מחקר כדי למנוע עיוורון; סיוע ניסויי מטקיוקי נגסאקי; מחקר זה תואם את הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר חזותי. KJW נתמך על ידי מענקי NIH 5T32EY013933 ו5T32DK007647-20. VBM נתמך על ידי מענק NIH K08EY020530.

1. להרכיב מכשירים להזרקת subretinal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש או לבצע מחט קוטר 100 מיקרומטר מצינור נימי זכוכית. ניתן לעשות זאת באופן ידני באמצעות חולץ סאטר P-97 pipet או ציוד דומה אחר. קצה צינורית הנימים יהיה מחומם ומשך עד שהוא מגיע לקוטר הרצוי (100 מיקרומטר). מחט קוטר קטנה יותר יכולה לשמש לוקטורים בריפוי גנטי, אך זה הוא הקוטר המומלץ להזרקת תאים ללא פגיעה בתאים או בעיניים. בהשוואה למחטי פלדה, מחט נימי הזכוכית יש קצה דק מאוד, אבל בוטה, כדי לאפשר הדמיה של נוזל ההזרקה וגישה למרחב subretinal מבלי לגרום לשבירה של רשתית. נקה המחטים נשלפו האלה במידת הצורך באמצעות אתנול 70%, ולאחסן במכל סטרילי. צלחת 15 סנטימטר סטרילי רקמת תרבות עם קלטת להחזיק את המחטים במקום היא דרך אחת שבי לשמור את מחטי הזרקה ומכוסות בסביבת סטרילית. בשלב זה, Complete ההגדרה בתוך חדר הניתוח שבו ההליך יתקיים. זה קל ביותר לשמור על כל הציוד בחדר הניתוח בכל העת על מנת שזה יישאר סטרילי, במיוחד אם הליך זה נעשה בתוך מתקן מכשול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב סיליקון לתוך המזרק ולהוציא סיליקון לעזוב ציפוי לאורך הקירות הפנימיים של המחט. ציפוי סיליקון מגדיל את המעבר של תאים ווירוסים דרך קדח המחט, שאחרת להיצמד לקירות נימי הזכוכית הפנימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג כ 8 סנטימטר אורך צינור פלסטיק סטרילית על ידי חיתוך 25 איסוף דם ¾ מד להגדיר עם נעילת luer בנקודה ישירות לאחר המחט (מוציא את המחט מהצינור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא 1 26 מיליליטר מזרק תת ש 5/8-gauge להחליק עצה עם תמיסת מלח סטרילית ולהוציא את המחט מהמזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מחט הזריקה לסוף הקיצוץ של צינורות הפלסטיק ולצרף את המזרק לluer הנעילה בקצה השניהסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב סליין סטרילית, כדי למלא את השטח המת במחט הצינורות ונימים, ולהוציא קצת מלחים דרך המחט על מנת להבטיח שהוא מחובר כראוי ללא כל דליפה. בשלב הבא, לשאוב קטן כ 1 סכום, μl של אוויר, בקצה מחט הזריקה. זה יהיה להפריד מליח מנוזל ההזרקה ולספק רמז חזותי יציין את סוף נוזל ההזרקה בהליך כירורגי. מנגנון ההזרקה יש לשמור על משטח נקי ונגב אותה עם 70% אתנול בהליך כירורגי. בנוסף, כל הציוד המשמש במהלך ההליך כירורגי יש לנקות לפני ואחרי עם אתנול 70%, לחריג של מחטי הזרקה שכבר יש להקפיד לקיים סטרילית ומוכן לשימוש. מחטים אלו צריכות להיות מסולקות לאחר ניתוח, ולא שימוש חוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, לשאוב פתרון זריקה המכיל את הווקטור הרצוי הארוז הריפוי הגנטי הנגיפי או תאי גזע. ניתן לעשות זאת על ידילוקח את הזריקה לפתרון קצה pipet סטרילי, אז pipetting הפתרון על פני השטח של צלחת תרבות תא סטרילי. הפתרון עכשיו עלול להישאף בקלות לתוך מחט הזריקה באמצעות המזרק. הסכום הדרוש משתנה בהתאם לגילו של העכבר. למטרות שלנו אנו משתמשים 5 עכברי יום שלאחר לידה, שיהיה ניתן להזריק עם 0.5-0.8 μl של נוזל הזרקה. כמויות קטנות יותר, 0.5 μl או פחות, ניתן להשתמש בם לעכברים צעירים וסכומים גדולים יותר, כמו μl 1, יכולות לשמש לעכברים בוגרים. כייל הנגיף או מספר תאים צריך להיות נקבע על בסיס הווירוס / תאים שהוזרקו ורקמות היעד הרצוי שלהם, כמו גם רבים חלקיקים נגיפיים או תאים בנפח קטן יכולים להוביל לרעילות לתאי הרשתית. בסרטון, למטרות המחשה, יש לנו להשתמש 1.5 μl, כמות גדולה יותר של צבע מהצורך להזריק לתוך העין. </li></ol> 2. גישת חלל subretinal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך חדר ניתוח סטרילי,לייצב או להרדים את העכבר על פי הפרוטוקול שאושר באופן מקומי חית הטיפול, המשתנה בהתאם לגילו של העכבר. הרדמה משותפת לעכברים בוגרים כוללת שימוש בגז isoflurane או הזרקה תוך הצפק ממשקל גוף של 0.1 ml/10g קטמין (100 מ&quot;ג / מ&quot;ל) וxylazine (20 מ&quot;ג / מ&quot;ל) בסליין סטרילי. לעכברים סביב לידה, טכניקות הרדמה נפוצות כוללות שימוש בגז isoflurane או cryoanesthesia (היפותרמיה). כל טכניקות ההרדמה חייבות להיות מאושרות על ידי הוועדה המקומית IACUC לפני השימוש. אנו משתמשים בדרך כלל ביום שלאחר הלידה (P) 5 עכברים, למרות שניתן ליישם טכניקות דומות לעכברים צעירים כמו P0 או לעכברים בוגרים. ההליך כירורגי לא יכול להתחיל עד שהעכבר הפסיק להזיז את הגפיים וכבר לא מגיב לכף רגל וצביטות. לעכברים סביב לידה, הם יהפכו לקלים יותר במידה ניכרת מאז צבע זרימת הדם תהיה להאט, מפתח נוסף לידיעה כי הם תחת הרדמה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעכברים סביב לידה, השתמש Vannas מספריים ישרים למ &#39;AKE חתך משוער 1.5 מ&quot;מ לאורך סדק המכסה הסגור. היזהר לחתוך בכניסה, שבו העין באופן טבעי לפתוח בעתיד. הדבר מבטיח שהעפעפיים יהיו לרפא ולפתוח כראוי במהלך ההתפתחות של העכבר. להב כירורגים יכול לשמש למטרה זו, למרות שאנחנו מעדיפים מספרי Vannas שכן הם מפחיתים את הסיכון לניקוב העין במהלך הליך זה. בסרטון, את המספריים שמשו ישירות לנקב וחתך לאורך שולי העפעף. כאשר לומדים את הטכניקה הזו, יש להשתמש במלקחיים כדי להרים את העפעף לפני החיתוך ולהפחית את הסיכון לפגיעה בעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את העפעפיים עם מלקחי הלבשה מעוקלים לproptose את העין וצובט את העפעפיים מעט מתחת לעין כדי להחזיק אותו proptosed להזרקה. אם חתך המכסה בצע בשלב 2 הוא גדול מדי, העיניים תגלושנה שוב אל מתחת לעפעפיים ולמנוע חשיפה נאותה במהלך הליך ההזרקה. לעכברים בוגרים, תוך הפעלת לחץ קל מסביב לעין עם ד&quot;רessing מלקחיים יכול להחזיק את עיני proptosed להזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן או בscleral אחורי לקו המשווה של כדור הארץ על ידי מגרד את פני השטח עם להב microsurgery 15-מעלות. חתך זה צריך להיות גדול מספיק כדי לעבור רק את קצה מחט הזריקה, אבל לא יותר מזה. אם העדיף, מחט קטנה, חד כגון מחט דיקור יכולה לשמש כדי להפוך את החתך הזה לתוך חלל subretinal במקום להב microsurgery. בבעלי חי פיגמנט כהה, חום כהה רקמה-פיגמנט (אפיתל הפיגמנט ברשתית דמה-) תהפוך לגלויה בנקודת החיתוך. בעכברי פיגמנט או לבקן מצית, עט סימון כירורגית יכול להיות מיושם על קצה להב microsurgery להשאיר כתם דיו מציין אתר החתך. אם (זגוגית) refluxes נוזל השקוף מתוך אתר החתך, הלהב הוצב עמוק מדי ונכנס לחלל הזגוגית ווירוס או תאים הטיפוליים יכול להיכנס למקום הזגוגית במהלך זריקה. לvisualizatiעל מטרות, עשו חתך לנקודה זו בוידאו. זה עדיין אפשרי כדי להשלים זריקת subretinal במקרה זה, לעומת זאת היפרדות הרשתית נגרמת על ידי הנוכחות של נוזל הזריקה עלולה לא להחלים באופן מלא בעכבר הזה. לכן, יש להקפיד לחתוך רק את פני השטח החיצוניים של העין ולא דרך הרשתית לפני ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להכניס את מחט הזריקה לאתר החתך ולקדם אותה במקביל לקיר העין החיצוני להיכנס למקום subretinal. קידום קרוב מדי לקיר החיצוני או עמוק מדי בתוך העין תביים את ההזרקה למיקום הלא הנכון. השיטה הטובה ביותר להבין אם המחט היא במיקום הנכון היא לתרגל את הטכניקה. תרגול בעכברים בקלילות פיגמנט או לבקן יכול לעזור לעשות זריקות מדויקות ומדויקות לתוך חלל subretinal. הסיבה לכך היא נוזל המחט והזרקה הוא גלוי בתוך העיניים האלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לחץ קל לבוכנת המזרק ולהיותהזרקת ג&#39;ין של הנוזל הרצוי. אם המחט ממוקמת כראוי בתוך מרחב subretinal, backpressure המתון יורגש. אם המחט היא בזגוגית, יהיה משמעותי פחות backpressure ופוטנציאל כלשהו ריפלוקס נוזלים במהלך הזריקה. אם יש backpressure המשמעותי, החזק את המחט במקום ללפחות 15 שניות נוספות לפני הסרת המחט באיטיות. זה יאפשר לחץ התוך העיני הגבוה לשיווי במקום refluxing וירוס או התאים מוזרק בחזרה את אתר החתך. חלק מהאוויר והמלוח ניתן להזריק לתוך חלל subretinal בשל הלחץ המוגבר הנדרשים במהלך הליך ההזרקה. יש להקפיד שלא לבצע להזריק אוויר או תמיסת מלח, שכן הוא יכול לשטוף את הווירוס או תאים המוזרקים מהעין. אפשר גם לגרום להיפרדות רשתית קבועה מהנוכחות של יותר מדי נוזלים שהוחדרו לתוך חלל subretinal. לצורך ההמחשה, צבע והאוויר עודף הוזרק into מרחב subretinal בוידאו. ניתן לראות בבירור כיצד חלק של הצבע יהיה סמוק בחזרה מתוך חלל subretinal אם יותר מדי מוזרק, אלא גם כיצד בועת האוויר נשארת בתוך מרחב subretinal ולא להיעלם לתוך הזגוגית. זה שמש כדי להדגיש כי הזריקות האלה היו במסגרת את המיקום הנכון של העין, כך שאפשר לדמיין איך המחט צריכה להיכנס לאתר החתך. כל הזריקות לתוך חלל subretinal לגרום היפרדות רשתית זמנית בשל הנוכחות של נוזל ההזרקה. אם הליך ההזרקה הושלם כראוי, היפרדות רשתית זמנית זה תהיה לרפא בתוך 24 שעות ועכברים יכולים לשמש לכל ניסויים נוספים. העין עשויה להישאר רכה למשך כשבוע בשל ההליך כירורגי, ולכן הזרקה שנייה יש להימנע בתקופה זו של זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכברים ילודים, להשתמש במלקחי ההלבשה המעוקלים בעדינות לדחוף את העין מאחורי המכסים ולמסלול. זה עשוי להיות שימושילהמתין לרגע כדי לאפשר לווירוס להתיישב בתוך מרחב subretinal ולא לגרום לו להיות סמוק מתוך אתר החתך כאשר דחף בעדינות את העין חזרה למסלולו. לאחר ניתוח, ירידה של 0.5% bupivacaine אחד (marcaine) דוללה ל -0.25% בסליין סטרילי ממחט 25-מד יכול להיות ממוקמת באזור ההזרקה. עכברים לא מראים סימנים גלויים של מצוקה לאחר ניתוח subretinal והשימוש בbupivacaine כמשכך כאבים מקומי ארוך טווח היה מספיק לשלוש השנים הקודמות. עכברים תמיד צריכים להיות במעקב אחרי ההליך כירורגי כדי לחפש סימנים של מצוקה; כגון זיהום, נפיחות או ירידה בפעילות היומית הרגילה של העכבר. אם אלה מתרחשים, הווטרינר יש להודיע ​​ותרופות לשיכוך כאבים נוספות כגון עצירות (0.05 מ&quot;ג / ק&quot;ג) יכולות להינתן כזריקת intraperitoneal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעיר את העכבר מהרדמה על פי פרוטוקול טיפול בעלי חיים אושר באופן מקומי. העכבר צריך להיות כל זמן בעמ חימוםמודעה כדי לשמור על טמפרטורת גוף תקינה כפי שהוא מתעורר מההרדמה. הניתוח צריך לקחת פחות מחמש דקות עד לסיום, לא סופר את הזמן לעכבר כדי לעבור הרדמה. לכן, כרית חימום אין צורך בהליך בפועל, אך ייתכן שיהיה צורך בעוד אחד לומד טכניקה כמו ההליך יכול לקחת משך הזמן ארוך יותר. העכבר לא צריך להיות ממוקם בחזרה לכלוב נקי עד שהחל לנוע בכוחות עצמו. לילודים, צובט בוהן עדין יעזור להם להתאושש מן ההרדמה, והם צריכים להחזיר את הצבע ותנועתם הוורודים לפני שיוצב בחזרה עם האם. עכברים צריכים להיות במעקב לאורך זמן עבור כל סימנים של מצוקה, כמפורט לעיל. </li></ol>

<ol>
	<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+retina+using+pigment+epithelial+cell+transplantation.">Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation.</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).</li><li>Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+Leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations:+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years.">Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).</li><li>Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li><li>Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa.">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89, 911-919 (2010).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li><li>Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+expression+of+cDNA+and+shRNA+slows+degeneration+in+retinitis+pigmentosa.">Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa.</a> Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).</li><li>Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+adult+mouse+iPS+cell-derived+photoreceptor+precursors+restores+retinal+structure+and+function+in+degenerative+mice.">Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice.</a> PLoS One. 6, e189992 (2011).</li><li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , (2010).</li><li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse.">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li><li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fundus+photography+and+angiography:+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes.">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22 (1999).</li><li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+resources+for+vision+research.">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384 (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

טכניקת וידאו זה מספקת הוראות השלמת ההליך כירורגי הזרקת subretinal בהצלחה, ולהבטיח שוקטור הריפוי הגנטי או תאי גזע ממוקם במיקום הנחוץ יעילות לטיפול במחלה העינים. טכניקה זו מאפשרת למיקוד של תאי רשתית כגון רשתית או קולטני אור, שכן הוא מציב את וקטורי הריפוי הגנטיים או רקמות של...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> קטלוג </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 0.8-1.10 Tube x 100 מ&quot;מ נימים (זכוכית) </td><td> קימבל זכוכית, Inc </td><td> 34502 99 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / בראון micropipette פולר </td><td> מכשיר סאטר </td><td> P-97 </td><td> Narishige microforge יכול לשמש במקום. קטלוג # MF-900 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> SL2-25ML </td><td> סיליקון </td></tr><tr><td> פוספט של Dubecco נאגר מלוח עם סידן כלוריד ומגנזיום כלוריד </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td> בטיחות-Lok 25 3/4G x 12 &quot;; סט דם אוסף </td><td> BD Vacutainer </td><td> 367298 </td><td></td></tr><tr><td> 1 המ&quot;ל Sub-Q 26מזרק 5/8G מתלבש טיפ </td><td> קיטון דיקינסון- </td><td> 309597 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5-10 Pipetter Finnpipette השני μl מתכוונן נפח </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-815 </td><td></td></tr><tr><td> 1-200 טיפים משופעים טבעיים μl </td><td> ארה&quot;ב מדעית, Inc </td><td> 1111-1700 </td><td></td></tr><tr><td> Discovery.V8 מיקרוסקופ סטריאו </td><td> Zeiss </td><td> MC1500 </td><td></td></tr><tr><td> 60 מ&quot;מ x דיש תא התרבות פוליסטירן מטפל בסגנון 15 מ&quot;מ </td><td> קורנינג Incorporated </td><td> 430166 </td><td></td></tr><tr><td> מספרי סטרייט Vannas </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3383 S </td><td></td></tr><tr><td> מלקחי הלבשה מעוקלים עם serrations העדין </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> סכין Microsurgery תואר 15 </td><td> Wilsברפואת העיניים קורפ </td><td> 091204 </td><td></td></tr><tr><td> קטמין </td><td> Ketaset III </td><td> נדא # 45-290 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> מעבדות לויד </td><td> נדא # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> Bupivacaine (Marcaine) </td><td> חברת AstraZeneca </td><td> N / </td><td></td></tr><tr><td> עצירות </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> B9275 </td><td></td></tr></tbody></table>

subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye

אובדן הראייה משפיע על כ -3.4 מיליון בני אדם בארצות הברית והוא צפוי לגדול בשנים הקרובות. 1 לאחרונה, ריפוי גנטי והשתלות תאי גזע הפכו לכולים טיפוליים מרכזיים לטיפול בעיוורון כתוצאה ממחל ניווניות של רשתית. ישנם מספר סוגים של השתלה עצמית לניוון מקולרי גיל (AMD), כגון השתלת תאי אפיתל קשתית פיגמנט, יצרו תוצאות מעודדות, וניסויים בבני אדם החלו לצורות אחרות של טיפולים בתאי גזע וגנים. 2 אלה כוללים החלפת הגן RPE65 הטיפול בחולים עם amaurosis המולד של Leber והשתלת תאי רשתית באמצעות תאי גזע עוברי אנושיים (ES) במחלת Stargardt. 3-4 עכשיו שקיימים נתיבי ריפוי גנטיים ותאי גזע זמינים לטיפול בחולים עם מחלות רשתית, חשוב לוודא הטיפולים הפוטנציאליים הללו במודלים של בעלי חיים לפני שיחולוing במחקרים בבני אדם. העכבר הפך מודל מדעי חשוב לבדיקת היעילות הטיפולית של וקטורי גן טיפוליים והשתלת תאי גזע בעין. 5-8 במאמר זה וידאו, אנו מציגים טכניקה להזריק וקטורי ריפוי גנטיים או תאי גזע לתוך החלל של subretinal עין העכבר תוך מזעור ניזק לרקמות שמסביב.

ציור של עין העכבר מוצג עם מבנים הגדולים שכותרתו לעיון, עם חצים המציגים את המיקומים לפעולות כירורגיות הזרקה הן זגוגית וsubretinal (ראשי חץ, איור 1). וקטורי גן טיפולי, כגון lacZ lentiviral וקטור (איור 2), ניתן להזריק באמצעות מקומות אלה. בנוסף, תאי גזע, כגון תאי עכ...

Watch this Scientific Journal Video about Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye at JoVE.com

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

טכניקה ניתוחית זו ממחישה את הזריקה של וקטורים בריפוי גנטי ותאי גזע לתוך חלל subretinal של עין העכבר.

הזרקת subretinal של וקטורי ריפוי גנטי ותאי גזע לעיניים המאוסות

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

subretinal-injection-gene-therapy-vectors-stem-cells-perinatal-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

32.9K Views.  Columbia University. טכניקה ניתוחית זו ממחישה את הזריקה של וקטורים בריפוי גנטי ותאי גזע לתוך חלל subretinal של עין העכבר.

Video: Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a number of gene therapy clinical trials. More recently, a number of additional AAV serotypes have also been isolated, which have been shown to exhibit selective tissue-tropism in various small and large animal models1. Of the 10 most commonly used AAV serotypes, AAV3 is by far the least efficient in transducing cells and tissues in vitro as well as in vivo.
However, in our recently published studies, we have documented that AAV3 vectors transduce human liver cancer - hepatoblastoma (HB) and hepatocellular carcinoma (HCC) - cell lines extremely efficiently because AAV3 utilizes human hepatocyte growth factor receptor as a cellular co-receptor for binding and entry in these cells2,3.
In this article, we describe the steps required to achieve high-efficiency transduction of human liver cancer cells by recombinant AAV3 vectors carrying a reporter gene. The use of recombinant AAV3 vectors carrying a therapeutic gene may eventually lead to the potential gene therapy of liver cancers in humans.

In this article, we describe the identification of the adeno-associated virus serotype 3 (AAV3) as the most efficient vector for targeting human liver cancer cells.

יעילות גבוהה התמרה של תאים סרטניים בכבד על ידי סרוטיפ Adeno-Associated וירוס רקומביננטי 3 וקטורים

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

הקמה התפשטות של גידולים רטינובלסטומה האדם עכברים החיסון לקויה

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive molecules contain an oxygen and include H2O2 (hydrogen peroxide), NO (nitric oxide), O2- (oxide anion), peroxynitrite (ONOO-), hydrochlorous acid (HOCl), and hydroxyl radical (OH-).
Oxidative species are produced not only under pathological situations (cancers, ischemic/reperfusion, neurologic and cardiovascular pathologies, infectious diseases, inflammatory diseases 1, autoimmune diseases 2, etc&hellip;) but also during physiological (non-pathological) situations such as cellular metabolism 3, 4. Indeed, ROS play important roles in many cellular signaling pathways (proliferation, cell activation 5, 6, migration 7 etc..). ROS can be detrimental (it is then referred to as "oxidative and nitrosative stress") when produced in high amounts in the intracellular compartments and cells generally respond to ROS by upregulating antioxidants such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione (GSH) that protects them by converting dangerous free radicals to harmless molecules (i.e. water). Vitamins C and E have also been described as ROS scavengers (antioxidants).
Free radicals are beneficial in low amounts 3. Macrophage and neutrophils-mediated immune responses involve the production and release of NO, which inhibits viruses, pathogens and tumor proliferation 8. NO also reacts with other ROS and thus, also has a role as a detoxifier (ROS scavenger). Finally NO acts on vessels to regulate blood flow which is important for the adaptation of muscle to prolonged exercise 9, 10. Several publications have also demonstrated that ROS are involved in insulin sensitivity 11, 12.
Numerous methods to evaluate ROS production are available. In this article we propose several simple, fast, and affordable assays; these assays have been validated by many publications and are routinely used to detect ROS or its effects in mammalian cells. While some of these assays detect multiple ROS, others detect only a single ROS.

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Here we propose simple methods to test and evaluate the presence of reactive oxygen species in cells.

הפקה וזיהוי של מינים חמצן תגובתי (ROS) סרטן

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

גישה ניתוחית חדשנית למנהל Intratracheal של סוכני יו במודל של עכברים עוברי

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

רשתית דגם ניתוק במכרסמים על ידי הזרקת subretinal של נתרן Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability in industrialized countries. Replacement of degenerated photoreceptors by cell transplantation represents a possible treatment option in future clinical applications. Indeed, recent preclinical studies demonstrated that immature photoreceptors, isolated from the neonatal mouse retina at postnatal day 4, have the potential to integrate into the adult mouse retina following subretinal transplantation. Donor cells generated a mature photoreceptor morphology including inner and outer segments, a round cell body located at the outer nuclear layer, and synaptic terminals in close proximity to endogenous bipolar cells. Indeed, recent reports demonstrated that donor photoreceptors functionally integrate into the neural circuitry of host mice. For a future clinical application of such cell replacement approach, purified suspensions of the cells of choice have to be generated and placed at the correct position for proper integration into the eye. For the enrichment of photoreceptor precursors, sorting should be based on specific cell surface antigens to avoid genetic reporter modification of donor cells. Here we show magnetic-associated cell sorting (MACS) - enrichment of transplantable rod photoreceptor precursors isolated from the neonatal retina of photoreceptor-specific reporter mice based on the cell surface marker CD73. Incubation with anti-CD73 antibodies followed by micro-bead conjugated secondary antibodies allowed the enrichment of rod photoreceptor precursors by MACS to approximately 90%. In comparison to flow cytometry, MACS has the advantage that it can be easier applied to GMP standards and that high amounts of cells can be sorted in relative short time periods. Injection of enriched cell suspensions into the subretinal space of adult wild-type mice resulted in a 3-fold higher integration rate compared to unsorted cell suspensions.

Cell transplantation represents a strategy for the treatment of retinal degeneration characterized by photoreceptor loss. Here we describe a method for enrichment of transplantable photoreceptors and their subretinal grafting into adult mice.

השתלת Subretinal של MACS מטוהרים פוטורצפטור קודמן תאים לתוך הרשתית עכבר בוגר

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

ביצוע subretinal זריקות במכרסמים כדי לספק תאי הרשתית פיגמנט האפיתל בהשעיה

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson&#039;s Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

פיתוח של מודל עכברוש מבוסס אלפא-synuclein עבור מחלת פרקינסון באמצעות הזרקת stereotactic של וקטור ויראלי הקשורים מוקטורים

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

צעד אחר פרוטוקול שלב לכירורגיה subretinal בארנבונים

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...