Name: subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye
Uploaded: 2012-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye at JoVE.com

타카유키 나가사키에서 실험 지원; 실명 방지를위한 조사이 연구는 안과 및 Visual 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 보호 정책을 준수합니다. KJW는 NIH 보조금 5T32EY013933 및 5T32DK007647-20에 의해 지원됩니다. VBM은 NIH 보조금 K08EY020530에 의해 지원됩니다.

1. Subretinal 사출을위한 장치 조립 <ol><li> 구입 또는 유리 모세관에서 100 μm의 직경 바늘을합니다. 이것은 셔터 P-97 pipet을 끌어 당기는 또는 이와 유사한 장비를 사용하여 수동으로 수행 할 수 있습니다. 가 원하는 직경 (100 μm)에 도달 할 때까지 모세관 튜브의 끝을 가열하여 가져온 것입니다. 작은 직경 바늘은 유전자 치료 벡터에 사용 할 수 있지만,이 셀 또는 눈에 손상없이 세포 분사에 대한 권장 직경입니다. 강철 바늘에 비해 유리 모세관 바늘이 망막 파손의 원인이없이 주입 유체 및 subretinal 공간에 액세스 시각화를 위해 허용하는 아주 좋은하지만, 무딘 팁을 가지고 있습니다. 멸균 용기에 70 %의 에탄올 및 저장을 사용하여 필요한 경우이 당겨 바늘을 청소하십시오. 장소에 바늘을 가질 테이프 15cm 무균 조직 배양 접시에 주입 바늘이 적용하고 무균 환경에서 유지하는 방법 중 하나입니다. 이 시점에서, compl프로 시저가 개최됩니다 외과 객실 내에서 설정을 어서!. 그것은이 절차는 장벽 시설 내에서 수행됩니다 특히,이 무균 상태로 유지 될 수 있도록 항상 수술 방에 모든 장비를 유지하기 쉬운 것입니다. </li><li> 주입 바늘에 실리콘을 기음과 바늘의 내부 벽을 따라 코팅을 떠나 실리콘를 꺼냅니다. 실리콘 코팅 달리 내부 유리 모세관 벽에 충실 것 바늘 구멍을 통해 세포 및 바이러스의 통로를 극대화 할 수 있습니다. </li><li> (튜브에서 바늘을 제거) 직접 바늘 후 시점에서 luer 잠금을 설정 25 ¾ 게이지 혈액 컬렉션을 절단하여 멸균 플라스틱 튜브의 약 8cm 길이를 얻습니다. </li><li> 멸균 식염수에 1 ML 하위 Q 26 5/8-gauge 슬립 - 팁 주사기를 작성하고 주사기에서 바늘을 제거합니다. </li><li> 플라스틱 튜브의 절단 끝으로 주입 바늘을 부착하고 다른에서 luer 잠금에 주사기를 첨부끝. </li><li> 튜브 및 모세 혈관 주사 바늘에 죽은 공간, 제대로 된 누설없이 연결되어 있는지 확인 할 수있는 주사 바늘을 통해 꺼내기 식염수를 채우기 위해 멸균 생리를 대기음. 다음으로, 주입 바늘의 끝으로, 공기의 작은, 약 1 μl 금액을 대기음. 이것은 분사 유체에서 염분을 분리하고 수술시 주입 유체의 끝을 나타내는 시각적 큐를 제공합니다. 분사 장치는 수술 중 70 % 에탄올로 닦여 깨끗한 표면에 보관해야합니다. 또한 수술 중에 사용되는 모든 장비는 이미 사용을위한 무균 준비가 보관해야 주입 바늘의 예외, 이전과 70 %의 에탄올과 이후 모두 청소해야합니다. 이러한 바늘은 수술 후에 폐기하고 있지만, 다시 사용됩니다.되어야한다 </li><li> 마지막으로, 원하는 패키지 유전자 치료 바이러스 성 벡터 또는 줄기 세포를 포함하는 사출 솔루션을 기음. 이것은하여 수행 할 수 있습니다다음 멸균 세포 배양 접시의 표면에 솔루션을 pipetting, 살균 pipet 팁에 주입 솔루션을 차지. 이 솔루션은 이제 쉽게 주사기를 사용하여 주입 바늘로 흡입 할 수 있습니다. 필요한 금액은 마우스의 나이에 따라 달라집니다. 우리의 목적을 위해 우리는 분사 유체의 0.5-0.8 μl를 주입 될 수 후 산후 5 일 마우스를 사용합니다. 작은 금액, μl 0.5 이하, 젊은 쥐와 같은 1 μl와 같은 큰 금액에 대해 사용할 수는 성인 마우스에 사용할 수 있습니다. 세포의 바이러스 titer이나 번호가 주입되는 바이러스 / 세포와 원하는 대상 조직에 따라 결정되어야합니다, 작은 볼륨에서와 같이 너무 많은 바이러스 입자 나 세포는 망막 세포에 대한 독성을 초래할 수 있습니다. 동영상에서는, 시각화의 목적으로, 우리는 1.5 μl, 눈에 삽입하는 데 필요한보다 염료의 큰 금액을 사용했습니다. </li></ol> 2. Subretinal 공간에 접근하기 <ol><li> 무균 수술 방에,마우스의 나이에 따라 달라질 수 있습니다 로컬 승인 동물 처리 프로토콜에 따라 마우스를 안정화 또는 마취. 성인 마우스에 대한 일반적인 마취 isoflurane 가스 0.1 ml/10g 바디 케타민의 무게 (100 MG / ML)와 멸균 생리에 xylazine (20 MG / ML)의 내부 - 복막 분사의 사용이 포함되어 있습니다. perinatal 마우스의 경우 일반적인 마취 기술은 isoflurane 가스 나 cryoanesthesia (저체온증)의 사용을 포함합니다. 모든 마취 기술은 사용하기 전에 해당 지역의 IACUC위원회의 승인을 받아야합니다. 유사한 기술은 P0 또는 성인 마우스에 같은 어린애 마우스에 적용 할 수 있지만 우리는 일반적으로 (P) 후 산후 5 일 마우스를 사용합니다. 마우스가 다리와 더 이상 pinches을 발끝에 응답하지를 이동 중지 될 때까지 수술이 시작 수 없습니다. perinatal 마우스의 경우, 그들은 혈액의 흐름들이 완전히 마취하에 것을 알면, 다른 키를 느려지부터 색이 현저하게 가볍고 될 것입니다. </li><li> perinatal 쥐에 Vannas 바로 가위를 사용하여 m폐쇄 뚜껑 균열 (fissure)을 따라 피해는 대략 1.5 mm 절개. 눈이 자연스럽게 미래에 열립니다 들여 쓰기에서 컷을주의하십시오. 이 뚜껑은 치유와 마우스의 개발 기간 동안 제대로 열립니다 보장합니다. 우리는이 사람들이 절차를 수행하는 동안 눈을 펑 쳐링의 위험을 줄일 수 있기 때문에 Vannas 가위를 선호하지만, 수술 블레이드는이 목적을 위해 사용할 수 있습니다. 동영상에서 가위는 눈꺼풀 여백을 따라 직접 주사 및 절개에 사용되었습니다. 이 기술을 학습 할 때, 포셉은 절단하기 전에 눈꺼풀을 들고 눈을 손상의 위험을 줄이기 위해 사용되어야합니다. </li><li> 눈을 proptose하고 약간은 분사에 대한 proptosed 개최 할 수있는 눈 아래 눈꺼풀을 꼬집어보고 곡선의 드레스 집게로 눈꺼풀를 분열. 2 단계에서 만든 뚜껑 절개가 너무 큰 경우 눈 뚜껑 아래에서 실수로 주입 절차를 수행하는 동안 적절한 노출을 방지 할 수 있습니다. 박사와 함께 눈 주위에 약간의 압력을 가해 성인 마우스의 경우,포셉을 essing은 분사에 대한 proptosed 눈을 수용 할 수 있습니다. </li><li> 작은 scleral에서 절개 또는 15도 미세 블레이드로 표면을 긁는하여 전 세계의 적도에 후부하십시오. 이 절개은 주입 바늘의 끝을 통과 할 수 밖에 대형 있지만, 그 이상은 아니 커야합니다. 선호 경우, 해당 침술 바늘 같은 작은 날카로운 바늘 대신 미세 블레이드의 subretinal 공간에이 절개를 만들기 위해 사용할 수 있습니다. 어둡게 색소 동물에서 어두운 갈색 색소 조직 (맥락막 - 망막 안료 상피) 절개의 시점에서 볼 수있게됩니다. 가벼운 색소 나 흰둥이 쥐에서 수술 마킹 펜은 절개 사이트를 나타내는 잉크 자리를 떠날 미세 블레이드의 끝에 적용 할 수 있습니다. 절개 사이트에서 깨끗한 (유리) 유체 refluxes 경우, 블레이드는 너무 깊은 위치와 유리 캐비티 및 치료 바이러스 나 세포가 분사 동안 intravitreal 공간을 입력 할 수 있습니다를 입력했습니다. visualizati에 대한목적에, 우리는 동영상의이 시점에 절개를 만들었습니다. 그것은이 경우 subretinal 주입을 완료 볼 수 있습니다, 그러나 주입 유체의 존재로 인한 망막 초연은 완전히이 마우스에 치료를하지 않을 수 있습니다. 따라서주의를 주입하기 전에 만 바깥 쪽 눈의 표면이 아니라 망막을 통해 잘라로 이동합니다. </li><li> 조심스럽게 절개 사이트로 주입 바늘을 삽입하고 subretinal 공간을 입력 바깥 쪽 눈 벽에가 나란히 진출. 눈에서 바깥 쪽 벽에 너무 가까이거나 너무 깊이 발전하는 것은 잘못된 위치에 주사를 안내합니다. 바늘이 올바른 위치에 있는지 이해하는 가장 좋은 방법은 기술을 연습하는 것입니다. 가볍게 색소 나 흰둥이 쥐에서 연습하면 subretinal 공간으로 정밀하고 정확한 주사를 만들기 위해 도움이 될 수 있습니다. 바늘과 주입 유체이 눈에서 볼 수 있기 때문입니다. </li><li> 주사기 플런저에 빛 압력을 적용하고있을원하는 유체의 진 분사. 바늘이 제대로 subretinal 공간에 배치되어있는 경우, 중간 backpressure는 느낌이 될 것입니다. 바늘이 유리 내에있는 경우, 분사 동안 훨씬 적은 backpressure 잠재적으로 어떤 액체 환류가있을 것입니다. 중요한 backpressure가있는 경우, 천천히 바늘을 제거하기 전에 적어도 추가 15 초 동안 자리에 바늘을 누르고 있습니다. 이 높은 안구 압력이 절개 사이트으로 다시 주입 바이러스 나 세포를 refluxing 대신 평준화 할 수 있습니다. 공기와 염분의 일부는 주입 절차를 수행하는 동안 필요한 압력을 증가로 인해 subretinal 공간에 주입 할 수 있습니다. 주의는 눈에서 주입 된 바이러스 나 세포를 제거 할 수 있기 때문에 공기 나 호수가 이상 - 주입하지 않도록해야합니다. 이 subretinal 공간에 주입 너무 유체의 존재에서 영구 망막 분리를 일으킬 수도 있습니다. 시각화를 위해, 초과 염료 및 공기 INT 주입 된동영상에서 subretinal 공간을 O. 그것은 명확하게 기포가 subretinal 공간에 남아 유리에 사라지지 않는 방법도 너무 많이 주입 된 경우 염료의 일부가 subretinal 공간이 다시 밖으로 내보냈되는 방법을 볼 수 있지만 할 수 있습니다. 이것은이 주사는 눈의 정확한 위치 내의 모든 있다고 강조하는 데 사용 된, 그래서 하나는 바늘이 절개 사이트를 입력하는 방법을 시각화 할 수 있습니다. subretinal 공간으로 모든 주사는 주입 유체의 존재로 인해 일시적으로 망막 분리의 원인이됩니다. 분사 절차가 제대로 완료되면,이 임시 망막 분리는 더 실험에 사용할 수있는 24 시간과 쥐 이내에 치유됩니다. 눈 수술로 인해 약 1 주일 동안 부드러운 남아있을 수 있습니다, 두 번째 분사가 시간이 기간 동안 피해야한다 그래서. </li><li> 신생아 생쥐를 들어, 부드럽게 다시 뚜껑 뒤에와 궤도로 눈을 밀어 곡선 드레싱 포셉을 사용합니다. 그것은 유용 할 수 있습니다바이러스가 subretinal 공간 내에서 해결하고 부드럽게 궤도에 다시 눈을 밀어 때이 절개 사이트의 밖으로 내보냈 될 수 없습니다 수 있도록 잠깐만 기다리세요. 수술 후, 0.5 % bupivacaine 한 방울 (marcaine)은 주입 위치에 배치 할 수있는 25 게이지 바늘로 멸균 생리에서 0.25 %로 희석. 마우스 subretinal 수술 후 고통의 명백한 징후를 표시하지 않고 오랫동안 연기 화제 진통제로 bupivacaine의 사용은 이전 3 년 동안 충분한했습니다. 이러한 감염 등, 붓기, 또는 마우스의 통상적 인 일일 활동 감소, 마우스는 항상 고민의 흔적을 찾기 위해 수술 후 모니터링해야합니다. 이러한가 발생하면 수의사에게 통지해야하고 buprenorphine (0.05 밀리그램 / kg)와 같은 더 통증 약물은 intraperitoneal 주사로 제공 할 수 있습니다. </li><li> 로컬 승인 동물 처리 프로토콜에 따라 마취에서 마우스를 시작해보십시오. 마우스는 난방이 안된다에 보관해야합니다가 마취에서 깨어으로 광고가 정상적인 체온을 유지합니다. 수술 절차는 마취를 받아야하는 마우스에 대한 시간을 계산하지가 완료 될 때까지 5 분 정도 소요됩니다. 따라서, 가열 패드는 실제 절차를 수행하는 동안 필요하지 않습니다,하지만 절차는 오랜 기간 걸릴 수로 하나가 기술을 학습하는 동안 필요할 수 있습니다. 자체에 이동하기 시작했다 때까지 마우스는 깨끗한 새장에 다시 배치하지 않아야합니다. neonates를 들어, 부드러운 냄새가 pinches 완전히 마취에서 회복하기 위해 그들에게 도움이 될 것입니다, 그들은 엄마와 함께 다시 배치되기 전에 자신의 핑크 색상과 움직임을 회복해야합니다. 이전 목록으로 쥐들이 스트레스의 징후가 시간이 지남에 따라 모니터해야합니다. </li></ol>

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	<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+retina+using+pigment+epithelial+cell+transplantation.">Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation.</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).</li><li>Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+Leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations:+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years.">Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).</li><li>Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li><li>Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa.">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89, 911-919 (2010).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li><li>Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+expression+of+cDNA+and+shRNA+slows+degeneration+in+retinitis+pigmentosa.">Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa.</a> Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).</li><li>Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+adult+mouse+iPS+cell-derived+photoreceptor+precursors+restores+retinal+structure+and+function+in+degenerative+mice.">Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice.</a> PLoS One. 6, e189992 (2011).</li><li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , (2010).</li><li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse.">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li><li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fundus+photography+and+angiography:+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes.">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22 (1999).</li><li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+resources+for+vision+research.">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384 (2011).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

이 비디오 기술은 성공적으로 subretinal 주입 수술 절차를 완료하고, 유전자 치료 벡터 또는 줄기 세포가 효율적으로 안과 질환을 치료하는 데 필요한 위치에 배치됩니다 있도록에 대한 지침을 제공합니다. 이것을 세포의 주변에 유전자 치료 벡터 또는 줄기 세포 유래 조직을두고 있기 때문에이 기술은, 이러한 RPE 또는 photoreceptors과 같은 망막 세포의 타겟팅 할 수 있습니다. 이전 방법은 유체가 유?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 목록 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 0.8-1.10 X 100mm 모세관 (유리) </td><td> 킴블 유리 주식회사 </td><td> 34,502 99 </td><td></td></tr><tr><td> / 브라운 Micropipette 풀러을 불타는 </td><td> 셔터 악기 </td><td> P-97 </td><td> Narishige microforge 대신 사용할 수 있습니다. 카탈로그 # MF-900 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> SL2-25ML </td><td> 실리콘 </td></tr><tr><td> Dubecco의 인산은 칼슘 염화물과 마그네슘 염화물과 식염 버퍼 </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td> 안전 - 무사히 다녀 오게 25 3/4G X 12 &quot;, 혈액 컬렉션 세트 </td><td> BD Vacutainer </td><td> 367298 </td><td></td></tr><tr><td> 한 ML 하위 Q 265/8G 슬립 - 팁 주사기 </td><td> Becton - 디킨슨 </td><td> 309597 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5-10 μl Finnpipette II 조정 - 볼륨 Pipetter </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-815 </td><td></td></tr><tr><td> 1-200 μl 자연 Beveled 팁 </td><td> 미국 과학 주식회사 </td><td> 1111년에서 1700년까지 </td><td></td></tr><tr><td> Discovery.V8 스테레오 현미경 </td><td> Zeiss </td><td> MC1500 </td><td></td></tr><tr><td> 60mm X 15mm 스타일 치료 폴리스티렌 세포 배양 접시 </td><td> 코닝 주식회사 </td><td> 430166 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas 스트레이트 가위 </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3383 S </td><td></td></tr><tr><td> 정교한 톱니 모양의 곡선 드레싱 포셉 </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> 15도 미세 나이프 </td><td> Wils안과 주식회사에 </td><td> 091204 </td><td></td></tr><tr><td> 케타민 </td><td> Ketaset III </td><td> 나다 # 45-290 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> 로이드 연구소 </td><td> 나다 # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> Bupivacaine (Marcaine) </td><td> 아스트라 제 네 카 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorphine </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> B9275 </td><td></td></tr></tbody></table>

subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye

시력의 손실이 미국에서 약 3,400,000명에 영향을 미치는 향후 몇 년간 증가 할 것으로 예상된다. 최근 1 유전자 치료와 줄기 세포 transplantations는 망막 퇴행성 질환으로 인한 실명을 치료에 키 치료 도구가되었습니다. 이러한 홍채 색소 상피 세포 이식 등 연령 관련 황반 변성에 대한 autologous 이식의 여러 형태 (AMD)는 놀라운 결과를 생성하고, 인간의 임상 실험은 유전자와 줄기 세포 요법의 다른 형태에 시작했습니다.이 이는 RPE65 유전자 교환을 포함 Leber의 선천성 amaurosis과 Stargardt의 질병에 인간 배아 줄기 (ES) 세포를 사용하여 RPE 세포 이식 환자에서 치료. 3-4 이제 유전자 치료 벡터 및 망막 질환으로 환자를 치료에 사용할 수 줄기 세포가, 그걸 확인하는 것이 중요합니다 동물 모델에서 이러한 잠재적 인 치료 전에 적용인간의 연구에서 그들을 들죠. 마우스가 눈에 유전자 치료 벡터와 줄기 세포 이식의 치료 효능을 테스트하기위한 중요한 과학적 모델이되었습니다.이 동영상을 문서에 5-8, 우리는의 subretinal 공간으로 유전자 치료 벡터 또는 줄기 세포를 주입 할 수있는 기술을 제시 마우스 눈 주변 조직의 손상을 최소화하면서.

마우스 눈의 그림을 intravitreal와 subretinal 모두 주입 수술 절차 (화살촉, 그림 1)의 위치를 표시하는 화살표로, 참조 표시 주요 구조로 표시됩니다. 예를 lacZ lentiviral 벡터 (그림 2)와 같은 유전자 치료 벡터는 이러한 위치를 사용하여 주입 할 수 있습니다. 또한, 이러한 마우스 배아의 줄기 세포 (그림 3)과 같은 줄기 세포는 또한 마우스 눈이 사이트에 이식...

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Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

이 수술 기법은 마우스 눈의 subretinal 공간으로 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 주입을 보여줍니다.

마우스 눈에 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 Subretinal 주입

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

33.1K 조회수.  Columbia University. 이 수술 기법은 마우스 눈의 subretinal 공간으로 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 주입을 보여줍니다.

비디오: Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

연구

신경과학

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

나트륨 히알루 론산의 망막 주사 설치류에있는 망막 박리 모델

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

의학

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

마우스 망막 신경절 세포의 유전자 발현에 대한 utero 및 전직 생체내의 Electroporation에

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

생물학

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

서스펜션에 망막 색소 상피 세포를 제공하기 위해 설치류에서 망막 주사를 수행

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

마우스 망막 색소 상피의 유전자 치료에 대한 바이러스 벡터의 윤부 접근 - 망막 주입

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to the interphotoreceptor/subretinal compartment that has direct exposure to photoreceptors and the retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injections of plasminogen as well as recent preclinical and clinical trials have demonstrated safety and/or efficacy of delivering viral vectors and stem cells to individuals with advanced retinal disease. Mouse models of retinal disease, particularly hereditary retinal dystrophies, are essential for testing these therapies. The most common injection procedure in rodents is to use small transcorneal or transcleral incisions with an anterior approach to the retina. With this approach, the injection needle penetrates the neurosensory retina disrupting the underlying RPE and on insertion can easily nick the lens, causing lens opacification and impairment of noninvasive imaging. Accessing the subretinal space via a transcleral, posterior approach avoids these problems: the needle crosses the sclera approximately 0.5 mm from the optic nerve, without retinal penetration and avoids disrupting the vitreous. Collateral damage is limited to that associated with the focal sclerotomy and the effects of a transient, serous retinal detachment. The simplicity of the method minimizes ocular injury, ensures rapid retinal reattachment and recovery, and has a low failure rate. The minimal damage to the retina and RPE allows for clear assessment of the efficacy and direct effects of the therapeutic agents themselves. This manuscript describes a novel subretinal injection technique that can be used to target viral vectors, pharmacological agents, stem cells or induced pluripotent stem (iPS) cells to the subretinal space in mice with high efficacy, minimal damage, and fast recovery.

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

망막 하 공간에 액세스하기위한 대안의 검증 사출 방법<i&gt;를 통해</i&gt;를 Transcleral 후방 접근

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the subretinal space, and to evaluate toxicity and efficacy in vivo. HR-SD-OCT uses near infrared light (800-880 nm) and has optics specifically designed for the unique optics of the mouse eye with sub-2-micron axial resolution. Transgenic mouse models of outer retinal (photoreceptor) degeneration and controls were imaged to assess the disease progression. Pulled glass microneedles were used to deliver sub retinal injections of adeno-associated virus (AAV) or nanoparticles (NP) via a trans-scleral and trans-choroidal approach. Careful positioning of the needle into the subretinal space was required prior to a calibrated pressure injection, which delivers fluid into the sub retinal space. Real time subretinal surgery was conducted on our retinal imaging system (RIS). HR-SD-OCT demonstrated progressive uniform retinal degeneration due to expression of a toxic mutant human mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgene in mice. HR-SD-OCT allows rigorous quantification of all the retinal layers. Outer nuclear layer (ONL) thickness and photoreceptor outer segment length (OSL) measurements correlate with photoreceptor vitality, degeneration, or rescue. The RIS delivery system allows real-time visualization of subretinal injections in neonatal (~P10-14) or adult mice, and HR-SD-OCT immediately determines success of delivery and maps areal extent. HR-SD-OCT is a powerful tool that can evaluate the success of subretinal surgery in mice, in addition to measuring vitality of photoreceptors in vivo. HR-SD-OCT can also be used to identify uniform animal cohorts to evaluate the extent of retinal degeneration, toxicity, and therapeutic rescue in preclinical gene therapy research studies.

Here we demonstrate a novel approach to using high resolution spectral-domain optical coherence tomography (HR-SD-OCT) to assist delivery of gene therapy agents into the subretinal space, assess its areal coverage, and characterize photoreceptor vitality.

초고 해상도 마우스 광학 일관성 단층 촬영 망막 유전자 치료 연구에서 안 구내 주사를 돕기 위해

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and Leber Congenital Amaurosis (LCA) cause progressive and debilitating vision loss. There is an unmet need for therapies that can restore vision once photoreceptors have been lost. Transplantation of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue (organoids) into the subretinal space of an eye with advanced RD brings retinal tissue sheets with thousands of healthy mutation-free photoreceptors and has a potential to treat most/all blinding diseases associated with photoreceptor degeneration with one approved protocol. Transplantation of fetal retinal tissue into the subretinal space of animal models and people with advanced RD has been developed successfully but cannot be used as a routine therapy due to ethical concerns and limited tissue supply. Large eye inherited retinal degeneration (IRD) animal models are valuable for developing vision restoration therapies utilizing advanced surgical approaches to transplant retinal cells/tissue into the subretinal space. The similarities in globe size, and photoreceptor distribution (e.g., presence of macula-like region area centralis) and availability of IRD models closely recapitulating human IRD would facilitate rapid translation of a promising therapy to the clinic. Presented here is a surgical technique of transplanting hPSC-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model allowing assessment of this promising approach in animal models.

Presented here is a surgical technique for transplanting human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model.

고양이과 거대 동물 모델에서 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 조직의 망막하 이식

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. Subretinal transplantation of therapeutic donor cells into mouse recipients is challenging due to the limited surgical space allowed by the small volume of the mouse eye. We developed a trans-scleral surgical transplantation platform with direct transpupillary vision guidance to facilitate the subretinal delivery of exogenous cells in mouse recipients. The platform was tested using retinal cell suspensions and three-dimensional retinal sheets collected from rod-rich Rho::EGFP mice and cone-rich OPN1LW-EGFP;NRL-/- mice, respectively. Live/dead assay showed low cell mortality for both forms of donor cells. Retinal grafts were successfully delivered into the subretinal space of a mouse model of retinal degeneration, Rd1/NS, with minimum surgical complications as detected by multimodal confocal scanning laser ophthalmoscope (cSLO) imaging. Two months post-transplantation, histological staining demonstrated evidence of advanced maturation of the retinal grafts into &#39;adult&#39; rods and cones (by robust Rho::EGFP, S-opsin, and OPN1LW:EGFP expression, respectively) in the subretinal space. Here, we provide a surgical platform that can enable highly accurate subretinal delivery with a low rate of complications in mouse recipients. This technique offers precision and relative ease of skill acquisition. Furthermore, the technique could be used not only for studies of subretinal cell transplantation but also for other intraocular therapeutic studies including gene therapies.

This protocol presents a transpupillary vision-guided trans-scleral approach to safely and precisely deliver subretinal cellular grafts, with a low rate of surgical complications, in mouse recipients with or without retinal degeneration.

망막 변성 마우스 모델에서 망막하 이식편의 Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. ...