> In vitro T7 RNAP içinde bir 40 mM Hepes / KOH (pH 8), 22 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 1 mM spermidin, her bir nükleosit trifosfat 4 mM (ATP, CTP, GTP, UTP içeren transkripsiyon karışım kapalı çalışır ayarlama ), 40-100 ug / ml arasında sindirilmişplazmid ve DEPC işlenmiş su içinde 0.1 mg / ml T7 RNAP. 37 C&#39;de 3 saat için inkübe ° C. </li><li> Bir 8 M üre denatüre% 12 poliakrilamid jel (Şekil 3A) üzerinde elde edilen RNA transkriptleri analiz edin. RNA transkriptleri Mono Q anyon değişim kromatografisi yolu ile saflaştırıldı ve 13 DEPC işlenmiş steril suda RNA fraksiyonu ve pelet yeniden süspanse edilmesi ve etanol çökeltme ile geri kazanılabilir. Gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C&#39;de saklayın RNA </li></ol> 5. Cas6 endonükleaz tahlil <ol><li> Bir ayarlama Vitro T7 RNAP 20 ul 2 mM ATP azaltılmış miktarda içerir ve ile tamamlanmaktadır (4.4) transkripsiyon karışımı kaçıp 2.5 ul α-[32 P]-ATP (10 mCi / ml, 5000 Ci / mmol). Bir denatüre edici 8 M üre,% 12 poliakrilamit jel arasından jel çıkarma yolu ile reaksiyon ürünleri, temizler. Otoradyografi bantları gözünüzde canlandırın. </li><li> İstediğiniz rekombinant Cas proteinler üretin ve arındırmak. Bu örnekte, CClostridium thermocellum dan AS6 ısı çökeltme ve Ni-NTA kromatografi yolu ile saflaştınldı. </li><li> Clostridium thermocellum Cas6 için bir endonükleaz tahlil reaksiyon (örneğin ayarlama, reaksiyon karışımı, 20 mM Hepes (KOH PH8), 250 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 12,000 cpm RNA alt tabaka ve 1 uM enzim içeren ve inkübe edildi 37 ° C&#39;de 30 dakika süre ile). </li><li> 8 M üre, bir% 12 poliakrilamid jel üzerinde reaksiyon karışımı (% 95 formamit ihtiva eden 10 ul + RNA, yükleme tamponu) 5 ul yerleştirin. Otoradyografi elektroforez sonrası parçalanma ürünleri gözünüzde canlandırın. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Cas endonükleaz etkinliği analizi için substrat RNA&#39;nın bir örneği Şekil 3A&#39;da gösterilmiştir. In vitro transkripsiyon reaksiyonunda bir analitik 100 ul 5 ul lik bir örnek yüklendi. RNA üretim verimliliğini Farklı yapıları arasındaki farklılık gösterebileceğini unutmayın. Bazı faktörler tşapka transkripsiyon başlatma için gereken +1 G, transkripsiyon sırasında RNA yapı formasyonu (ii) olasılığı ve üretim için sınırlama alanı (iii) aşağıdaki tercih olup elde edilen RNA miktarı, (i) ilk sıra etki gözlenmiştir run-off bölünme pozisyonunun. RNA endonükleaz aktivite incelemesi hem yüksek oranda saflaştırılmış rekombinant Cas proteinler (Şekil 3B) ve uygun negatif kontroller gerektirir. İdeal olarak, bu negatif kontrol örneği incelenmiştir Cas endonükleaz reaksiyon mümkün olduğunca az farklıdır. Bu ifade Cas (ve aynı arıtma prosedürü izleyerek) olmadan reaksiyon tamponu ve hücre lizatı ile RNA inkübasyon yoluyla elde edilebilir. İdeal bir negatif kontrol önerilen bölünme sitesinin bir deoksiribonükleotid bir eklenmesidir. Şekil 3C, bir 5 &#39;terminal tekrarı etiketli dizisinin bölünme Clostridium thermocellum Cas6 için gösterilir. Altında<html> aynı koşullar, bu tekrar bir deoksiribonükleotid, -9 pozisyonunda tanıtıldıktan sonra artık bir substrat değildir. Bu yöntem aynı zamanda bölünme sitesinin ilgili bilgi sağlar. Son olarak, bir uzun içten etiketli ön crRNA Cas6 ile parçalanır ve iki yarılma parçaları görülmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig1.jpg" /> CRISPR / Cas aktivitesi Şekil 1. Şematik gösterimi. Genel CRISPR küme (adaptasyon), bir Cas6 endonükleaz ile küçük crRNAs içine CRISPR dizi transkripsiyonu ve işleme, Cascade kompleksi içine crRNAs alımını ve müdahalesi bir viral DNA dizisi (protospacer) yerleştirilmesini takip crRNA ve protospacer arasındaki tamamlayıcılık esas viral saldırı tekrarladı. Protospacer bitişik motifler (PAM) işareti viral protospacer dizileri. ŞEKIL 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. Cas proteinleri RNA substratların Nesil. Düzeni (A) uzun ön crRNA substratlar, (B), orta ön crRNA alt tabakalar ve ön-crRNA üretimi için (C) kısa Cas RNA alt tabakalar üretmek için akışı gösterilmektedir. Örnek dizileri Clostridium thermocellum arasında CRISPR dizisi için sunulmuştur. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4277/4277fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig3.jpg" /> Şekil 3. Cas6 endonükleaz denemesi. A.) Toluidin blue ile boyanan poliakrilamid özel tasarlanmış RNA oligonükleotid (250 pmol) jel ve in vitro RNA transkriptleri (tipik 100 ul reaksiyon 5 ul) iki. Isı sonra Clostridium thermocellum bir Cas6 hazırlık (80 pmol) B.) SDS-PAGE jel1 saat ve Ni-NTA kromatografisi için 50 ° C de yağış. 5 &#39;terminal etiketli tekrar sıraları ve in vitro transkriptleri ön crRNA için endonucleolytic Cas6 aktivitesi C) tespit eder. -9 Pozisyonunda bir dNTP tanıtımı kısa Cas RNA substratın (S, Şek. 2C) için Cas6 bölünme ortadan kaldırmaktadır. Bir 5 &#39;terminal 8 nt etiketi de uzun ön crRNA substratlar (L, Şek. 2A) dan crRNA olgunlaşması için oluşturulur. Bantları denatüre 8 M üre% 12 poliakrilamid jel üzerinde ayrılmış ve otoradyografi ile görselleştirilmiş edildi.

<ol>
	<li>Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes.">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315, 1709-1712 (2007).</li><li>Makarova, K. S., Grishin, N. V., Shabalina, S. A., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+RNA-interference-based+immune+system+in+prokaryotes:+computational+analysis+of+the+predicted+enzymatic+machinery,+functional+analogies+with+eukaryotic+RNAi,+and+hypothetical+mechanisms+of+action.">A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action.</a> Biol. Direct. 1, 7 (2006).</li><li>Lillest&#248;l, R. K., Redder, P., Garrett, R. A., Brugger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+viral+defence+mechanism+in+archaeal+cells.">A putative viral defence mechanism in archaeal cells.</a> Archaea. 2, 59-72 (2006).</li><li>Makarova, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+classification+of+the+CRISPR-Cas+systems.">Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9, 467-477 (2011).</li><li>Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes.">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321, 960-964 (2008).</li><li>Carte, J., Pfister, N. T., Compton, M. M., Terns, R. M., Terns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+and+cleavage+of+CRISPR+RNA+by+Cas6.">Binding and cleavage of CRISPR RNA by Cas6.</a> RNA. 16, 2181-2188 (2010).</li><li>Haurwitz, R. E., Jinek, M., Wiedenheft, B., Zhou, K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-+and+structure-specific+RNA+processing+by+a+CRISPR+endonuclease.">Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease.</a> Science. 329, 1355-1358 (2010).</li><li>Gesner, E. M., Schellenberg, M. J., Garside, E. L., George, M. M., Macmillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+maturation+of+effector+RNAs+in+a+CRISPR+interference+pathway.">Recognition and maturation of effector RNAs in a CRISPR interference pathway.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 688-692 (2011).</li><li>Carte, J., Wang, R., Li, H., Terns, R. M., Terns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas6+is+an+endoribonuclease+that+generates+guide+RNAs+for+invader+defense+in+prokaryotes.">Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes.</a> Genes Dev. 22, 3489-3496 (2008).</li><li>Wiedenheft, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+RNA-guided+surveillance+complex+from+a+bacterial+immune+system.">Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system.</a> Nature. 477, 486-489 (2011).</li><li>Garneau, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468, 67-71 (2010).</li><li>Sinkunas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas3+is+a+single-stranded+DNA+nuclease+and+ATP-dependent+helicase+in+the+CRISPR/Cas+immune+system.">Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system.</a> EMBO J. 30, 1335-1342 (2011).</li><li>Jahn, M. J., Jahn, D., Kumar, A. M., S&#246;ll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mono+Q+chromatography+permits+recycling+of+DNA+template+and+purification+of+RNA+transcripts+after+T7+RNA+polymerase+reaction.">Mono Q chromatography permits recycling of DNA template and purification of RNA transcripts after T7 RNA polymerase reaction.</a> Nucleic Acids Res. 19, 2786-2787 (1991).</li><li>Sampson, J. R., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+physical+characterization+of+an+unmodified+yeast+phenylalanine+transfer+RNA+transcribed+in+vitro.">Biochemical and physical characterization of an unmodified yeast phenylalanine transfer RNA transcribed in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 1033-1037 (1988).</li><li>Dreher, T. W., Bujarski, J. J., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+viral+RNAs+synthesized+in+vitro+show+altered+aminoacylation+and+replicase+template+activities.">Mutant viral RNAs synthesized in vitro show altered aminoacylation and replicase template activities.</a> Nature. 311, 171-175 (1984).</li><li>McGinness, K. E., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitution+of+ribonucleotides+in+the+T7+RNA+polymerase+promoter+element.">Substitution of ribonucleotides in the T7 RNA polymerase promoter element.</a> J. Biol. Chem. 277, 2987-2991 (2002).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Sunulan yöntemler farklı boyut aralıkları Cas endonükleaz substratların oluşturmayı etkinleştirmek ve sıra tasarım özgürlüğü değişen. Sentetik RNA oligonükleotid substratların nesil için en düz ileri yaklaşım artık RNA oligomerler oluşturarak artan maliyetler ve teknik sınırlamalar nedeniyle kısa RNA tasarımları ile sınırlıdır. Başarılı RNA sentezi üzerinde 100 nükleotid uzunlukta değiştirilmemiş RNA oligomerleri için rapor edilmiş olsa da, özel RNA sentezi için pratik ve ekonomik azami altında 40 nükleotidler yatıyor. Ancak, herhangi bir sıra sentez edilebilir ve modifiye nükleotidler (örn. deoxyribonucleotides) ve hedeflenen giriş ayrıntılı olarak yarılma bölgeleri analiz etmek için kullanılabilir. Daha uzun ön cRNAs in vitro transkripsiyon kullanılarak oluşturulan olmalıdır. Bir T7 RNA polimeraz promotörü içeren oligonükleotidler ara tavlama uzunluğu önceden crRN üretimi için olanak sağlarGibi. Rutin olarak ve ekonomik olarak sentezlenmiş oligonükleotid DNA&#39;nın maksimum uzunluğu sadece 150 nükleotid üzerinde ve bu yöntem vasıtasıyla sentetik ön crRNAs azami temsil eder. Birbirleri ile yapışkan uçları oluştururlar birkaç tavlı DNA oligonükleotid çiftleri düzeneği bu maksimal uzatmak ancak yapının klonlama artan zorlukları zorunlu olabilir. Bu yöntemin başlıca avantajı, herhangi bir istenen sırada ile ön crRNA yapıları (ve bu nedenle Cas endonükleaz substrat) oluşturmak için yeteneğidir. Bu sentetik crRNA tasarımları test yapılmasını sağlar. Son olarak, daha büyük bir ön crRNAs bunların tüm genomik CRISPR elemanları ya da fraksiyonları PCR amplificates elde edilebilir. In vitro transkripsiyon plasmidi şablon olarak değişiklikler için önceden crRNA varyantlarının üretilmesi için site-yönlendirmeli mütajenez yoluyla sokulabilir. Bu yapı, bir bütün içinde küresel endonucleolytic bölünme kalıp analiz etmek için de kullanılabilirön crRNA. In vitro transkripsiyon içinde T7 RNA polimeraz aracılığıyla değiştirilmemiş RNA üretimi için öncü çalışma devri RNA&#39;lar 14 ve brom mozaik virüs RNA 15 dayanmaktadır. Uzlaşma T7 RNA polimeraz promotörü bir tanıma alanı (-5 ile -17) ve önemli bir guanozin +1 16 de transkripsiyon başlangıcı olan bir inisiyasyon alanı (+6 aracılığıyla -4) oluşmaktadır. +1 Pozisyonlar akış hemen hemen arzu edilen herhangi bir RNA sekansının transkripsiyon olanak sağlayan çeşitli olabilir. In vitro transkripsiyon akıntısı oluşturmak için şablon olarak sunulan yöntemler CRISPR genomik bölge ya da sentetik ön crRNA türevleri neticesinde komple bir ön-crRNAs in vitro sentezi için izin verir. Transkripsiyon reaksiyonu 5 &#39;monofosfat termini 14 elde etmek için GMP ile astarlanmalıdır sürece dökümleri 5&#39;-terminali trifosfat mevcut oluşturulur. Transkript etiketli isteniyorsa, bu tür termini gerekmektedirT4 polinükleotid kinaz ve γ-[32 P]-ATP. sahip Cas6 ve Cas6-benzeri enzim aktivitesi Yarılma 5&#39;-hidroksil ile bir 2 &#39;, 3&#39;-siklik fosfat termini ihtiva crRNA oluşturur. Bu RNA&#39;lar sonra Cascade kompleksi tarafından tanınması için analiz edilebilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Antarktika Fosfataz </td><td> NEB </td><td> M0289L </td><td></td></tr><tr><td> In vitro transkripsiyon Sınıf Ultrasaf Nükleotid trifosfatlar içinde </td><td> Bioscience Jena </td><td> NU-1010 - NU-1013 </td><td></td></tr><tr><td> Sıvı kromatografisi, ktapurifier 100 </td><td> GE Healthcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DNA oligonükleotidler </td><td> MWG Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> RNA oligonükleotidler </td><td> MWG Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Jel Ekstraksiyon Kiti </td><td> QIAGEN </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> PCR saflaştırma Kiti </td><td> QIAGEN </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Spin Miniprep Kiti </td><td> QIAGEN </td><td> 27106 </td><td></td></tr><tr><td> Plazmid Maxi Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 12163 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> NEB </td><td> R0136L </td><td></td></tr><tr><td> HindIII </td><td> NEB </td><td> R0104L </td><td></td></tr><tr><td> T4 DNA Ligaz </td><td> NEB </td><td> M0202S </td><td></td></tr><tr><td> T4 polinükleotid kinaz </td><td> Ambion </td><td> AM2310 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA Polimeraz </td><td> Kendi hazırlığı </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoksinükleotid Çözüm Mix </td><td> NEB </td><td> N0447L </td><td></td></tr><tr><td> Mini Protean Tetra Elektroforez Sistemi </td><td> Bio-Rad </td><td> 165-8001 </td><td></td></tr><tr><td> Fırtına 840 Tarayıcı </td><td&gt; GE Healthcare </td><td> 163723 </td><td></td></tr><tr><td> Depolama Phosphorscreen </td><td> Moleküler Dinamik </td><td> 63-0034-81 </td><td></td></tr><tr><td> Mono Q 5/50 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5166-01 </td><td></td></tr><tr><td> Phusion Yüksek Sadakat DNA Polimeraz </td><td> NEB </td><td> M0530L </td><td> GC tampon kullanın </td></tr><tr><td> Toluidin Blue </td><td> Sigma </td><td> T3260 </td><td></td></tr><tr><td> pUC19 </td><td> NEB </td><td> N3041S </td><td></td></tr><tr><td> γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP </td><td> Hartmann Analitik </td><td> SRP-401, SRP-307 </td><td></td></tr></tbody></table>

substrate generation for endonucleases of crispr/cas systems

Virüsler ve prokaryotik ana etkileşim bakteri ve arke yaşamın evrimini şekillendirdi. Prokaryotlar restriksiyon modifikasyon, başarısız enfeksiyon ve CRISPR / Cas sistemlerini içerir viral saldırılardan kaçınmak için çeşitli stratejiler geliştirilmiştir. C i s hort p alindromic r EPEAT (CRISPR) dizileri ve sociated (Cas) genler olarak C RISPR bir dizi (Şekil 1) 1-3 nterspaced egularly r lüsterli birçok bakteri ve en Archaea bulunan bu adaptif bağışıklık sistemi oluşur. Cas proteinler ve tekrarları farklı setleri CRISPR / Cas sistemleri 4 en az üç büyük farklı türlerini tanımlar. Evrensel proteinler Cas1 ve Cas2 viral DNA almasında rol aldığı öne eminuzayan CRISPR küme 5, 5 &#39;terminalinde iki tekrarlar arasında yeni bir ayırıcı eleman oluşturur. Tüm küme tüm boşluk ve tekrar dizileri içeren bir prekürsör-crRNA dönüştürüldü ve daha sonra küçük crRNAs 6-8 içine farklı Cas6 ailesinin bir enzim tarafından işlenir. Bu crRNAs bir 5 &#39;terminal (8 nükleotidler) ve bir 3&#39; Tekrar dizisi 9 türetilmiş uç etiket ile takviye boşluk sekans içerir. Yeni crRNA viral DNA için Cas protein kompleksi (Cascade) yönettiği ve taban tamamlayıcılık 10 üzerinden bu tür olarak tanımlamak olacak gibi virüsün yinelenen A enfeksiyonu artık bloke edilebilir. Nihayet, CRISPR / Cas tip 1 sistemleri için, nükleaz CAS3 tespit işgalci DNA 11,12 yok edecektir. Bu süreçler prokaryot bir adaptif bağışıklık sistemi gibi CRISPR / Cas tanımlamak ve tutulan Cas proteinlerin çalışması için büyüleyici bir araştırma alanı açıldı.Birçok Cas proteinlerin fonksiyonu hala zor olduğunu ve CRISPR / Cas sistemlerinin belirgin çeşitlilik için nedenleri aydınlatılmaya kalır. Çoğu Cas proteinlerin Potansiyel faaliyetleri detaylı hesap analizleri ile tahmin edilmiştir. Cas proteinlerin önemli bir kısmını Görüntülenen veya 4 endonükleazları olarak işlev önerilmiştir. Burada, Cas endoribonucleases çalışma için crRNAs ve öncü-cRNAs oluşturmak için yöntemler sunuyoruz. Farklı endonükleaz deneyleri doğrudan RNA oligonükleotidler veya run-off transkripsiyon vitro T7 RNA polimeraz aracılığıyla oluşturulan uzun crRNA ve pre-crRNA dizileri olarak sentezlenmiş olabilir ya kısa tekrar dizileri gerektirir. Bu metodoloji dahili etiketli endonükleaz yüzeylerde ve sentetik veya mutant crRNAs oluşturulması nesil için radyoaktif nükleotidlerin birleşme sağlar. Cas6 endonükleaz etkinliği 5&#39;-hidr crRNAs ile içine önceden crRNAs olgunlaşması için kullanılmaktadıroksil ve bir 2 &#39;, 3&#39;-siklik fosfat termini.

Watch this Scientific Journal Video about Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems at JoVE.com

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

Bakteri ve Archaea yılında CRISPR / Cas sistemleri aracılık adaptif bağışıklık. Birçok Cas proteinlerin uzunluğu değişen crRNA öncüllerinin hareket endoribonucleases olarak hareket etmek önerilmektedir. Burada Cas endonuclease aktivitesinin biyokimyasal analiz için önceden crRNA yüzeyler oluşturmak için üç farklı yaklaşımlar sergiler.

CRISPR / Cas Sistemleri Endonükleazlar için Substrat Üretimi

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

substrate-generation-for-endonucleases-of-crisprcas-systems

Research

JoVE Journal

Biology

27.2K Görüntüleme.  Max-Planck-Institute for Terrestrial Microbiology. Bakteri ve Archaea yılında CRISPR / Cas sistemleri aracılık adaptif bağışıklık. Birçok Cas proteinlerin uzunluğu değişen crRNA öncüllerinin hareket endoribonucleases olarak hareket etmek önerilmektedir. Burada Cas endonuclease aktivitesinin biyokimyasal analiz için önceden crRNA yüzeyler oluşturmak için üç farklı yaklaşımlar sergiler.

Video: Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Teşhis Araçları Geliştirmek İçin Mikro-Elektro-Mekanik Sistemler (MEMS)

Biyoloji

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of cells (approximately 25 in C. borealis) which are well characterized. The cells in the STG exhibit a broad range of outputs and are responsible for the motor actions of the stomach. The stomach contains the gastric mill which breaks down food with three internal teeth, and the pylorus which filters the food before it reaches the midgut. The STG produces two rhythmic outputs to control the gastric mill and pylorus known as central pattern generators (CPGs). Each cell in the STG can participate in one or both of these rhythms. These CPGs allow for the study of neuromodulation, homeostasis, cellular and network variability, network development, and network recovery.
The dissection of the stomatogastric nervous system (STNS) from the Jonah crab (Cancer borealis) is done in two parts; the gross and fine dissection. In the gross dissection the entire stomach is dissected from the crab. During the fine dissection the STNS is extracted from the stomach using a dissection microscope and micro-dissection tools (see figure 1). The STNS includes the STG, the oesophageal ganglion (OG), and the commissural ganglia (CoG) as well as the nerves that innervate the stomach muscles. Here, we show how to perform a complete dissection of the STNS in preparation for an electrophysiology experiment where the cells in the STG would be recorded from intracellularly and the peripheral nerves would be used for extracellular recordings. The proper technique for finding the desired nerves is shown as well as our technique of desheathing the ganglion to reveal the somata and neuropil.

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric nervous system (STNS) of the Jonah crab (C. borealis) can be used for electrophysiology, immunohistochemistry, and cell culture studies. The STNS extraction is done in two parts: the gross and fine dissection.

Kanser Borealis Stomatogastric Sinir Sistemi Diseksiyon

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Brüt Diseksiyon Lobster Mide, Homarus americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

İnsan CD40 aktive B hücreleri üretilmesi

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Bitki protoplast Floresan Aktif Hücre Ayırma

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Biyolojik Sistemleri Oksijen Görüntüleme Fosforlu Nanoprobes sentezi ve Kalibrasyon

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

Fazlararası Hücre Çekirdek Mekanik Özellikleri Probe Biyofiziksel Tahliller: Yüzey Gerilme Uygulama ve Microneedle Manipülasyon

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

Mikrobiyal Systems Biyoloji Chemostats Kullanımı

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Epigenetik yeniden programlanması ile hESC itibaren Myospheres Üretimi

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...