بحث للوقاية من العمى، والمساعدة التجريبية من ناغازاكي تاكايوكي؛ هذا البحث يتفق مع بيان أرفو لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث البصرية. ويدعم KJW من المنح والمعاهد الوطنية للصحة 5T32EY013933 5T32DK007647 20-. ويدعم VBM من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح K08EY020530.

1. تجميع الأجهزة لحقن تحت الشبكية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شراء أو تقديم قطرها ميكرون 100 إبرة من أنبوب زجاجي الشعرية. ويمكن أن يتم ذلك يدويا باستخدام سوتر P-97 مجتذب الماصة أو معدات أخرى مماثلة. سيكون ساخنا نهاية الأنبوب الشعري وسحبت حتى تصل إلى القطر المطلوب (100 ميكرون). ويمكن استخدام إبرة أصغر قطر لناقلات العلاج الجيني، ولكن هذا هو قطر الموصى به لحقن الخلايا دون الأضرار التي لحقت الخلايا أو العين. مقارنة الإبر الصلب، الزجاج الإبرة الشعرية لديه معلومات دقيقة جدا، ولكن بصراحة، للسماح لرؤية حقن السائل والوصول إلى الفضاء تحت الشبكية دون أن تسبب الكسر في شبكية العين. تنظيف هذه الإبر سحبت إذا لزم الأمر باستخدام الايثانول 70٪، وتخزينها في وعاء معقم. A 15 سم زراعة الأنسجة المعقمة الطبق مع الشريط لعقد الإبر في مكان واحد الطريقة التي للحفاظ على حقن الإبر وغطت في بيئة معقمة. عند هذه النقطة، كومبلمؤسسة التدريب الأوروبية في انشاء داخل غرفة العمليات الجراحية حيث الإجراء سوف تحدث. فمن الأسهل للحفاظ على جميع المعدات في غرفة العمليات الجراحية في جميع الأوقات من أجل أن تبقى عقيمة، لا سيما إذا كان ذلك الإجراء داخل مرفق الجدار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح السيليكون في إبرة حقن السيليكون وإخراج لترك الطلاء على طول الجدران الداخلية للإبرة. طلاء السيليكون يزيد من مرور الخلايا والفيروسات من خلال إبرة تحمل، والتي ستلتزم على نحو آخر مع الجدران الزجاجية الداخلية الشعرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على ما يقرب من 8 سم طول أنابيب بلاستيكية معقمة من خلال خفض بنسبة 25 جمع الدم ¾ عيار مع مجموعة قفل الأنبوب عند نقطة مباشرة بعد الإبرة (إزالة الإبرة من أنابيب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 مل ملء الفرعية س 26 5/8-gauge زلة تلميح المحاقن مع ملحي معقم وإزالة الإبرة من الحقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبرة حقن إرفاق إلى نهاية قطع من انابيب البلاستيك ونعلق المحقنة إلى الأنبوب قفل في الطرف الآخرنهاية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح ملحي معقم لملء الفراغ القتلى في الإبرة والأنابيب الشعرية، إخراج بعض المالحة من خلال إبرة لضمان أن يتم إرفاق بشكل صحيح من دون أي تسرب. المقبل، نضح صغير، حوالي 1 ميكرولتر من كمية الهواء، في رأس الإبرة الحقن. وهذا فصل من السوائل المالحة وتوفير الحقن مؤشرا مرئيا تشير إلى نهاية السائل الحقن أثناء إجراء العمليات الجراحية. يجب أن تبقى جهاز الحقن على سطح نظيف محو أسفل مع الايثانول 70٪ خلال إجراء العمليات الجراحية. بالإضافة إلى ذلك، يجب تنظيف جميع المعدات المستخدمة أثناء إجراء العمليات الجراحية قبل وبعد مع الايثانول 70٪، للاستثناء من الإبر الحقن التي يجب أن تبقى عقيمة بالفعل وجاهزة للاستخدام. يجب التخلص من هذه الإبر من بعد الجراحة، وليس إعادة استخدامها </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأخيرا، نضح حل الحقن التي تحتوي على المطلوب العلاج الجيني الفيروسي ناقلات المعلبة أو الخلايا الجذعية. ويمكن أن يتم ذلك عن طريقتناول الحقن في حل تلميح الماصة المعقمة، ثم pipetting الحل على سطح الخلية طبق الثقافة العقيمة. ويمكن الآن أن يستنشق الحل بسهولة في إبرة الحقن باستخدام محقنة. فإن المبلغ اللازم تختلف تبعا للعمر من الفأرة. لأغراضنا نحن نستخدم ما بعد الولادة 5 أيام الفئران، والتي يمكن حقنها مع 0،5-0،8 ميكرولتر من السائل الحقن. يمكن استخدام كميات صغيرة، 0.5 ميكرولتر أو أقل، ويمكن استخدامها لصغار الفئران ومبالغ أكبر، مثل 1 ميكرولتر، لفئران بالغة. وعيار الفيروسية أو عدد الخلايا بحاجة إلى أن تحدد على أساس خلية / فيروس يتم حقنه وأنسجتهم الهدف المنشود، كما يمكن أن الجسيمات الفيروسية أو الخلايا كثيرة جدا في حجم صغير يؤدي إلى سمية للخلايا الشبكية. في الفيديو، لأغراض التصور، وقد استخدمنا 1،5 ميكرولتر، أكبر كمية من الصبغة مما هو ضروري لحقن في العين. </li></ol> 2. الوصول إلى الفضاء تحت الشبكية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> داخل غرفة العمليات الجراحية المعقمة،استقرار أو تخدير الماوس وفقا لبروتوكول التعامل مع الحيوان وافق محليا، والتي سوف تختلف حسب العمر من الفأرة. التخدير مشتركة لفئران بالغة تتضمن استخدام الغاز أو الحقن isoflurane داخل الصفاق من 0.1 ml/10g وزن الجسم من الكيتامين (100 ملغ / مل) وزيلازين (20 ملغ / مل) في ملحي معقم. لفترة ما حول الولادة الفئران، وتقنيات التخدير شيوعا تشمل استخدام الغاز isoflurane أو تخدير بالبرد (انخفاض حرارة الجسم). يجب الموافقة على جميع تقنيات التخدير من قبل لجنتكم IACUC المحلية قبل الاستخدام. نستخدم عادة بعد الولادة اليوم (P) 5 الفئران، على الرغم من إمكانية تطبيق تقنيات مماثلة لالفئران في سن P0 أو لفئران بالغة. يمكن إجراء العمليات الجراحية لم يبدأ حتى الماوس توقف تحريك أطرافه ولم يعد يستجيب إلى أخمص القدمين القرصات. لفترة ما حول الولادة الفئران، فإنها تصبح أخف وزنا بشكل ملحوظ في اللون منذ تدفق الدم سوف تبطئ، مفتاح آخر لمعرفة أنهم تحت التخدير الكامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في فترة ما حول الولادة الفئران، استخدم مقص Vannas مباشرة إلى مأك تقريبي شق 1.5 مم على طول الشق غطاء مغلقة. كن حذرا لخفض المسافة البادئة في، حيث سيتم فتح العين بشكل طبيعي في المستقبل. هذا يضمن أن الأغطية سوف تلتئم بشكل صحيح وفتح أثناء وضع الماوس. ويمكن استخدام شفرة جراحية لهذا الغرض، على الرغم من أننا نفضل مقص Vannas لأنها تقلل من خطر ثقب العين خلال هذا الإجراء. في الفيديو، استخدمت مقص لقطع ثقب مباشرة وعلى طول هامش الجفن. عندما تعلم هذه التقنية، يجب استخدام ملقط لرفع الجفن قبل القطع والحد من مخاطر الإضرار بالعين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزق الجفون مع ملقط خلع الملابس منحنية لproptose العين والجفون قرصة قليلا تحت العين لأنه عقد proptosed للحقن. إذا شق غطاء المحرز في الخطوة الثانية هي كبيرة جدا، وسوف تنزلق العين تحت الجفن ومنع التعرض الكافي أثناء إجراء الحقن. لفئران بالغة، وتطبيق ضغط خفيف حول العين مع الدكتوريمكن essing ملقط الاستمرار على العين proptosed للحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق صغير في الصلبة أو الخلفي لخط الاستواء في العالم من خلال خدش سطح بشفرة المجهرية 15-درجة. وهذا ينبغي أن تكون كبيرة شق ما يكفي فقط لتمرير غيض من إبرة الحقن، ولكن لم أكبر من ذلك. إذا فضلت، يمكن استخدام صغيرة، إبرة حادة مثل الإبر الوخز بالإبر لجعل هذا شق في الفضاء تحت الشبكية بدلا من شفرة المجهرية. في الحيوانات المصطبغة نحو مظلم، مظلم والبني المصطبغة الأنسجة (الشبكية والمشيمية ظهارة الصباغ) تصبح مرئية عند نقطة شق. في أخف الفئران مصطبغة أو البيضاء، يمكن تطبيق قلم الجراحية بمناسبة لغيض من شفرة المجهرية لترك بقعة الحبر تشير إلى موقع شق. إذا اضحة refluxes السائل (زجاجي) من موقع شق، وضعت شفرة عميق جدا ودخل تجويف الجسم الزجاجي وفيروس العلاجية أو الخلايا قد تدخل الفضاء intravitreal خلال الحقن. لvisualizatiعلى الأغراض، وجعلنا من شق إلى هذه النقطة في الفيديو. لا يزال من الممكن لإكمال الحقن تحت الشبكية في هذه الحالة، ومع ذلك يجوز للانفصال الشبكية الناجم عن وجود حقن السائل لا شفاء تماما في هذا الماوس. ولذلك، يجب الحرص على قطع فقط السطح الخارجي للعين وليس من خلال شبكية العين قبل الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج بعناية الإبرة الحقن في موقع شق ودفعها موازية لجدار العين الخارجي لدخول الفضاء تحت الشبكية. وسوف تقدم قريبة جدا من الجدار الخارجي أو عميق جدا داخل العين توجيه الحقن في موقع خاطئ. أفضل طريقة لفهم ما إذا كانت الإبرة في الموقع الصحيح لممارسة هذه التقنية. يمكن ممارسة على الفئران البيضاء أو فاتح اللون تساعد على جعل حقن دقيقة ودقيقة في الفضاء تحت الشبكية. وذلك لأن السائل إبرة الحقن ومرئيا داخل هذه العيون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الضغط الخفيف على المكبس حقنة ويكونحقن الجن من السائل المطلوب. إذا ما وضعت بشكل صحيح الإبرة داخل الفضاء تحت الشبكية، سيتم شعرت احداهما معتدلة. إذا كانت الإبرة داخل الجسم الزجاجي، وسيكون هناك أقل بكثير احداهما وربما بعض الجزر السوائل أثناء الحقن. إذا كان هناك احداهما كبيرة، أمسك إبرة في المكان لمدة لا تقل عن 15 ثانية إضافية قبل إزالة الإبرة ببطء. وهذا سوف يسمح ارتفاع الضغط داخل العين لادراك التعادل بدلا من refluxing الفيروس حقن الخلايا أو العودة إلى موقع شق. ويمكن حقن بعض الهواء والمياه المالحة في الفضاء تحت الشبكية بسبب زيادة الضغط المطلوب أثناء إجراء الحقن. وينبغي الحرص على عدم الإفراط في ضخ الهواء أو المالحة، لأنها يمكن أن طرد الفيروس حقن الخلايا أو من العين. ومن الممكن أيضا أن يسبب انفصال الشبكية دائمة من وجود الكثير من السوائل تحقن في الفضاء تحت الشبكية. لأغراض التصور، تم حقن الصبغة الزائدة وكثافة العمليات الجويةيا الفضاء تحت الشبكية في الفيديو. يمكن ان ينظر اليها بشكل واضح كيف سيتم مسح بعض الصبغة مرة أخرى للخروج من الفضاء تحت الشبكية إذا تم حقن الكثير، ولكن أيضا كيف أن تبقى فقاعة الهواء داخل الفضاء تحت الشبكية و لا تختفي في الجسم الزجاجي. وقد استخدم هذا التأكيد على أن هذه الحقن كانوا جميعا داخل الموقع الصحيح للعين، لذلك يمكن للمرء أن يتخيل كيف أن تدخل الإبرة في موقع شق. جميع الحقن في الفضاء تحت الشبكية يؤدي إلى انفصال الشبكية مؤقتة بسبب وجود السائل الحقن. إذا تم الانتهاء من إجراء الحقن بشكل صحيح، وهذا انفصال الشبكية مؤقتة شفاء في غضون 24 ساعة والفئران يمكن استخدامها لجميع التجارب الأخرى. العين قد تبقى لينة لمدة أسبوع تقريبا بسبب العملية الجراحية، ولذلك يجب تجنب حقن الثانية خلال هذه الفترة من الزمن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنسبة للفئران حديثي الولادة، ملقط خلع الملابس استخدام المنحني برفق لدفع العين مرة أخرى وراء الأغطية وإلى المدار. قد يكون من المفيدالانتظار لمدة دقيقة وذلك للسماح للفيروس لتسوية في غضون تحت الشبكية وليس التسبب في مسح بها للموقع عند الضغط بلطف شق العين مرة أخرى إلى مداره. بعد الجراحة، قطرة واحدة من بوبيفاكايين 0.5٪ (marcaine) المخفف إلى 0.25٪ في ملحي معقم من إبرة قياس 25-يمكن وضعها في موقع الحقن. الفئران لا تظهر علامات الشدة العلني بعد الجراحة تحت الشبكية واستخدام بوبيفاكايين كمسكن طويل المفعول الموضعية كانت وافرة للسنوات الثلاث السابقة. وينبغي دائما أن تراقب الفئران بعد العملية الجراحية للبحث عن أي علامات الضائقة؛ مثل العدوى، وتورم، أو انخفاض في الأنشطة اليومية المعتادة من الفأرة. إذا حدث وحصل، ينبغي إخطار الطبيب البيطري ويمكن إعطاء عقاقير مضادة للألم مثل البوبرينورفين مزيد (0.05 مغ / كغ) كما حقنة داخل الصفاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنبيه الفار من التخدير المعتمدة محليا وفقا لبروتوكول التعامل مع الحيوان. يجب أن تبقى الماوس على ع التدفئةإعلان للحفاظ على درجة حرارة الجسم طبيعية لأنه يستيقظ من التخدير. يجب إجراء العمليات الجراحية تستغرق أقل من خمس دقائق لإكمال، من دون وقت للخضوع الماوس التخدير. لذلك، وسادة التدفئة ليس من الضروري أثناء إجراء الفعلية، ولكن قد تكون هناك حاجة في حين واحد هو تعلم تقنية والإجراء قد يستغرق مدة أطول من الزمن. لا ينبغي أن توضع الماوس مرة أخرى إلى قفص نظيفة حتى بدأت التحرك من تلقاء نفسها. لحديثي الولادة، والقرصات إصبع لطيف لمساعدة تستعد عافيتها بشكل كامل من التخدير، ويجب أن تستعيد لونها الوردي وحركة قبل وضعها مرة أخرى مع الأم. وينبغي رصد الفئران بمرور الوقت عن أي علامات الضائقة كما هو موضح سابقا. </li></ol>

<ol>
	<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+retina+using+pigment+epithelial+cell+transplantation.">Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation.</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).</li><li>Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+Leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations:+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years.">Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).</li><li>Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li><li>Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa.">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89, 911-919 (2010).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li><li>Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+expression+of+cDNA+and+shRNA+slows+degeneration+in+retinitis+pigmentosa.">Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa.</a> Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).</li><li>Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+adult+mouse+iPS+cell-derived+photoreceptor+precursors+restores+retinal+structure+and+function+in+degenerative+mice.">Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice.</a> PLoS One. 6, e189992 (2011).</li><li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , (2010).</li><li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse.">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li><li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fundus+photography+and+angiography:+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes.">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22 (1999).</li><li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+resources+for+vision+research.">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هذه التقنية الفيديو يقدم تعليمات على استكمال إجراءات الحقن تحت الشبكية الجراحية بنجاح، وضمان أن يتم وضع ناقلات العلاج الجيني أو الخلايا الجذعية في الموقع اللازمة لعلاج هذا المرض بكفاءة العيون. هذا الأسلوب يسمح للاستهداف خلايا الشبكية مثل RPE أو خلايا مستقبلة للضوء، ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم </td><td> شركة </td><td> فهرس </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> 0،8-1،10 X 100 ملم أنابيب شعرية (زجاج) </td><td> كيمبل الزجاج، وشركة </td><td> 34502 99 </td><td></td></tr><tr><td> المشتعلة / براون Micropipette بولير </td><td> سوتر الصك </td><td> P-97 </td><td> ويمكن استخدام Narishige microforge بدلا من ذلك. كتالوج # MF-900 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> سيغما الدريتش </td><td> SL2-25ML </td><td> سيليكون </td></tr><tr><td> التخزين المؤقت للفوسفات Dubecco المالحة مع كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم </td><td> Gibco-إينفيتروجن </td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td> بالسلامة لوك 25 × 12 3/4G &quot;، وجمع الدم مجموعة </td><td> BD Vacutainer </td><td> 367298 </td><td></td></tr><tr><td> 1 مل الفرعي Q 265/8G الانزلاق تلميح الحقنة </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 309597 </td><td></td></tr><tr><td> 0،5-10 ميكرولتر Finnpipette II قابل للتعديل الحجم Pipetter </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-815 </td><td></td></tr><tr><td> 1-200 ميكرولتر نصائح مشطوف الطبيعية </td><td> USA العلمية، وشركة </td><td> 1111-1700 </td><td></td></tr><tr><td> Discovery.V8 ستيريو المجهر </td><td> زايس </td><td> MC1500 </td><td></td></tr><tr><td> 60 مم X 15 مم شكل المعالجة زراعة الخلايا طبق البوليستيرين </td><td> كورنينج للإعلام </td><td> 430166 </td><td></td></tr><tr><td> مقص مستقيم Vannas </td><td> STORZ Ophthalmics </td><td> E3383 S </td><td></td></tr><tr><td> منحني الملقط خلع الملابس مع التسنين حساس </td><td> STORZ Ophthalmics </td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> 15 درجة سكين المجهرية </td><td> Wilsعلى شركة العيون </td><td> 091204 </td><td></td></tr><tr><td> الكيتامين </td><td> Ketaset III </td><td> NADA # 45-290 </td><td></td></tr><tr><td> زيلازين </td><td> لويد المختبرات </td><td> NADA # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> بوبيفاكايين (Marcaine) </td><td> استرا زينيكا </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> البوبرينورفين </td><td> سيغما الدريتش </td><td> B9275 </td><td></td></tr></tbody></table>

subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye

فقدان البصر يؤثر على ما يقرب من 3.4 مليون شخص في الولايات المتحدة، ومن المتوقع أن تزداد في السنوات القادمة .. 1 في الآونة الأخيرة، والعلاج الجيني زرع الخلايا الجذعية أصبحت أدوات العلاجية لعلاج العمى الرئيسية الناجمة عن الأمراض التنكسية الشبكية. وقد ولدت عدة أشكال من الزرع الذاتي للتنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD)، مثل زرع القزحية الصباغ الخلايا الظهارية، نتائج مشجعة، وتجارب اكلينيكية على البشر بدأت لأشكال أخرى من العلاج بالخلايا الجذعية والجينات .. 2 وتشمل هذه RPE65 استبدال الجينات العلاج في المرضى المصابين بعمى جزئي خلقي وزرع الخلايا RPE باستخدام الجذعية الجنينية البشرية (ES) الخلايا في أمراض ستارغاردت 3-4 الآن أن هناك ناقلات العلاج الجيني والخلايا الجذعية المتاحة لعلاج المرضى الذين يعانون من أمراض شبكية العين، فمن المهم للتحقق من هذه العلاجات المحتملة في تطبيق النماذج الحيوانية قبلجي لهم في الدراسات البشرية. الماوس أصبح نموذجا هاما العلمية لاختبار الكفاءة العلاجية للناقلات العلاج الجيني وزرع الخلايا الجذعية في العين 5-8 في هذه المقالة الفيديو، نقدم تقنية لحقن ناقلات العلاج الجيني أو الخلايا الجذعية في الفضاء تحت الشبكية من العين الماوس مع تقليل الأضرار التي لحقت الأنسجة المحيطة بها.

ويرد الرسم من العين الفأر مع الهياكل الرئيسية مرقوم للإشارة، مع السهام عرض المواقع لإجراءات حقن كل intravitreal وتحت الشبكية الجراحية (النصال، الشكل 1). ويمكن حقن العلاج الجيني النواقل، مثل ناقلات lentiviral lacZ (الشكل 2)، وذلك باستخدام هذه المواقع. بالإضا?...

Watch this Scientific Journal Video about Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye at JoVE.com

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

هذه التقنية الجراحية يوضح حقن ناقلات العلاج الجيني والخلايا الجذعية في الفضاء تحت الشبكية للعين الماوس.

تحت الشبكية حقن المتجهات العلاج الجيني والخلايا الجذعية في العين ماوس

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

subretinal-injection-gene-therapy-vectors-stem-cells-perinatal-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

32.9K Views.  Columbia University. هذه التقنية الجراحية يوضح حقن ناقلات العلاج الجيني والخلايا الجذعية في الفضاء تحت الشبكية للعين الماوس.

Video: Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a number of gene therapy clinical trials. More recently, a number of additional AAV serotypes have also been isolated, which have been shown to exhibit selective tissue-tropism in various small and large animal models1. Of the 10 most commonly used AAV serotypes, AAV3 is by far the least efficient in transducing cells and tissues in vitro as well as in vivo.
However, in our recently published studies, we have documented that AAV3 vectors transduce human liver cancer - hepatoblastoma (HB) and hepatocellular carcinoma (HCC) - cell lines extremely efficiently because AAV3 utilizes human hepatocyte growth factor receptor as a cellular co-receptor for binding and entry in these cells2,3.
In this article, we describe the steps required to achieve high-efficiency transduction of human liver cancer cells by recombinant AAV3 vectors carrying a reporter gene. The use of recombinant AAV3 vectors carrying a therapeutic gene may eventually lead to the potential gene therapy of liver cancers in humans.

In this article, we describe the identification of the adeno-associated virus serotype 3 (AAV3) as the most efficient vector for targeting human liver cancer cells.

عالية الكفاءة تنبيغ الخلايا السرطانية الكبد المصلي المؤتلف الفيروسات الغدة المرتبطين 3 ناقلات

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

إنشاء والدعوة للأورام الشبكية الإنسان في الفئران أن نقص المناعة

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive molecules contain an oxygen and include H2O2 (hydrogen peroxide), NO (nitric oxide), O2- (oxide anion), peroxynitrite (ONOO-), hydrochlorous acid (HOCl), and hydroxyl radical (OH-).
Oxidative species are produced not only under pathological situations (cancers, ischemic/reperfusion, neurologic and cardiovascular pathologies, infectious diseases, inflammatory diseases 1, autoimmune diseases 2, etc&hellip;) but also during physiological (non-pathological) situations such as cellular metabolism 3, 4. Indeed, ROS play important roles in many cellular signaling pathways (proliferation, cell activation 5, 6, migration 7 etc..). ROS can be detrimental (it is then referred to as "oxidative and nitrosative stress") when produced in high amounts in the intracellular compartments and cells generally respond to ROS by upregulating antioxidants such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione (GSH) that protects them by converting dangerous free radicals to harmless molecules (i.e. water). Vitamins C and E have also been described as ROS scavengers (antioxidants).
Free radicals are beneficial in low amounts 3. Macrophage and neutrophils-mediated immune responses involve the production and release of NO, which inhibits viruses, pathogens and tumor proliferation 8. NO also reacts with other ROS and thus, also has a role as a detoxifier (ROS scavenger). Finally NO acts on vessels to regulate blood flow which is important for the adaptation of muscle to prolonged exercise 9, 10. Several publications have also demonstrated that ROS are involved in insulin sensitivity 11, 12.
Numerous methods to evaluate ROS production are available. In this article we propose several simple, fast, and affordable assays; these assays have been validated by many publications and are routinely used to detect ROS or its effects in mammalian cells. While some of these assays detect multiple ROS, others detect only a single ROS.

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Here we propose simple methods to test and evaluate the presence of reactive oxygen species in cells.

الإنتاج والكشف عن أنواع الاكسجين التفاعلية (ريوس) في السرطان

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

وسيلة جديدة لإدارة الجراحية داخل الرغامى وكلاء الحيويه في نموذج الفأر الجنينية

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

شبكية العين مفرزة النموذجي في القوارض بواسطة حقن تحت الشبكية من هيالورونات الصوديوم

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability in industrialized countries. Replacement of degenerated photoreceptors by cell transplantation represents a possible treatment option in future clinical applications. Indeed, recent preclinical studies demonstrated that immature photoreceptors, isolated from the neonatal mouse retina at postnatal day 4, have the potential to integrate into the adult mouse retina following subretinal transplantation. Donor cells generated a mature photoreceptor morphology including inner and outer segments, a round cell body located at the outer nuclear layer, and synaptic terminals in close proximity to endogenous bipolar cells. Indeed, recent reports demonstrated that donor photoreceptors functionally integrate into the neural circuitry of host mice. For a future clinical application of such cell replacement approach, purified suspensions of the cells of choice have to be generated and placed at the correct position for proper integration into the eye. For the enrichment of photoreceptor precursors, sorting should be based on specific cell surface antigens to avoid genetic reporter modification of donor cells. Here we show magnetic-associated cell sorting (MACS) - enrichment of transplantable rod photoreceptor precursors isolated from the neonatal retina of photoreceptor-specific reporter mice based on the cell surface marker CD73. Incubation with anti-CD73 antibodies followed by micro-bead conjugated secondary antibodies allowed the enrichment of rod photoreceptor precursors by MACS to approximately 90%. In comparison to flow cytometry, MACS has the advantage that it can be easier applied to GMP standards and that high amounts of cells can be sorted in relative short time periods. Injection of enriched cell suspensions into the subretinal space of adult wild-type mice resulted in a 3-fold higher integration rate compared to unsorted cell suspensions.

Cell transplantation represents a strategy for the treatment of retinal degeneration characterized by photoreceptor loss. Here we describe a method for enrichment of transplantable photoreceptors and their subretinal grafting into adult mice.

زرع تحت الشبكية من MACS تنقية الخلايا السلائف مستقبلات ضوئية في شبكية العين الماوس الكبار

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

أداء تحت الشبكية الحقن في القوارض لتسليم خلايا الظهارة الصبغية الشبكية في تعليق

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

دراسة سرطان البنكرياس الجذعية خصائص الخلايا لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson&#039;s Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

تطوير وبناء الجرذ نموذج ألفا synuclein لمرض باركنسون عن طريق حقن المجسم من النواقل الفيروسية المؤتلف المرتبطة الغدة

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

خطوة بالبروتوكول الخطوة لجراحة تحت الشبكية في الأرانب

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...