وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة وACS، بما في ذلك T32CA009135، CA133027، CA070723، وCA022443. مشروع قانون سودن هو جمعية السرطان الأمريكية أستاذ باحث.

1. هندسة الخلايا مع البلازميدات المرئية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام معيار الهضم تقييد أو إعادة التركيب مثلي التقنيات لتقديم جزء DNA التي تحتوي على ما يقرب من 250 نسخة من تسلسل المشغل اللاكتوز (LACO) في البلازميد أن تصور. كان لدينا البلازميد BACmid من حوالي 170 KBP والواردة الجينوم بأكمله من الفيروسات الهربس كابوزي الورم اللحمي المرتبطة (KSHV) والمقاومة مرمزة لهيغروميسين 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدخال LACO DNA التي تحتوي على البلازميد إلى خلايا الثدييات من ترنسفكأيشن مع Lipofectamine 2000. تقاس نحن هيلا وSLK الخلايا في 60 ملم الأطباق لمدة 4 ساعة مع 10 ميكروغرام تنقية DNA البلازميد مع 25 ميكرولتر Lipofectamine 2000، 0،5 مل OptiMEM، و 3.5 مل DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير ثقافة المتوسط ​​لDMEM 5 مل مع خلايا الجنين البقري 10٪ مصل واحتضان لمدة 48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا في كثافة منخفضة في أطباق كبيرة وخلايا الثقافة في المتوسط ​​تحتوي على المضادات الحيوية لاختيار جيش التحرير الشعبى الصينى قدمsmid، ونحن تحديد خلايا في DMEM مع مصل بقري جنيني 10٪ مع 300 ميكروغرام / مل هيغروميسين لمدة 3 أسابيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام قطعة من الورق عقيمة غارقة في التربسين، فلتر لنقل هيغروميسين مقاومة المستعمرات إلى الأطباق ثقافة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما استنساخ بالنقل نمت لملء الطبق، عزل الحمض النووي لتقييد الهضم وجنوب النشاف للتأكد من أن من البوليمر LACO البلازميد هو متجانسة والحجم المتوقع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لم البلازميد تم تصميمها للتعبير عن مزيج من اسي، تصيب الحيوانات المستنسخة مناسبة مع ترميز الارتجاعي قامع اللاكتوز (اسي) لتنصهر البروتين الفلوري الحمراء، مثل اسي-tdTomato. نستخدم tdTomato بدلا من البروتينات التي يتألق أقرب إلى اللون الأخضر للحد من photoxicity التي يمكن أن تحدث من التعرض لأخطار متعددة على مدى فترات طويلة 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكن متى ما والبروتين الانصهار اسي والثقافة الخلايا في وجود 200 ميكروغرام / مل الآيزوبروبيل-BD-thiogalactoside (IPTG) لمنع البروتينات الانصهار ملزمة منDNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا لا يقل عن 3 أيام للسماح التعبير من البروتين اسي-tdTomato. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنساخ الشاشة (عن طريق غسل بعيدا IPTG وعرض الخلايا كما هو موضح أدناه) لذوي المستويات المثلى من اسي-tdTomato التي تكشف عن إشارات متميزة مع المستويات الأساسية الدنيا من البروتين الانصهار غير منضم. </li></ol> 2. تطوير نظام التصوير نظامنا التصوير يتكون من 200M Axiovert زايس مجهزة بمحرك مرحلة وخطة الهدف، Aochromat النفط 63x/1.4. وتقدم مضان ضوء الإثارة من قبل &quot;بيضاء محايدة&quot; LED نظام COLIBRI. تم الكشف عن الانبعاثات من قبل CascadeII: 1024 EMCCD الكاميرا. هذا هو تبريد، وكاميرا خلفية ضعيفة مع تسجيل مكاسب للإشارات تضخيم، والظلام هو 0،061 الحالي الإلكترونات لكل بكسل في الثانية الواحدة، وكفاءة الكم أكبر من 0.90. يتم التحكم في النظام عن طريق برنامج 4،8 Axiovision، بما في ذلك وحدة SmartExperiments. للكشف عن tdTomaلأننا سوف تستخدم مجموعة مرشح 75HE زايس التي 85٪ من الضوء يمكن أن تثير مرت فلور و 95٪ من الضوء المنبعث تمرير تصفية الانبعاثات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع نظام التصوير مع مجهر مقلوب وكاميرا EMCCD للكشف عن الإشارات الحساسة، مصدر ضوء LED لإثارة محددة واغلاق سريع، مرحلة الآلية والذراع التركيز، والتحكم الآلي البرمجيات لعمليات استحواذ من الصور على فترات طويلة مع متعددة Z-المداخن. ينبغي للنظام الجلوس على طاولة الهواء ليتم عزل من الاهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع الحاضنة مرحلة أعلى للحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5-10٪ 2 CO في غرفة مرطب. إتاحة الوقت الكافي للنظام من أجل التوصل إلى درجة حرارة مستقرة للتقليل من حركة القطع الأثرية أثناء التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام طوق ساخنة لهدف لمنع الهدف من شفط الحرارة من العينة. </li></ol> 3. تصور DNA إعتبر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا في 35 ملمالزجاج أسفل الطبق في كثافة التقاء أقل من 10٪، الأمر الذي سيتيح أزواج من الخلايا إلى تقسيمها إلى مستعمرات الخلايا دون تداخل 8-16. القيام بذلك ساعة على الأقل قبل التصوير 24-48 بحيث خلايا قابلة للحياة لديهم الوقت للقسمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ساعة واحدة إلى ثلاث قبل بدء التصوير، وشطف لوحة 3 مرات مع ثقافة المتوسط ​​الذي يفتقر الى كل من المخدرات وانتقائية IPTG. هذا الإجراء يغسل بعيدا خلايا غير قابلة للحياة ويسمح اسي البروتينات الانصهار لربط مواقع LACO في البلازميدات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال ثقافة المتوسط ​​مع DMEM مل 2 مع مصل بقري جنيني 10٪ وHEPES 25 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> امتدت استبدال الجزء العلوي من طبق الثقافة مع CultFoil في حلقة متصاعدة لطبق 35 مم. وهذا الغطاء تمنع تبخر ثقافة المتوسط، الذي من شأنه أن يزيد تركيز الملح مع مرور الوقت وقتل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الفرق تدخل النقيض (DIC) التصوير لعرض الخلايا وتحديد المستوى البؤري من أعلى وأسفل من الخلايا في حقول متعددة للعرض.في كل حقل، الانتقال إلى المستوى البؤري حوالي 1/3 من الطريق نزولا من أعلى الخلية. حفظ X، Y، Z تنسق في قائمة مواقع المرحلة المحفوظة. ملاحظة: إشارات البلازميد قد لا تكون مرئية من خلال العدسات عندما تضاء المصابيح من الخلايا عن طريق الطول الموجي المناسب للانصهار بروتين اسي. قد تكون إشارات ضعيفة فقط مرئية باستخدام الكاميرا EMCCD، والذي يسمح للإشارة التكامل مع مرور الوقت، وبالتالي يزيد من فعالية الإشارات الضعيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في برنامج حاسوبي لمراقبة المجهر، تعريف Z-كومة من الصور التي يتعين القيام بها في كل مرحلة موقف المحفوظة. اختيار من الألف إلى الياء حجم 0،35-0،50 خطوة من ميكرون، والتي سوف تسمح لك لأخذ العينات نايكست التقريبي في البعد Z 14. وتشمل &quot;إضافية&quot; شرائح فوق وتحت الطائرات التي تقع في والخلايا، وهذه الشرائح تسمح كشف الخلية بعد الحركات خلال دورة الخلية، وتستخدم أيضا في مرحلة ما بعد اكتساب تجهيز (deconvolution) من مداخن الصورة. وسيساعد هذا التضمينيؤدي إلى كومة من 40-60 الصور، اعتمادا على سمك الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في برنامج حاسوبي لمراقبة المجهر، وتحديد تجربة سلسلة زمنية لجمع صورة مشرقة للمجال Z-المداخن على فترات دقيقة 30 (لتتبع الانقسامات الخلوية والهجرات على أوقات طويلة) والصور مضان على فترات دقيقة 10-60 (لتصور البلازميدات داخل الخلايا). لا تستخدم التصوير DIC أثناء التجربة، لأنه يتطلب مزيدا من الضوء من مستوى التصوير مجال الساطع، الذي يمكن أن يعرض الخلايا دون داع لالضيائية على مدار التجارب الطويلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تجربة البرمجيات التي تسيطر عليها. ضمان ألا تؤثر على النظام (صدم، ويتعرضون لضوء الغرفة الزائدة، الخ) أثناء التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر، تجديد المياه في نظام الترطيب أثناء التجربة. </li></ol> 4. بعد الحيازة معالجة الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعراض الصور لكل نقطة Z-مكدس والوقت. اقتصاص من أي من المناطق غير الضرورية منالصور للحد من زمن الكمبيوتر في الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام خوارزمية deconvolution لإعادة تعيين كثافة إشارة إلى بكسل المنشأ في كل 15 Z-المكدس. في حين يمكن أن تستند هذه deconvolution على وظيفة نقطة انتشار النظري لنظام التصوير الخاص بك، فمن الأفضل لقياس وظيفة انتشار نقطة نظام التشغيل الخاصة بك عن طريق التصوير الفلورسنت المجهرية، واستخدام هذا القياس في الخوارزمية deconvolution. قمنا بقياس وظيفة انتشار نقطة نظام التصوير لدينا وتطبيق. متكررة مقيدة أقصى خوارزمية احتمال في برنامج AxioVision (AxioVision وصف البرامج وزايس) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دراسة الصور لتعقب التغييرات والحركات كثافة من البلازميدات خلال دورة الخلية وتقسيم البلازميدات إلى الخلايا الوليدة. </li></ol>

<ol>
	<li>Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-related+body-cavity-based+lymphomas.">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas.</a> N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).</li><li>Chang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-associated+Kaposi's+sarcoma.">Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma.</a> Science. 266, 1865-1869 (1994).</li><li>Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology 2 volume set. , (2006).</li><li>Adams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+latent+Epstein-Barr+virus+genomes+in+Raji+cells.">Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells.</a> J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).</li><li>Humme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EBV+nuclear+antigen+1+(EBNA1)+enhances+B+cell+immortalization+several+thousandfold.">The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).</li><li>Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimal+replicator+element+of+the+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+terminal+repeat+supports+replication+in+a+semiconservative+and+cell-cycle-dependent+manner.">The minimal replicator element of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner.</a> J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).</li><li>Yates, J. L., Guan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus-derived+plasmids+replicate+only+once+per+cell+cycle+and+are+not+amplified+after+entry+into+cells.">Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells.</a> J. Virol. 65, 483-488 (1991).</li><li>Ye, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+latent+nuclear+antigen+leads+to+abortive+episome+persistence.">Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence.</a> J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).</li><li>Robinett, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator/repressor+recognition.">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).</li><li>Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coupling+of+synthesis+and+partitioning+of+EBV's+plasmid+replicon+is+revealed+in+live+cells.">The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells.</a> Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).</li><li>Herndier, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+human+Kaposi's+sarcoma+cell+line+that+induces+angiogenic+tumors+in+animals.">Characterization of a human Kaposi's sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals.</a> Aids. 8, 575-581 (1994).</li><li>Zhou, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+infection+by+a+recombinant+Kaposi's+sarcoma-associated+herpesvirus+cloned+in+a+bacterial+artificial+chromosome:+application+for+genetic+analysis.">Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis.</a> J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Pawley, J. B., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Points,+pixels,+and+gray+levels:+digitizing+image+data.">Points, pixels, and gray levels: digitizing image data.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).</li><li>Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+enhancement+by+deconvolution.">Image enhancement by deconvolution.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , 488-500 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ويمكن استخدام الطريقة الموضحة هنا لمتابعة البلازميدات في خلايا الثدييات الحية على مر الزمن والتي تمتد أجيال متعددة. عن طريق الحد من التعرض للضوء الإثارة، وقد استخدمنا هذه التقنيات لمتابعة الخلايا من أزواج حديثا من خلال تقسيم المستعمرات من 16-32 الخلايا، التي تمثل ما ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> GIBCO </td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td> المصل البقري الجنين </td><td> Hyclone </td><td> SH30910.03 </td><td></td></tr><tr><td> بنسلين </td><td> سيجما </td><td> P3032 </td><td></td></tr><tr><td> الستربتوميسين كبريتات </td><td> سيجما </td><td> S9137 </td><td></td></tr><tr><td> هيغروميسين </td><td> Calbiochem </td><td> 400050 </td><td> 400 ميكروغرام / مل لSLK؛ 300 ميكروغرام / مل لهيلا </td></tr><tr><td> الآيزوبروبيل-BD-thiogalactoside (IPTG) </td><td> روش </td><td> 10 724 815 001 </td><td> تركيز النهائي 200 ميكروغرام / مل </td></tr><tص&gt; <td> Lipofectamine 2000 </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11668-027 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> الزجاج القاع الأطباق </td><td> ماتيك </td><td> P35G-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> CultFoil </td><td> Pecon </td><td> 000000-1116-08 </td><td></td></tr><tr><td> Axiovert 200M </td><td> زايس </td><td></td><td></td></tr><tr><td> COLIBRI </td><td> زايس </td><td> 423052-9500-000 </td><td></td></tr><tr><td> محايد أبيض LED </td><td> زايس </td><td> 423052-9120-000 </td><td></td></tr><tr><td> تصفية 75 م مكعب </td><td> زايس </td><td> 489075-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td> خطة لامزيغ-63x/1.4 الهدف </td><td> زايس </td><td> 440762-9904-000 </td><td></td></tr><tr><td> CascadeII: 1024 EMCCD الكاميرا </td><td> Photometrics </td><td> B10C892007 </td><td></td></tr><tr><td> Tempcontrol صغيرة </td><td> زايس / Pecon </td><td> 000000-1116-070 </td><td></td></tr><tr><td> Tempcontrol 37-2 الرقمية </td><td> زايس / Pecon </td><td> 000000-1052-320 </td><td></td></tr><tr><td> المراقب CTI 3700 الرقمية </td><td> زايس / Pecon </td><td> 411856-9903 </td><td></td></tr><tr><td> الهدف سخان </td><td> زايس / Pecon </td><td> 440760-0000-000 </td><td></td></tr><tr><td> مرحلة التسخين إدراج P </td><td> زايس / Pecon </td><td> 411861-9901-000 </td><td></td></tr><tr><td> مرحلة أعلى حاضنة S </td><td> زايس / Pecon </td><td> 411860-9902-000 </td><td></td></tr><tr><td> المرطب النظام </td><td> زايس / Pecon </td><td> 000000-1116-065 </td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring plasmid replication in live mammalian cells over multiple generations by fluorescence microscopy

يتم الاحتفاظ بعض البلازميدات طبيعيا في خلايا الثدييات. ومن بين هذه العوامل الوراثية من الهربس غاما، بما في ذلك فيروس ابشتاين بار (EBV) وكابوزي الورم اللحمي المرتبطة هربس (KSHV)، والتي تتسبب الأورام الخبيثة الإنسان متعددة 1-3. يتم نسخ هذه الجينوم الاثنين بطريقة المرخصة، كل باستخدام بروتين واحد الفيروسية والخلوية آلات النسخ المتماثل، وتم تمريرها إلى الخلايا الوليدة أثناء انقسام الخلية على الرغم من القسيم التقليدية التي تفتقر إلى 4-8. وقد تم ذلك الكثير من العمل لتوصيف مكررات هذه الجينوم البلازميد باستخدام أساليب مثل النشاف الجنوبية ومضان التهجين في الموقع (FISH). وتقتصر هذه الأساليب، وإن كان. PCR الكمي والبقع جنوب تقديم معلومات عن متوسط ​​عدد البلازميدات في الخلية في عدد السكان من الخلايا. FISH هو فحص وحيدة الخلية التي تكشف كل من متوسط ​​عدد وتوزيع بلازميد<html> ق في خلية في عدد السكان من الخلايا ولكنها ثابتة، مما يتيح أي معلومات عن الوالد أو سلالة الخلية فحصها. هنا، نحن تصف طريقة لتصور البلازميدات في الخلايا الحية. ويستند هذا الأسلوب على الربط من البروتين الموسومة fluorescently قامع اللاكتوز إلى مواقع متعددة في البلازميد من الفائدة 9. تم تصميم الحمض النووي التي تهم تشمل يكرر جنبا إلى جنب نحو 250 من المشغل اللاكتوز (LACO) التسلسل. لا بد من البروتين على وجه التحديد LACO وقامع اللاكتوز (اسي)، والتي يمكن أن تنصهر فيها بروتين فلوري. يمكن إما الانصهار البروتين يمكن التعبير عنها من البلازميد هندسيا أو عرضه ناقل فيروسات. وبهذه الطريقة، يتم تمييزها جزيئات DNA fluorescently وبالتالي تصبح مرئية عبر المجهر مضان. يتم حظر البروتين الانصهار من ربط DNA البلازميد من قبل خلايا زراعة في وجود البلازميدات IPTG حتى على استعداد ليتم عرضه. ontent &quot;&gt; ويتيح هذا النظام ليتم رصدها على البلازميدات في الخلايا الحية من خلال عدة أجيال، وكشف عن خصائص التركيب والتقسيم إلى الخلايا الوليدة. خلايا مثالية هي ملتصقة، تقاس بسهولة، ولها نواة كبيرة. وقد استخدم هذه التقنية لتحديد ما وقد تم تجميع 84٪ من EBV المستمدة من البلازميدات كل جيل و 88٪ من قسم البلازميدات تصنيعه حديثا بإخلاص إلى الخلايا الوليدة في خلايا هيلا. شوهدت أزواج من هذه البلازميدات EBV أن المربوطة أو المرتبطة الكروماتيدات الشقيقة بعد التوليف في S- المرحلة كان ينظر إليها حتى لفصل الكروماتيدات الشقيقة كما فصل في طور الصعود (10) وحاليا تستخدم هذه الطريقة لدراسة الجينوم تكرار KSHV في خلايا هيلا وخلايا SLK. خلايا هيلا وخلد الخلايا الظهارية البشرية، وخلد الخلايا البطانية SLK الإنسان الخلايا. لو كانت مستمدة في الأصل من الخلايا SLK آفة KSHV، لا هيلا ولا SLK خط خلية حرب بشكل طبيعيORS الجينوم KSHV 11. بالإضافة إلى دراسة تكاثر الفيروس، ويمكن استخدام هذه التقنية التصور للتحقيق في الآثار المترتبة على إضافة وإزالة، أو تحور مختلف عناصر تسلسل الحمض النووي على التوليف، التعريب، وتقسيم للسلطات الوطنية المعينة الأخرى البلازميد المؤتلف.

<html> وتظهر التوقعات الحد الأقصى لكثافة Z-مداخن المكتسبة في تجربة تمثيلية في الشكل 3. إشارات البلازميد نموذجية موجودة في 3-8 شرائح من Z-المكدس، اعتمادا على ما إذا كانت تمثل واحدة أو مجموعة من البلازميدات. في حالة EBV والبلازميدات KSHV المشتقة، وإشارات تتحرك ببطء داخ?...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

يوصف أسلوب للمراقبة الفردية جزيئات الحمض النووي في الخلايا الحية. ويستند هذا الأسلوب على الربط من البروتين الموسومة fluorescently قامع أمريكا اللاتينية والكاريبي لتصميم مواقع الربط DNA في المصالح. ويمكن تكييف هذه الطريقة لمتابعة السلطات الوطنية المعينة المؤتلف كثيرة في الخلايا الحية على مر الزمن.

رصد النسخ المتماثل البلازميد في خلايا الثدييات يعيش أكثر من أجيال متعددة من مضان المجهري

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

monitoring-plasmid-replication-live-mammalian-cells-over-multiple

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Views.  University of Wisconsin - Madison. يوصف أسلوب للمراقبة الفردية جزيئات الحمض النووي في الخلايا الحية. ويستند هذا الأسلوب على الربط من البروتين الموسومة fluorescently قامع أمريكا اللاتينية والكاريبي لتصميم مواقع الربط DNA في المصالح. ويمكن تكييف هذه الطريقة لمتابعة السلطات الوطنية المعينة المؤتلف كثيرة...

Video: Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

التصوير خلايا الثدييات على المدى الطويل باستخدام الميكروسكوب واسعة الميدانية

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

تصور تكرار الحمض النووي جزيء واحدة مع مضان المجهري

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

والفحص المجهري لالإسفار Mitophagy الرصد في الخميرة السكيراء الجعوية

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

الحنق المجهر لمراقبة الوقت الحقيقي من أحداث في اشارة الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

الكشف عن التعبير الجيني بين الخلايا في الخلايا الحية من الفئران، الإنسان ولحم الخنزير المنشأ عن طريق النانوية المسمى الإسفار

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

برازي تحليل جلايكورتيكود: رصد الغدة الكظرية غير الغازية في الخيليات

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...