המחברים מבקשים להודות לג&#39;נט Schermuly להכנת רקומביננטי פולימראז T7-RNA וEbelt נורמן לסיוע בהכנת האיור 1. עבודה זו מומנה על ידי קרנות מForschungsgemeinschaft דויטשה (DFG FOR1680) ומקס פלאנק החברה.

1. דור של מצעים ארוכים מראש crRNA באמצעות PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פריימרים עיצוב PCR מיקוד אזורי spacer של אשכול CRISPR. הוסף RNA פולימראז T7 (T7RNAP) רצף אמרגן (5 &#39;-taatacgactcactata-3&#39;) לפריימר קדימה ואתרי הגבלה לשיבוט מוצר PCR לוקטור לשני פריימרים (2A למשל BamHI ושלישי לינד pUC19, איור.) . הערה: T7RNAP דורש שאריות guanidine לחניכה תקינה של שעתוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Amplify הרצף של ריבית לפני crRNA מהדנ&quot;א הגנומי באמצעות PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את מוצרי PCR ידי אלקטרופורזה agarose ג&#39;ל וג&#39;ל לחלץ להקה הרצויה. לעכל את מוצר PCR עם אנזימי ההגבלה כדי ליצור קצוות דביקים (למשל BamHI וHindIII, איור. 2A). לטהר מוצר ה-PCR שלך עם ערכת טיהור PCR לחסל מחשוף לפי מוצרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תגובת קשירה המכילה דנ&quot;א ligase T4, מאגר ligase DNA T4 ויחס טוחן 03:01 במוצר ה-PCR ובקע את וקטור PUC יניארי dephosphorylated עם קצוות דביקים מתאימים. דגירה את התערובת על 16 מעלות צלזיוס למשך הלילה. להפוך את תערובת הקשירה לתאי Escherichia coli DH5α מוסמכים בפרוטוקולים סטנדרטיים ולהשתמש הקרנה לבנה כחולה לזהות קשירה מוצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבודד פלסמידים ממושבות לבנות באמצעות ערכת הכנת פלסמיד. זהה שיבוטים חיוביים על ידי רצף הפלסמיד. לחלופין, המושבה PCR עלול להיות מנוצל להקרנה. </li></ol> 2. דור ביניים מראש crRNA המצעים דרך החישול של oligonucleotides דנ&quot;א <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצב קדימה לאחור oligonucleotides עם הרצף הרצוי CRISPR החוזר / spacer. את oligonucleotides מכיל רצף של אמרגן T7 RNAP כמו גם באתרי הגבלת מסוף (למשל BamHI ושלישי לינד pUC19). לסיים את oligonucleotides כדי להבטיח צורת קצוות דביקה שלאחר החישול (ראה איור. 2B </sטרונג&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5&#39;-phosphorylate nmol 1 מתוך כל oligonucleotide בתגובת 20μl נפרדת הכוללת 5 μl של קינאז polynucleotide T4 (PNK), 2 μl של חיץ T4 PNK 10x, 2 ATP μl (10 מ&quot;מ). דגירה כל דגימה במשך שעה 1 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכליא שני oligonucleotides phosphorylated. שלב 1μl של תערובת phosphorylated קדימה Oligo (מ -2.2)., Μl 1 מתוך תערובת phosphorylated ההפוך Oligo (מ -2.2)., Μl 1 מתוך מאגר T4 DNA ligase 10x בתגובת μl 10. דגירת הדגימות למשך 5 דקות ב 95 ° C על בלוק חימום או במים רותחים, כבה את מקור החום ותן לתערובת להתקרר לטמפרטורת חדר (~ 2-3 שעות). הערה: בשלב קריטי זה, תהליך הקירור האיטי מעדיף את החישול של שני oligonucleotides השוואה להיווצרות של מבנים בתוך כל oligonucleotide אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור 4 μl של תמהיל ההכלאה, 1μl של וקטור PUC מתעכל וdephosphorylated (0.1 מיקרוגרם /μl) עם ligase T4-DNA, מאגר ligase 10x DNA T4 ו 10 מ&quot;מ ATP בתערובת קשירה 20 μl. דגירת המדגם ב 16 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את גבעול פלסמידים לתאי Escherichia coli DH5α מוסמכים בפרוטוקולים סטנדרטיים ולנצל הקרנה לבנה כחולה. לבודד ולזהות פלסמידים שיבוטים חיוביים על ידי עיכול (להקרין למוסיף בגודל רצוי) ורצף פלסמיד שלאחר מכן. </li></ol> 3. דור של קאש רנ&quot;א מצעים קצרים באמצעות סינתזת RNA oligonucleotide המותאם אישית עיצוב הקצר קאש רנ&quot;א מצעים (למשל רצפים בודדים חוזרים, איור. 2C) ולנצל את מתקני סינתזת RNA oligonucleotide מותאמים אישית. הערה: הכללת deoxyribonucleotide במיקום מצוין של oligonucleotide רנ&quot;א (איור 2 ג) ניתן להשתמש כדי לאתר את האתר של מחשוף רנ&quot;א. 4. במבחנה Tשעתוק 7 RNA פולימראז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבודד פלסמידים עם המבנה תוכנן (מ -1.9. או 2.7.) באמצעות ערכת טיהור פלסמיד maxiprep. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize פלסמיד עם אנזים ההגבלה שחותך במורד זרם של הבר המשובט (למשל HindIII). ודא עיכול מלא. הערה: אם התחנה סופית מוגדר 3 מסתעפים &quot;של תעתיק הרנ&quot;א היא רצויה, המבנה תוכנן צריך להכיל אתר הגבלה ספציפית נוסף לשעתוק&quot; ניגר &quot;במעלה זרם של רצף HindIII. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את הפלסמיד לינארית ידי פנול: כלורופורם חילוץ (1:1) ומשקעי אתנול. לשחזר את חומצות גרעין על ידי resuspending הגלולה במים סטריליים טופלו DEPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה במבחנת T7 RNAP לברוח תערובת שעתוק שמכילה 40 Hepes מ&quot;מ / Koh (pH 8), 22 המ&quot;מ MgCl 2, 5 המ&quot;מ dithiothreitol, spermidine 1 mM, 4 מ&quot;מ מכל טריפוספט nucleoside (ATP, CTP, GTP, UTP ,) 40-100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של מתעכלפלסמיד ומ&quot;ג / מיליליטר T7 RNAP 0.1 במים שטופלו DEPC. דגירה במשך 3 שעות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את תעתיקי רנ&quot;א מתקבלים על 12% ג&#39;ל polyacrylamide denaturing אוריאת ז 8 (איור 3 א). תעתיקי רנ&quot;א יכולים להיות מטוהרים דרך מונה ש אניון חילופי כרומטוגרפיה 13 והתאוששו על ידי משקעי אתנול משברי RNA וresuspension של הגלולה במים סטריליים DEPC טופל. לשימוש עתידי, לאחסן RNA ב-80 ° C. </li></ol> 5. assay endonuclease Cas6 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה 20 μl במבחנת T7 RNAP לברוח תערובת שעתוק (ראה 4.4) המכילה כמות מופחתת של 2 המ&quot;מ ATP והוא השלים עם 2.5 μl α-[32 P]-ATP (10 mCi / מ&quot;ל, 5000 / mmol Ci). לטהר את תוצרי תגובה באמצעות מיצוי ג&#39;ל מ12% M ג&#39;ל denaturing 8 אוריאה polyacrylamide. דמיינו להקות ידי autoradiography. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר ולטהר את החלבונים רקומביננטיים CAS הרצויים. בדוגמה זו, Cas6 מClostridium thermocellum טוהר באמצעות חום ומשקעי Ni-נ.ת. ע כרומטוגרפיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תגובת endonuclease assay (למשל עבור Clostridium thermocellum Cas6, תגובת התערובת מכילה 20 Hepes מ&quot;מ (KOH pH8), 250 המ&quot;מ KCl, 2 המ&quot;מ MgCl 2, 1 mM DTT, מצע 12,000 עותקים RNA ואנזים מיקרומטר 1 והודגר ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 5 μl של תערובת התגובה (+ 10 חיץ μl רנ&quot;א טעינה המכיל 95% פוראמיד) על 12% ג&#39;ל M 8 אוריאה polyacrylamide. דמיינו את מוצרי ביקוע לאחר אלקטרופורזה ידי autoradiography. </li></ol> 6. נציג תוצאות דוגמה של רנ&quot;א מצעים לניתוח פעילות endonuclease קאש מוצגת באיור 3 א. Aliquot של 5 μl של 100 μl אנליטית בתגובת שעתוק במבחנה היה טעון. שים לב שהיעילות של הפקת רנ&quot;א משתנית בין מבנים שונים. חלק לא גורמיםכובע נצפו להשפיע על הכמות של RNA המתקבל הן (i) את הרצף הראשוני בעקבות 1 G נדרש לייזום שעתוק, (ii) את האפשרות של היווצרות מבנה רנ&quot;א במהלך שעתוק ו( ג) הבחירה של אתר ההגבלה לדור של עמדת המחשוף ניגר. החקירה של פעילות endonuclease RNA דורשת גם חלבונים מטוהרים מאוד רקומביננטי קאש (איור 3) ופקדים שליליים מתאימים. באופן אידיאלי, מדגם שליטה שלילית זו שונה מעט ככל האפשר מהתגובה חקרה קאש endonuclease. זו יכולה להיות מושגת על ידי דגירה של רנ&quot;א עם חיץ ותגובת התא lysate בלי קאש ביטוי (ולאחר הליך הטיהור הזהה). שליטה שלילית אידיאלית היא התוספת של deoxyribonucleotide באתר המחשוף המוצע. באיור 3C, המחשוף של רצף חוזר מסוף 5 &#39;שכותרתו מוצג לClostridium thermocellum Cas6. תחת<html> תנאים זהים, חזור על זה לא מצע יותר כאשר deoxyribonucleotide הוא הציג בעמדה -9. שיטה זו גם מספקת מידע על אתר המחשוף. לבסוף, שכותרתו פנימית-crRNA מראש ארוך הוא בקע ידי Cas6 ושני שברי ביקוע הם נצפו. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig1.jpg" /> איור 1. סקירה סכמטי של פעילות CRISPR / קאש. הסקירה הבאה ההחדרה של רצף ה-DNA נגיפי (protospacer) לאשכול CRISPR (הסתגלות), השעתוק והעיבוד של מערך CRISPR לcrRNAs הקטן על ידי Cas6 endonuclease, הספיגה של crRNAs לתוך מתחם האשד וההתערבות של חזר התקפה נגיפית המבוססת על השלמה בין crRNA וprotospacer. מוטיבי Protospacer סמוכים (PAM) רצפי protospacer נגיפיים מארק. igure 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. דור של רנ&quot;א מצעים לחלבוני קאש. התכנית מציגה את תהליך העבודה ליצירה () ארוכים מראש crRNA מצעים, (ב) ביניים מראש crRNA מצעים ו( C) הקצרים קאש רנ&quot;א מצעים לייצור מראש crRNA. רצפי דוגמה מוצגים למערך CRISPR של Clostridium thermocellum. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4277/4277fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig3.jpg" /> איור 3. Cas6 assay endonuclease. ג&#39;ל א) Toluidine הכחול מוכתם polyacrylamide של oligonucleotide רנ&quot;א מותאם במיוחד (250 pmol) ושתיים במבחנת רנ&quot;א תמלילים (5 μl של תגובה אופיינית μl 100). ג&#39;ל ב) SDS-PAGE של Cas6 הכנה (80 pmol) מClostridium thermocellum אחרי חוםמשקעים ב 50 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 וכרומטוגרפיה Ni-נ.ת. ע. ג) איתור של Cas6 פעילות endonucleolytic לרצפי טרמינל 5 &#39;שכותרתו חוזרת ומראש crRNA בתעתיקי מבחנה. ההקדמה של dNTP בעמדה -9 מבטלת Cas6 מחשוף למצע רנ&quot;א קאש קצר (S, איור. 2C). 5 &#39;תג nt מסוף 8 גם מופק עבור התבגרות crRNA מ מראש crRNA מצעים ארוכים (L, איור. 2A). הלהקות הופרדו על 12% M ג&#39;ל denaturing 8 אוריאה polyacrylamide ומדמיינים ידי autoradiography.

<ol>
	<li>Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes.">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315, 1709-1712 (2007).</li><li>Makarova, K. S., Grishin, N. V., Shabalina, S. A., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+RNA-interference-based+immune+system+in+prokaryotes:+computational+analysis+of+the+predicted+enzymatic+machinery,+functional+analogies+with+eukaryotic+RNAi,+and+hypothetical+mechanisms+of+action.">A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action.</a> Biol. Direct. 1, 7 (2006).</li><li>Lillest&#248;l, R. K., Redder, P., Garrett, R. A., Brugger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+viral+defence+mechanism+in+archaeal+cells.">A putative viral defence mechanism in archaeal cells.</a> Archaea. 2, 59-72 (2006).</li><li>Makarova, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+classification+of+the+CRISPR-Cas+systems.">Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9, 467-477 (2011).</li><li>Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes.">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321, 960-964 (2008).</li><li>Carte, J., Pfister, N. T., Compton, M. M., Terns, R. M., Terns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+and+cleavage+of+CRISPR+RNA+by+Cas6.">Binding and cleavage of CRISPR RNA by Cas6.</a> RNA. 16, 2181-2188 (2010).</li><li>Haurwitz, R. E., Jinek, M., Wiedenheft, B., Zhou, K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-+and+structure-specific+RNA+processing+by+a+CRISPR+endonuclease.">Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease.</a> Science. 329, 1355-1358 (2010).</li><li>Gesner, E. M., Schellenberg, M. J., Garside, E. L., George, M. M., Macmillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+maturation+of+effector+RNAs+in+a+CRISPR+interference+pathway.">Recognition and maturation of effector RNAs in a CRISPR interference pathway.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 688-692 (2011).</li><li>Carte, J., Wang, R., Li, H., Terns, R. M., Terns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas6+is+an+endoribonuclease+that+generates+guide+RNAs+for+invader+defense+in+prokaryotes.">Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes.</a> Genes Dev. 22, 3489-3496 (2008).</li><li>Wiedenheft, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+RNA-guided+surveillance+complex+from+a+bacterial+immune+system.">Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system.</a> Nature. 477, 486-489 (2011).</li><li>Garneau, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468, 67-71 (2010).</li><li>Sinkunas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas3+is+a+single-stranded+DNA+nuclease+and+ATP-dependent+helicase+in+the+CRISPR/Cas+immune+system.">Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system.</a> EMBO J. 30, 1335-1342 (2011).</li><li>Jahn, M. J., Jahn, D., Kumar, A. M., S&#246;ll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mono+Q+chromatography+permits+recycling+of+DNA+template+and+purification+of+RNA+transcripts+after+T7+RNA+polymerase+reaction.">Mono Q chromatography permits recycling of DNA template and purification of RNA transcripts after T7 RNA polymerase reaction.</a> Nucleic Acids Res. 19, 2786-2787 (1991).</li><li>Sampson, J. R., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+physical+characterization+of+an+unmodified+yeast+phenylalanine+transfer+RNA+transcribed+in+vitro.">Biochemical and physical characterization of an unmodified yeast phenylalanine transfer RNA transcribed in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 1033-1037 (1988).</li><li>Dreher, T. W., Bujarski, J. J., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+viral+RNAs+synthesized+in+vitro+show+altered+aminoacylation+and+replicase+template+activities.">Mutant viral RNAs synthesized in vitro show altered aminoacylation and replicase template activities.</a> Nature. 311, 171-175 (1984).</li><li>McGinness, K. E., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitution+of+ribonucleotides+in+the+T7+RNA+polymerase+promoter+element.">Substitution of ribonucleotides in the T7 RNA polymerase promoter element.</a> J. Biol. Chem. 277, 2987-2991 (2002).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

השיטות שהוצגו לאפשר את הדור של מצעי CAS endonuclease של טווחי גודל שונים ומשתנים עם חופש בתכנון רצף. הגישה הכי ישר קדימה עבור הדור של מצעי oligonucleotide RNA סינטטיים מוגבלת לעיצובי RNA קצרים עקב הגדלת עלויות ומגבלות טכניות ביצירת oligomers RNA הארוכה יותר. בעוד סינתזת RNA מוצלחת כבר דווחה לoligomers RNA ללא שינוי של מעל אורך 100 נוקלאוטידים, המקסימום הפרקטי וחסכוני לסינתזת RNA מותאמת אישית נמצא מתחת 40 נוקלאוטידים. עם זאת, כל רצף נתון יכול להיות מסונתז והמבוא הממוקד של נוקלאוטידים שונים (למשל deoxyribonucleotides) יכול להיות מנוצל כדי לנתח אתרי ביקוע בפירוט. טרום cRNAs ארוך יותר צריך להיות שנוצר באמצעות שעתוק במבחנה. חישול של oligonucleotides המכיל מקדם RNA פולימראז T7 מאפשר לייצור אורך ביניים מראש crRNכ. האורך המרבי של oligonucleotides DNA המסונתז באופן שוטף ובחינה כלכלית הוא מעל 150 נוקלאוטידים ומייצג את המקסימום של-crRNAs מראש הסינטטי בשיטה זו. ההרכבה של כמה זוגות oligonucleotide DNA annealed שיוצרים קצוות דביקים אחד עם השני יכול להאריך אורך מקסימאלי זה מחייבת אבל אתגרים הולכים וגדלים בשיבוט של המבנה. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא היכולת להפיק מבנים מראש crRNA (ולכן קאש endonuclease מצעים) עם כל רצף רצוי. זה מאפשר בדיקה של עיצובי crRNA סינטטיים. לבסוף, מראש crRNAs הגדול יותר ניתן לקבל מamplificates PCR של אלמנטים שלמים הגנומי CRISPR או שבריהן. שינויים בתבנית לשעתוק מבחנת הפלסמיד יכולים להיות הציג דרך mutagenesis אתר המכוון לייצור גרסות טרום crRNA. מבנים אלה יכולים לשמש כדי לנתח את דפוס מחשוף endonucleolytic הגלובלי בתוך כלמראש crRNA. עבודתו החלוצית לייצור רנ&quot;א פולימרז לא עבר כל שינוי באמצעות T7 RNA במבחנת התעתיק התבססה על העברת RNAs 14 ו פסיפס וירוס RNA Brome 15. אמרגן RNA פולימראז T7 הקונצנזוס מורכב מתחום הכרה (-17 עד -5) ותחום ייזום (-4 עד +6) עם ייזום שעתוק בguanosine חיוני 1 16. מורד עמדות של 1 יכול להיות מגוון המאפשר לשעתוק של כמעט כל רצף RNA רצוי. השיטות שהוצגו להפקה בתבניות שעתוק ניגרו מבחנה לאפשר לסינתזה במבחנה של-crRNAs מראש מלא התואמים את אזורי CRISPR הגנומי או גרסות סינטטיות מראש crRNA. את התמלילים נוצרים בהווה אדנוזין 5&#39;-מסוף, אלא בתגובת השעתוק ערוכה עם GMP להשיג monophosphate 5 &#39;termini 14. termini כאלה נדרשים אם את התמלילים הם להיות מתויגעם קינאז polynucleotide T4 ו-γ [32 P]-ATP. פעילות מחשוף של Cas6 ואנזימים Cas6 דמויים מייצרת crRNA המכיל 5&#39;-הידרוקסיל ו2 &quot;טרמיני, 3&#39;-מחזורי פוספט. RNAs אלה לאחר מכן ניתן לנתח להכרה על ידי מורכב אשד.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> אנטארקטיקה phosphatase </td><td> חוד </td><td> M0289L </td><td></td></tr><tr><td> בTriphosphates מבחנת תמלול כיתת ultrapure נוקלאוטיד </td><td> ג&#39;נה Bioscience </td><td> NU-1010 - NU-1013 </td><td></td></tr><tr><td> כרומטוגרפיה נוזלית, 100 ktapurifier </td><td> GE Healthcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td> oligonucleotides דנ&quot;א </td><td> MWG אופרון </td><td></td><td></td></tr><tr><td> oligonucleotides RNA </td><td> MWG אופרון </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ערכת חילוץ ג&#39;ל </td><td> Qiagen </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> ערכת טיהור PCR </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> ספין Miniprep קיט </td><td> Qiagen </td><td> 27106 </td><td></td></tr><tr><td> קיט מקסי פלסמיד </td><td> Qiagen </td><td> 12163 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> חוד </td><td> R0136L </td><td></td></tr><tr><td> HindIII </td><td> חוד </td><td> R0104L </td><td></td></tr><tr><td> אנזים DNA T4 </td><td> חוד </td><td> M0202S </td><td></td></tr><tr><td> קינאז polynucleotide T4 </td><td> Ambion </td><td> AM2310 </td><td></td></tr><tr><td> פולימראז T7-RNA </td><td> הכנה של </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מיקס הפתרון Deoxynucleotide </td><td> חוד </td><td> N0447L </td><td></td></tr><tr><td> מערכת אלקטרופורזה טטרה מיני הפרוטאי </td><td> Bio-Rad </td><td> 165-8001 </td><td></td></tr><tr><td> 840 סורק הסערה </td><td&gt; GE Healthcare </td><td> 163723 </td><td></td></tr><tr><td> האחסון Phosphorscreen </td><td> דינמיקה מולקולרית </td><td> 63-0034-81 </td><td></td></tr><tr><td> ש מונה 5/50 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5166-01 </td><td></td></tr><tr><td> פולימראז ה-DNA Phusion הגבוה פידליטי </td><td> חוד </td><td> M0530L </td><td> להשתמש במאגר GC </td></tr><tr><td> Toluidine הכחול </td><td> סיגמא </td><td> T3260 </td><td></td></tr><tr><td> pUC19 </td><td> חוד </td><td> N3041S </td><td></td></tr><tr><td> γ-[32 P]-ATP, α-[32 P]-ATP </td><td> הרטמן אנליטית </td><td> SRP-401, SRP-307 </td><td></td></tr></tbody></table>

substrate generation for endonucleases of crispr/cas systems

האינטראקציה של וירוסים והמארחים פרוקריוטים עצבה האבולוציה של חי חיידקים וarchaeal. פרוקריוטים פתחו מספר אסטרטגיות להתחמק התקפות נגיפיות הכוללות שינוי הגבלה, זיהום כושל ומערכות CRISPR / קאש. מערכות אלו מסתגלות חיסוניות נמצאו בחיידקים רבים ומורכבות ביותר הקדומה של ג lustered r egularly אני nterspaced של hort עמ alindromic r EPEAT (CRISPR) רצפים ומספר C RISPR כגני sociated (CAS) (1 איור) 1-3. קבוצות שונות של חלבונים וחוזרים CAS להגדיר לפחות שלושה סוגים עיקריים של מסתעפים CRISPR / קאש מערכות 4. החלבונים האוניברסליים Cas1 וCas2 מוצעים להיות מעורבים בספיגה של ה-DNA הנגיפית היפיק אלמנט spacer חדש בין שני שידורים חוזרים בתחנה סופית 5 &#39;של אשכול CRISPR הארכת 5. כל האשכול משועתק למבשר-crRNA המכיל את כל spacer ורצפים חוזרים ולאחר מכן יעובד על ידי אנזים של Cas6 המשפחה המגוונת לcrRNAs הקטן 6-8. crRNAs אלה כולל רצף spacer המוקף &#39;מסוף (8 נוקלאוטידים) ו3&#39; 5 תג מסוף נגזר מהרצף החוזר 9. זיהום חוזר ונשנה של הנגיף כעת ניתן לחסום כיופנה crRNA החדש על ידי חלבונים מורכבים קאש (Cascade) ל-DNA הנגיפי ולזהות אותו ככזה באמצעות השלמת בסיס 10. לבסוף, עבור 1 מערכות CRISPR / קאש סוג, nuclease Cas3 יהרוס את הפולש זוהה DNA 11,12. תהליכים אלה מגדירים CRISPR / קאש כמערכת חיסונית אדפטיבית של פרוקריוטים ופתחו תחום מחקר מרתק למחקר של חלבוני CAS המעורבים.התפקוד של חלבונים רבים קאש הוא עדיין חמקמק ואת הסיבות לגיוון לכאורה של מערכות CRISPR / קאש להישאר להיות מוארות. פעילות פוטנציאלית של רוב חלבוני CAS נחזתה באמצעות אנליזות חישוביות מפורטות. חלק עיקרי של חלבוני CAS מוצג או הציע לתפקד כendonucleases 4. כאן, אנו מציגים שיטות להפקת crRNAs והמבשר-cRNAs ללימוד endoribonucleases קאש. מבחני endonuclease שונים דורשים רצפים חוזרים או קצרים שניתן ישירות מסונתז כoligonucleotides RNA או רצפי crRNA כבר ומראש crRNA המופקים באמצעות RNA פולימראז במבחנת T7 שעתוק ניגר. מתודולוגיה זו מאפשרת שילוב של נוקלאוטידים רדיואקטיביים לדור של מצעי endonuclease כותרתו פנימית ויצירת crRNAs הסינטטי או מוטציה. פעילות endonuclease Cas6 מנוצלת להתבגר-crRNAs מראש לcrRNAs עם 5&#39;-hydroxyl ו2 &#39;, termini פוספט 3&#39;-מחזורי.

Watch this Scientific Journal Video about Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems at JoVE.com

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

חסינות CRISPR / קאש מערכות לתווך אדפטיבית בחיידקי חיידקים קדומים. חלבוני CAS רבים הציעו לפעול כendoribonucleases פועל על מבשרי crRNA של משתנה אורך. כאן אנו מדגימים שלוש גישות שונות כדי להפיק את המצעים מראש crRNA לניתוח פעילות ביוכימית endonuclease קאש.

דור מצע לEndonucleases של מערכות CRISPR / קאש

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

substrate-generation-for-endonucleases-of-crisprcas-systems

Research

JoVE Journal

Biology

27.2K Views.  Max-Planck-Institute for Terrestrial Microbiology. חסינות CRISPR / קאש מערכות לתווך אדפטיבית בחיידקי חיידקים קדומים. חלבוני CAS רבים הציעו לפעול כendoribonucleases פועל על מבשרי crRNA של משתנה אורך. כאן אנו מדגימים שלוש גישות שונות כדי להפיק את המצעים מראש crRNA לניתוח פעילות ביוכימית endonuclease קאש.

Video: Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

שימוש Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) לפתח כלים לאבחון

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of cells (approximately 25 in C. borealis) which are well characterized. The cells in the STG exhibit a broad range of outputs and are responsible for the motor actions of the stomach. The stomach contains the gastric mill which breaks down food with three internal teeth, and the pylorus which filters the food before it reaches the midgut. The STG produces two rhythmic outputs to control the gastric mill and pylorus known as central pattern generators (CPGs). Each cell in the STG can participate in one or both of these rhythms. These CPGs allow for the study of neuromodulation, homeostasis, cellular and network variability, network development, and network recovery.
The dissection of the stomatogastric nervous system (STNS) from the Jonah crab (Cancer borealis) is done in two parts; the gross and fine dissection. In the gross dissection the entire stomach is dissected from the crab. During the fine dissection the STNS is extracted from the stomach using a dissection microscope and micro-dissection tools (see figure 1). The STNS includes the STG, the oesophageal ganglion (OG), and the commissural ganglia (CoG) as well as the nerves that innervate the stomach muscles. Here, we show how to perform a complete dissection of the STNS in preparation for an electrophysiology experiment where the cells in the STG would be recorded from intracellularly and the peripheral nerves would be used for extracellular recordings. The proper technique for finding the desired nerves is shown as well as our technique of desheathing the ganglion to reveal the somata and neuropil.

Cancer Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

The stomatogastric nervous system (STNS) of the Jonah crab (C. borealis) can be used for electrophysiology, immunohistochemistry, and cell culture studies. The STNS extraction is done in two parts: the gross and fine dissection.

סרטן Borealis מערכת העצבים Stomatogastric Dissection

The stomatogastric ganglion (STG) is an excellent model for studying cellular and network interactions because it contains a relatively small number of ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Dissection ברוטו של קיבה של לובסטר, Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

סינתזה כיול nanoprobes זרחני עבור הדמיה חמצן במערכות ביולוגיות

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

מבחני Biophysical לחקור את תכונות מכניות של גרעין התא שלבי הביניים: מסננים תשתית יישומים מניפולציה Microneedle

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

השימוש בChemostats בביולוגיה מיקרוביאלית מערכות

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

דור של Myospheres מhESCs על ידי תכנות מחדש אפיגנטיים

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...