فإن الكتاب أود أن أشكر دانا Kamalidenova، Autexier مورغان، وChopier روش، الذي جعل الفيديو والرسوم المتحركة، وكذلك لبيك فلوريان الصور ومرحلة ما بعد الإنتاج من الفيديو الصوت عبر. وقد رعت هذا العمل من أوليمبوس وبدعم من المنح المقدمة من HFSPO (شهادة جائزة التنمية)، ANR (البرنامج ناطقون chercheurs وبرنامج علوم الأعصاب بلان)، FRC (الاتحاد بور LA RECHERCHE سور جنيه Cerveau)، ولوس انجليس INSERM سالبيتريير Salpêtrière المستشفى (الأبحاث المترجمة العقد) لNR، من وزارة البحوث الفرنسية ودويتشه زمالات ما بعد الدكتوراه لForschungsgemeinschaft UP، ومن &quot;في حدود علوم الحياة&quot; الدكتوراه المدرسة، باريس ديدرو جامعة بيتنكور شولر الأساس، وFRM (مؤسسة بحوث بور لا MEDICALE) زمالة الدكتوراه لJS

1. إعداد السائل النخاعي الاصطناعي والحل بين الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل بدء التجربة، ويحتاج المرء لإعداد حل داخلي للتسجيلات المشبك التصحيح، وكذلك السائل المخي الشوكي الاصطناعي (ACSF) لإعداد الحصين. وعلاوة على ذلك سوف تحتاج مجموعة تتكون من مقص التشريح الجراحي وغرامة مقص القزحية، واثنين من ملاعق وملقط (أدوات العلوم الجميلة)؛ جهاز بالغاز الزجاج (الصغرى تصفية شمعة، روبو ألمانيا) وشبكة النسيج (ناموسية أو النايلون ضيق)، وكذلك superglue (فندق Uhu دنت). وقد وصفت تكوين التصحيح الكهربية الإعداد من قبل شريحة وبوكمان فينكل، 2001 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل حل الداخلية، ويحل (مم): 105 K-غلوكونات، 30 بوكل، 10 HEPES وEGTA 0.3 في الماء منزوع الأيونات (في 70-80٪ من الحجم النهائي). تبريد ° C حل ل4 و إضافة (مم): 4 ATP-المغنيسيوم، 0.3-GTP تريس وفسفوكرياتين 10. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع KOH والتعبئة شف مع الماء منزوع الأيونات إلى الحجم النهائي. (Osmolaritiy: ~ 280 الميلي أسمول). تصفية هذا الحل (0.2 ميكرومتر حجم المسام). الحل Aliquoted ثابت لمدة 3-4 أسابيع في - 20 درجة مئوية. ليوم واحد التجريبية، وهناك حاجة ~ 1 مل من محلول الداخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما لم ينص على خلاف ذلك، وتستخدم لإعداد ACSF الحصين والتسجيلات من الخلايا في المنطقة CA1، ويحتوي على (مم): 119 كلوريد الصوديوم، بوكل 2.5، 2.5 CaCl 2، 1،3 MgSO 4، 1 ناه ​​2 PO 4، 26،2 NaHCO 3 و 11 الجلوكوز. حل هذه الأملاح في الماء منزوع الأيونات (الأسمولية ~ 320 الميلي أسمول) والأوكسجين حل هذه لا يقل عن 10 دقيقة (درجة الحموضة ~ 7،3 حتي 7،4) مع كربوجين (95٪ O 2 و 5٪ CO 2). إعداد ما لا يقل عن 1 لتر من محلول في التجربة. وينبغي إيلاء اهتمام خاص لإعداد الأنسجة قرن آمون التي سيتم استخدامها لإجراء التجارب في المنطقة CA3 من قرن آمون. في الواقع، هذه المنطقة معرضة للنشاط صرعي وفاة الخلايا العصبية اللاحقة. synapt بالتاليوينبغي خفض النشاط IC بقوة خلال إعداد شريحة، ويتم تحقيق هذا عن طريق إجراء تشريح الحصين في الجليد الباردة حل السكروز التي تحتوي على (مم): 87 كلوريد الصوديوم، 2.5 بوكل، 0.5 CaCl 2 و 7 MgCl 2، 1 2 PO 4 ناه ، 25 NaHCO 3 و 10 الجلوكوز والسكروز 75. في هذا الحل، فإن الجمع بين الصوديوم منخفضة، تركيزات منخفضة والكالسيوم والمغنيسيوم عالية لحد كبير واحتمال إطلاق الإصدار قبل المشبكي، وكذلك بعد المشبكي مستقبلات NMDA النشاط، مما يقلل النشاط العفوي وموت الخلايا. وperfused المعدة مرة واحدة، وشرائح قرن آمون المستخدمة في التسجيلات من الخلايا من منطقة CA3 مع ACSF معدلة، يحتوي على 4 ملي CaCl 2 و 4 MgSO 4، للحد من نشاط متعدد المشابك. </li></ol> 2. إعداد شريحة الحصين الحاد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تهدئة مل 300 ~ من ACSF لدائرة تشريح، وكذلك لإعداد C ° 4 في، في حين بالاكسجين باستمرار معكربوجين. إعداد كوب صغير مع ACSF في درجة حرارة الغرفة (RT) لتخزين شريحة التي المؤكسج أيضا مع كربوجين (مخطط الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس تحت غطاء محرك السيارة مع منشفة ورقية صغيرة غارقة مع 1 مل isoflurane التي يتم إضافتها إلى القفص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تخدير عميق الماوس، وقطع رأسه قبالة وإضافته مباشرة إلى صحن صغير مع الثلج الباردة ACSF الاوكسيجين. إزالة فروة الرأس مع مقص صغير ونقل رئيس على الأنسجة للخطوات اللاحقة. بدء تشريح الحصين، وكما هو موضح في الشكل 1 صفها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع 300-400 ميكرون سميكة شرائح عرضية على سرعة منخفضة (3 ميكرون / ثانية) وتواتر الاهتزاز من 70 هرتز في الجليد الباردة المؤكسج ACSF، ونقلها إلى غرفة التخزين. السماح للبقية شرائح RT للتسجيل في ساعة ما لا يقل عن 1 قبل. يتم تخزين شرائح للتجارب CA3 25 دقيقة في C ° 34 و 30 دقيقة على الأقل في RT، للتعافي من عملية تشريح. </li></رأ&gt; 3. تسجيل مزدوج من التيارات Astroglial مستدعى والإمكانيات الميدانية العصبية نحن هنا تصف كيفية تسجيل synaptically-استجابات astroglial والعصبية، والاستجابات الناجمة عن أي تفعيل المشبك من خلال تحفيز afference باستخدام القطب خارج الخلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي باستمرار دائرة تسجيل مع ACSF الاوكسيجين (1،5-2 مل / دقيقة، RT)، التي تحتوي على 100 ​​ميكرومتر بيكروتوكسين (GABA A خصم) لعزل ردود مثير. نقل شريحة الصعود إلى بولي يسين-L-(1،5 حتي 3 ملغ / مل) ساترة المغلفة، نقع السائل لتحقيق التصاق شريحة جيدة وإضافة قطرة من ASCF على رأس شريحة. وضع ساترة إلى غرفة تسجيل. يمكن انتقال العدوى المثبطة الحصار من قبل بيكروتوكسين يؤدي إلى نشاط صرعي، عفوية أي إطلاق متزامن للسكان العصبية، والتي سوف تشوه قياس الأحداث أثار. وهكذا، لمنع نشاط صرعي، وجعلقطع مسطحة (فقط سطح) بين المناطق CA1 وCA3 لمنع انتشار عن طريق الضمانات شيفر (كما هو مبين في الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تحديد الطبقة المشععة الخلايا النجمية من حجمها الصغير سوما (~ 10 ميكرون) والجمعية النجمية العملية. اختيار الخلية لا يقل عن 20-30 ميكرومتر تحت سطح شريحة. شن القطب التحفيز الزجاج (المقاومة تلميح ~ 1 MΩ) على السلك الفضة متصل إلى الحافز مربع العزلة وترتكز إلى الحمام (ببساطة عن طريق التفاف الأسلاك الفضية الثانية حول ماصة الزجاج). وضع القطب الكهربائي في المنطقة التحفيز ضمانات شيفر، كما هو مبين في الشكل 2A على مسافة من 200-300 ميكرون بعيدا عن نجمية المختار. جبل القطب تسجيل الميدان (2-5 MΩ ~) على سلك الفضة المكلورة متصلة headstage من مكبر للصوت. تمتلئ كل من الأقطاب الكهربائية من قبل مع ACSF. اختيار multiclamp في وضع I = 0، مما يؤدي إلى تعطيل كوم الخارجيةماند المدخلات ووضع القطب الكهربائي ~ 50 ميكرون بعيدا عن نجمية في المنطقة المشععة الطبقة (الشكل 2A). تسجيل الاستجابات مع زيادة 2 حتي 10 وفلتر مع فلتر كيلو هرتز بسل 2. حقن التيار الكهربائي في الدماغ يطلق على شريحة إمكانات العمل في محاور عصبية المحيطة ضمانات شيفر واللاحقة الإفراج الارسال في محطات قبل المشبكي هذا المشروع إلى الخلايا العصبية الهرمية CA1 بعد المشبكي. وأجهزة الإرسال صدر يؤدي الى تدفق شحنة موجبة إلى خلايا المستقبلات من خلال ionotropic بعد المشبكي، التي يمكن قياسها خارج الخلية والمحتملة سلبي الصغيرة. هذا المجال المحتملة بعد المشبكي مثير (fEPSP) يدمج النشاط من مجموعة من الخلايا العصبية نشطة في وقت واحد، في حين تم منع انتقال المثبطة دواء. تطبيق بعض البقول اختبار (0.1 ميللي ثانية مدتها) لتستثير fEPSP، وبعض ضعيتها القطب التحفيز قد تساعد على زيادة fEPSP. نموذجي CA1 الطبقة radiatأم هو موضح في fEPSP 2B الشكل. ويمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل حول المواقع والطول الموجي في استجابة يوان وآخرون 2003 2. ينبغي أن السعة fEPSP في شريحة الحصين صحية عادة ما تكون أكثر من ضعف كبير مثل السعة وابل من الألياف. لالكمي الدقيق لسعة fEPSP أو المنحدر، ينبغي أن يكون أثار reponse أحادي المشبك، والنشاط متعدد المشابك (للكشف عن استجابة متعددة الذروة) إلى النشاط متشابك مستقلة عن التحفيز الكهربائي، والتي يمكن أن تكون علامة لفرط الاستثارية. لإجراء التجارب في المنطقة CA3 من قرن آمون، يتم وضع التحفيز وماصات تسجيل كما هو موضح في الشكل 3C. أن تحدد بوضوح المدخلات الألياف المطحلب، والتي تسهل بقوة، وإرفاقها بالس التحفيز (50 ميللي ثانية interpulse الفاصل) و 1 هرتز التحفيز لبضع ثوان يتم تطبيقها على نطاق واسع لتعزيز السعة منخفضة في البداية أثار fEPSP responses.At نهايةيمكن أن تغسل من التجربة، DCGIV، ومستقبلات mGluR2 / 3، للتحقق في مزيد من المدخلات التي تم حفز الألياف المطحلب حقا. وينبغي تطبيق هذا الحد من خصم 90٪ من fEPSP ~ بسبب التعبير عالية من mGluR2 / 3 المستقبلات، وإطلاق سراح من قبل المشبكي تثبيط حبات الألياف المطحلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء ماصة التصحيح (2-5 ~ MΩ) مع الحل الداخلي التي تمت تصفيتها وتركيبها على سلك الفضة المكلورة متصلة headstage الثاني، تطبيق الضغط الايجابي مع حقنة، وهذا مرتبط عبر أنابيب إلى حامل ماصة الخاص بك. تطبيق اختبار باستمرار ميللي ثانية 20 من 10 نبضة بالسيارات ونقل ماصة في الأنسجة حتى تصل إلى سطح الخلية وانحراف في غشاء تصبح مرئية. صفر ماصة تعويض، وإزالة الضغط الإيجابي، وكبح الغشاء ل- MV 80. الانتظار حتى يتم التوصل gigaseal (على الأقل 1 GΩ) (لا ينبغي أن تستغرق وقتا أطول من عدة ثوان). قد تطبيق لطيف لبعض الضغط السلبي يساعد على التوصل AGigaseal. اقتحام الخلية ويتحقق من قبل تطبيق قصيرة من الضغط السلبي أو باستخدام وظيفة انطلق في multiclamp. بدء التسجيل في وقت واحد للضمانات شيفر أثار fEPSP والرد astroglial في المشبك الجهد (Vhold - 80 بالسيارات؛ زيادة التردد هرتز، كيلوهرتز بسل فلتر 2، 0.1 10). رد astroglial ثنائي الطور الحالي هو: أولا سترى بسرعة الحالية عابرة الخارج، مما يعكس fEPSPs التي تولدها الخلايا الهرمية المجاورة. وتبع ذلك ارتفاع ببطء والمتحللة (ثواني استمرار العديد من (&gt; 10 ثانية) بعد انتهاء الردود العصبية) إلى الداخل الحالية. هذا التيار ويرجع ذلك أساسا إلى إدخال البوتاسيوم داخل الخلايا النجمية، بعد الإفراج من قبل المحطات المحيطة بعد المشبكي استقطابها. وملثمون في وقت واحد سريع تنشيط نقل الغلوتامات عابرة الحالي (GLT)، نجمت عن إطلاق سراح الغلوتامات قبل المشبكي بواسطة التيار البوتاسيوم. يجب أن إمكانية عقد من نجمية، فضلا عن وصول المقاومة من التصحيح يكون موnitored في كافة مراحل التجربة، وينبغي ألا تختلف أكثر من 20٪ ~، لتجنب رصد دقيق من الصياغات astroglial نتيجة للتغيرات في ظروف التسجيل. وينبغي التحقيق في الخلايا النجمية فقط مع إمكانية عقد الأولية&gt; -70 بالسيارات لدراسة الخلايا السليمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحول من الجهد لفرض الرقابة الحالية من أجل تسجيل أثار إزالة الاستقطاب الغشاء نجمي. عزل نقل الغلوتامات الدبقية (GLT) الحالي عن طريق رذاذ من حامض الغلوتامات ionotropic مانع مستقبلات kynurenic (5 ملم)، حتى يتم حظر الكامل للfEPSP والسعة GLT قد وصلت إلى الهضبة. أن تحدد بوضوح الحالية GLT، تطبيق خصم محددة DL-β-threo-Benzyloxyaspartatic حمض (DL-TBOA، 200 ميكرومتر). زيادة قوة التحفيز من قبل أضعاف أضعاف ل-2-5 لتسجيل الاستجابات العصبية ومتشابك astroglial في قوة مختلفة، وتطبيق اثنين المحفزات المتقاربة (50 ميللي ثانية الفاصل) للتحقيق في الردود على تحفيز نبض المقترنة. استقرار R سلسلةوينبغي رصد esistance وغشاء الخلية من المحتمل الدبقية في جميع أنحاء التسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور مدى تقاطع-الفجوة بوساطة شبكات astroglial، ينبغي إجراء تجارب صبغ توصيل في وضع المشبك الحالي، دون أي حقن الحالي، لتمكين نشر السلبي من الأصباغ الجزيئية منخفضة (&lt;1.5 كيلو دالتون)، مثل B-sulforhodamine، من خلال قنوات تقاطع الفجوة. للحد من انتشار صبغة في الأنسجة المحيطة، ينبغي تطبيق الضغط الايجابي من خلال ماصة التصحيح فقط عندما تدخل الأنسجة وينبغي التوصل التصحيح في أقرب وقت ممكن. </li></ol>

<ol>
	<li>Finkel, A., Bookman, R., Crawley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+6+The+electrophysiology+setup.">Chapter 6 The electrophysiology setup.</a> Current protocols in neuroscience. , (2001).</li><li>Yuan, Y. A., Atchison, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elelctrophysiological+studies+of+neurotoxicants+on+central+synaptic+transmission+in+acutely+isolated+brain+slices.">Elelctrophysiological studies of neurotoxicants on central synaptic transmission in acutely isolated brain slices.</a> Current Protocols in Toxicology. , (2003).</li><li>Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activation+of+glutamate+transporters+in+hippocampal+astrocytes.">Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes.</a> Neuron. 19, 1297-1308 (1997).</li><li>Diamond, J. S., Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+release+monitored+with+astrocyte+transporter+currents+during+LTP.">Glutamate release monitored with astrocyte transporter currents during LTP.</a> Neuron. 21, 425-433 (1998).</li><li>Luscher, C., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+glutamate+release+during+LTP+with+glial+transporter+currents.">Monitoring glutamate release during LTP with glial transporter currents.</a> Neuron. 21, 435-441 (1998).</li><li>Pannasch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+networks+scale+synaptic+activity+and+plasticity.">Astroglial networks scale synaptic activity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 8467-8472 (2011).</li><li>Poolos, N. P., Mauk, M. D., Kocsis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-evoked+increases+in+extracellular+potassium+modulate+presynaptic+excitability+in+the+CA1+region+of+the+hippocampus.">Activity-evoked increases in extracellular potassium modulate presynaptic excitability in the CA1 region of the hippocampus.</a> J. Neurophysiol. 58, 404-416 (1987).</li><li>Amzica, F., Massimini, M., Manfridi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+buffering+during+slow+and+paroxysmal+sleep+oscillations+in+cortical+networks+of+glial+cells+in+vivo.">Spatial buffering during slow and paroxysmal sleep oscillations in cortical networks of glial cells in vivo.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 1042-1053 (2002).</li><li>Diamond, J. S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transporters+buffer+synaptically+released+glutamate+on+a+submillisecond+time+scale.">Transporters buffer synaptically released glutamate on a submillisecond time scale.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 4672-4687 (1997).</li><li>Oliet, S. H., Piet, R., Poulain, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+glutamate+clearance+and+synaptic+efficacy+by+glial+coverage+of+neurons.">Control of glutamate clearance and synaptic efficacy by glial coverage of neurons.</a> Science. 292, 923-926 (2001).</li><li>Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+contribution+to+glutamate+uptake+at+Schaffer+collateral-commissural+synapses+in+the+hippocampus.">Glial contribution to glutamate uptake at Schaffer collateral-commissural synapses in the hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7709-7716 (1998).</li><li>Danbolt, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+uptake.">Glutamate uptake.</a> Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).</li><li>Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+the+glutamate+clearance+time+course+from+transporter+currents+in+CA1+hippocampal+astrocytes:+transmitter+uptake+gets+faster+during+development.">Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2906-2916 (2005).</li><li>Scimemi, A., Tian, H., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+transporter+regulate+glutamate+clearance,+NMDA+receptor+activation,+and+synaptic+plasticity+in+the+hippocampus.">Neuronal transporter regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 14581-14595 (2009).</li><li>Davie, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+patch-clamp+recording.">Dendritic patch-clamp recording.</a> Nature. 1, 1235-1247 (2006).</li><li>Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+loading+of+calcium+indicator+dyes+to+study+astrocyte+physiology:+key+limitations+and+improvements+using+morphological+maps.">Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 9353-9358 (2011).</li><li>Panatier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+are+endogenous+regulators+of+basal+transmission+at+central+synapses.">Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses.</a> Cell. 146, 785-798 (2011).</li><li>Castro, M. A. D. i., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Ca2++detection+and+modulation+of+synaptic+release+by+astrocytes.">Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes.</a> Nature. 14, 1276-1284 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nature. 13, 759-766 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تسجيل المزدوج للsynaptically التي يسببها استجابات الخلايا العصبية والدبقية هو وسيلة مفيدة لدراسة التعديلات عبر الإنترنت في أنشطة ما قبل وبعد المشبكي المرتبطة التغييرات في خصائص astroglial. وأثار-synaptically إزالة الاستقطاب الغشاء الدبقية هو مقياس مباشر من ارتفاع البوتاسيوم خارج الخلية 8، ويرجع ذلك جزئيا إلى العمل قبل المشبكي اطلاق المحتملة، ولكن في الغالب لإزالة الاستقطاب بعد المشبكي 7. ويمكن استخدام تسجيلات لذلك من المحتمل الدبقية ديناميات غشاء للتحقيق في استثارة التعديلات قبل المشبكي، والنشاط بعد المشبكي، خارج الخلية حجم مساحة التخزين المؤقت والقدرات البوتاسيوم 6 و 8. ونقل الغلوتامات astroglial الحالي هو مقياس الحساسة الإفراج الغلوتامات قبل المشبكي، قادرة على رصد التغيرات قصيرة الأجل في احتمال الإصدار 3 و 5 و 9. وعلاوة على ذلك يمكن أن تستخدم لتوصيف وظيفي المشبك الدبقية التفاعلات في نقاط الاشتباك العصبي مختلفة أو في الحادي والتنموية المختلفةالأعمار 10. وينبغي التأكيد على أن درجة الحرارة العالية هي GLTs 11 الحساسة ويقودها التدرج الكهروكيميائية من نا +، + K وH +12. وبالتالي السعة وحركية التيار GLT تعتمد إلى حد كبير على الظروف التجريبية المختارة. وعلاوة على ذلك، ومن المعروف أن دورة الوقت الفعلي لإزالة الغلوتامات astroglial المستمدة من GLT الحالي المسجل إلى أن تحجب جزئيا. هذا ويرجع ذلك إلى تصفية التيارات GLT عن عوامل مثل خصائص سريان التيار الكهربي من الخلايا النجمية أو الإفراج الارسال غير متزامن، التي تشوه حركية بهم 13. وقد تم تطوير أساليب استخراج ميزات الزمني للآليات الترشيح، ويمكن استخدامها لاشتقاق إزالة الغلوتامات الفعلية دوام في حالات فيزيولوجية أو مرضية، كما يؤديها recenly 6،13،14. بالإضافة إلى ذلك، في وقت واحد تسجيل من إزالة الاستقطاب الغشاء astroglial، في المشبك الحالية، يمكن أن توفر insigHTS في التعديلات المحتملة للالعابرين البوتاسيوم خارج الخلية. الخلايا النجمية واحد اتصل تصل إلى 100،000 نقاط الاشتباك العصبي من الخلايا العصبية 100 ~ مختلفة، وبالتالي لا تدمج وتعدل نشاط الشبكات العصبية المحلية. عند استخدام هذه التقنية المقدمة هنا تسجيل أي الكهربية خلية كاملة من الردود الخلايا النجمية للحصول على أفكار في النشاط متشابك القاعدية، ينبغي للمرء أن نضع في الاعتبار أن الخلايا النجمية في التصحيح، المشبك، تسجيلات على المستوى سوما تسمح التيارات كشف مصدرها في الغالب من خلية سوما أو العمليات القريبة. في الواقع، والتيارات في الكشف عن سوما جزئيا فقط تنشأ من العمليات البعيدة غرامة عندما التنشيط قوية من المستقبلات والقنوات التي تحدث في عمليات متعددة غرامة يمكن أن تولد تيارات نشر إلى سوما الخلية. وبالتالي مستقبلات القاعدية والنشاط في القناة العمليات الفردية الصغيرة التي تغطي حجرات astroglial متشابك قابلا للاكتشاف على الإطلاق. هذا يرجع جزئيا إلى محدودية اليرقاتالاتحاد العالمي للتعليم والزمنية السيطرة على التيارات والفولتية الغشاء بواسطة التسجيلات التصحيح، المشبك خلية كاملة من الخلايا النجمية في الموقع. ومع ذلك، ينبغي الإشارة إلى أن سطح عمليات فيرة نجمي صغيرة يتجاوز إلى حد بعيد منطقة الغشاء من العمليات الرئيسية وسوما. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه microdomains perisynaptic astroglial تحتوي على مستقبلات ذات الصلة وظيفيا وقنوات، والتي تلعب دورا هاما المحتمل في الاتصالات وتنظيم دبقية متشابك. هذه التقنية قدمنا ​​هنا بالتالي فهي مفيدة في الغالب لدراسة التكامل نجمي النشاط متزامن من الفرق العصبية، والتي تحدث بشكل خاص خلال التحفيز afference. لا ينبغي أن تستخدم لدراسة الحوار بين نقاط الاشتباك العصبي الفردية وعمليات المتاخمة نجمي غرامة تحدث خلال النشاط العفوي القاعدية. وطريقة بديلة لدراسة الردود astroglial المحلية الناجمة عن النشاط متشابك القاعدية تكون لأداء التسجيلات المشبك التصحيح من العمليات الدقيقة، ودواحد من كل التشعبات 15. على الرغم من أن هذه العمليات الترقيع غرامة astroglial تتحدى الأرجح بسبب صغر حجمها، وربما هو وسيلة لتحقيق لكشف الحوار أكثر حميمية بين microdomains astroglial ونقاط الاشتباك العصبي الفردية. ومع ذلك، قد الكهربية الصغيرة المرجح الردود astroglial الناتجة عن العمليات الفردية astroglial الغرامة أدناه كشف العتبة، منذ الضوضاء الكهربائية تصل في المتوسط ​​سنويا 3-5 في التصحيح، المشبك التسجيلات. طريقة أخرى لدراسة الردود astroglial إلى النشاط متشابك هو التصوير الكالسيوم، منذ تفعيل مستقبلات غشاء نجمي أو نقل المواد من neuroactive يمكن أن تؤدي العابرين الكالسيوم داخل الخلايا. ومع ذلك، قد تحميل الجزء الأكبر من الخلايا النجمية مع مؤشرات الكالسيوم أيضا تعكس أساسا جسدية النشاط 16. الجمع بين التصوير الكهربية والكالسيوم يمكن أيضا الكشف عن إشارات الكالسيوم الصغيرة من عمليات astroglial غرامة، والتي تحدث إما تلقائيا أو أثار بذ التحفيز متشابك الحد الأدنى 17 و 18. ومع ذلك، ينبغي للمرء أن نضع في اعتبارنا أن مؤشرات الكالسيوم عالية تقارب قد تتصرف مثل مخازن الكالسيوم وتثبيط مسارات الكالسيوم المهم الإشارة، في حين تقارب المؤشرات المنخفضة قد عمل تحت مستوى الكشف. وأخيرا، تقنية أنيقة وغير الغازية لدراسة الأحداث الكالسيوم في عمليات نجمي الدقيقة، والتي تلتف أيضا من بين الخلايا جزيئات تبييض يشير خلال خلية كاملة التصحيح، المشبك، ويتألف جهاز استشعار في استخدام الغشاء الكالسيوم المستهدفة، والتي يمكن التعبير عنها في الخلايا النجمية في الموقع، وكذلك في الجسم الحي 19. ومع ذلك، يمكن التصوير الكالسيوم توفر سوى معلومات حول جزيء إشارة واحدة، التي تشارك في العديد من الأنشطة ولكن ليس كل الخلوية، في حين خلية كاملة التصحيح، المشبك يوفر معلومات كمية عن جميع التيارات الأيونية مختلفة أدت إلى قناة وتفعيل مستقبلات. في وقت واحد ولذلك الكهربية التسجيلات من الخلايا العصبية والخلايا النجميةهي طريقة فريدة وقوية على الانترنت لكشف ديناميات إشارات الأيونية دبقية ومعلوماتها الدماغ تجهيز الدور.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> بيكروتوكسين </td><td> سيجما </td><td> P1675 </td><td> تذوب في DMSO </td></tr><tr><td> Kynurenic حمض </td><td> Tocris </td><td> 0223 </td><td> حل في 34 ° C التحريك أو صوتنة </td></tr><tr><td> DL-TBOA </td><td> Tocris </td><td> 1223 </td><td> DCG IV Tocris 0975 </td></tr></tbody></table>

dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices

الخلايا النجمية تشكل نقاط الاشتباك العصبي مع الخلايا العصبية الثلاثية، حيث أنها تدمج وتعدل نشاط الخلايا العصبية. في الواقع، بمعنى مدخلات الخلايا النجمية العصبية من خلال تفعيل قنواتها أيون والمستقبلات العصبية، ومعالجة المعلومات جزئيا من خلال الإفراج النشاط تعتمد على gliotransmitters. وعلاوة على ذلك، تشكل الخلايا النجمية نظام امتصاص الرئيسي لالغلوتامات، والمساهمة في التخزين المؤقت المكانية البوتاسيوم، وكذلك لإزالة GABA. هذه الخلايا ولذلك نراقب باستمرار النشاط متشابك، وبالتالي هي مؤشرات حساسة للتغيرات في الغلوتامات synaptically صدر، مستويات البوتاسيوم خارج الخلية وGABA. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إحداث تغييرات في نشاط امتصاص astroglial التخزين المؤقت أو القدرة لديهم تأثيرات شديدة على وظائف الخلايا العصبية، ويمكن التغاضي عندما تميز حالات physiopathological أو الفئران خروج المغلوب. تسجيل المزدوج للأنشطة الخلايا العصبية وبالتالي astroglial وسيلة هامة لدراسة التعديلات فيقوة متشابك يرتبط في الأذهان التغيرات في امتصاص astroglial والقدرات التخزين المؤقت. هنا نحن تصف كيفية إعداد شرائح قرن آمون، وكيفية تحديد الخلايا النجمية الطبقة المشععة، وكيفية تسجيل الاستجابات العصبية الكهربية في وقت واحد وastroglial. وعلاوة على ذلك، ونحن تصف كيفية عزل التيارات عقاقيري synaptically-أثار astroglial.

ويرد التسجيل في وقت واحد ممثل synaptically-استجابات الخلايا العصبية وastroglial (fEPSPs) في منطقة قرن آمون من CA1 في الشكل 2 AB. أثار الحالي astroglial هو ثنائي الطور، أي أنه يتكون تيار عابر الخارج والداخل الحالية المتحللة ببطء (&gt; 10 ثانية) (الشكل 2B). التيار الخارج يعكس أثار fEPSP، ويتم حظر بعد تثبيط مستقبلات الغلوتامات ionotropic من حمض kynurenic (رمادي غامق التتبع، الشكل 2B) 3. غالبية الحالي يعكس بطء الداخل دخول البوتاسيوم إلى إزالة الاستقطاب بعد المشبكي نجمية التالية، حيث يتم أيضا إلغاء من قبل حمض kynurenic، بعد المشبكي مستقبلات الذي يثبط النشاط ionotropic الغلوتامات (2B 2C الشكل والشكل 1) 3-6 و المعروفة لتمثيل الرئيسية المصدر (80٪) من الإفراج البوتاسيوم 7. ما تبقى من الارتفاع السريع لهو تحول دون تدهور د الحالي إلى الداخل من قبل خصم GLT DL-TBOA (رمادي فاتح التتبع، 2B 2C الشكل والشكل 2). خاصة بعد الطرح من التيار البطيء المتبقية في TBOA (رمادي فاتح التتبع) من حمض الحالي في kynurenic (رمادي غامق التتبع) يسمح للعزلة نقل الغلوتامات astroglial نقية الحالية (تتبع أسود)، كما هو موضح في الشكل 2 2C. المتحللة ببطء الثابتة الحالية في حامض kynurenic وTBOA (رمادي فاتح التتبع، 2B 2C الشكل والشكل 2) يمكن حظره من قبل TTX (البيانات لا تظهر)، ويعكس على الأرجح تراكم K + خارج الخلية اطلاق سراح خلال ارد قبل المشبكي 3. التحفيز واحدة معتدلة من الضمانات شيفر يدفع كبيرة نسبيا الحالي astroglial synaptically-أثار بالمقارنة مع إزالة الاستقطاب صغيرة أثار سجلت في نفس الخلية (الشكل 2D). هذا ويرجع ذلك إلىانخفاض المقاومة غشاء الخلايا النجمية. تسجيل من synaptically-أثار astroglial ديناميات المحتملة الغشاء، كما هو موضح في الشكل 2D، هو مقياس مباشر من البوتاسيوم خارج الخلية المستويات المحلية 8. تطبيع أثار ردود astroglial لنشاط الخلايا العصبية الكامنة يسمح للمقارنة مباشرة من التجارب المختلفة، في الآونة الأخيرة كما هو مبين 6. يمكن رصد التيارات Astroglial وعلاوة على ذلك بشكل موثوق جدا تغييرات في انتقال مثير، حيث أن المجموع الحالي astroglial synaptically-أثار يلي خطيا الزيادة في fEPSP (2E الشكل). التيارات Astroglial تعكس أيضا قصيرة الأجل اللدونة متشابك، لأنها تظهر، والخلايا العصبية، وإرفاقها بالس تيسير (الشكل 2F). إقران خلية كاملة تسجيل من خلية نجمية والهرمية CA1 لتكشف السلوك الكهربية مختلفة جدا في كل أنواع الخلايا، لأن العمل إمكانات الخلايا العصبية العرض استجابة لنبض إزالة إستقطاب،<html> في حين أن نجمية المجاورة صامت (الشكل 3A-B). ومع ذلك، يمكن تحفيز معتدل من الضمانات شيفر تثير في وقت واحد سريع المحتملة posynaptic مثير في الخلية الهرمية CA1 وسريع تيارات الداخل إلى الخارج وبطيئة في نجمية مجاورة (الشكل 3B 2). ويمكن أيضا تسجيلات المزدوج للsynaptically-استجابات الخلايا العصبية وastroglial أن تسجل في منطقة CA3 من قرن آمون، كما هو مبين في الشكل 3C. في الواقع، واحدة من التحفيز CA3 الألياف المطحلب تثير ردود القاعدية في ظروف العصبية صغيرة جدا، كما هو مسجل fEPSPs المحلية، المرتبطة الصغيرة تيارات سريعة إلى الداخل إلى الخارج وبطيئة في الخلايا النجمية (الشكل 3D 1). في المقابل، 1 هرتز تحفيز ألياف CA3 المطحلب لبضع ثوان يقوي بقوة fEPSP، في حين أنها معتدلة فقط يزيد من استجابة astroglial (الشكل 3D 2). رقيقة الصفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4418/4418fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. العزلة الحصين لإعداد شرائح مستعرضة. لتشريح الدماغ، وقطع سكل على طول خط الوسط (أ). جعل خفض الاكليلية على مستوى البصلة الشمية (ب) وبعد ذلك على مستوى المخيخ (ج). إزالة بعناية سكل مع مساعدة من ملقط (د)، فصل نصفي الكرة الأرضية مع شفرة (ه)، ونقلها على ملعقة صغيرة في ACSF الاوكسيجين الباردة (و). بعد موازنة دقيقة ~ 5، مكان واحد نصف الكرة على الأنسجة الجافة مع السطح الإنسي حتى (ز). مع بمساعدة اثنين من ملاعق إزالة الدماغ البيني (HJ). الحصين مرئيا الآن، كما يتضح من الخطوط المتقطعة (ك). تشريح الحصين مع ملعقة بها، بدءا من الخمل وظاهرة للعيان وبنية بيضاء (LM). نقل مرة أخرى إلى الحصين ACSF الباردة. إعداد الاغاروز صغيرة لبنة، ضع الحصين اثنين مع الجانب شكوة حتى وhippocamp بطنيلنا تواجه حافة كتلة أجار، ونقع جميع السائل بعناية بعيدا للسماح مرفق جيدة للأجار (ن). الغراء الحصين تعلق على كتلة أجار على الجزء البطني (س). <img src="/files/ftp_upload/4418/4418fig2.jpg" alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4418/4418fig2highres.jpg"/> الشكل 2. في وقت واحد والردود العصبية astroglial أثار-synaptically في المنطقة CA1 من الحصين. A) مخطط شريحة الحصين توضح ترتيب القطب محفزة، لتفعيل الضمانات شيفر (SC)، والقطب ماصة التصحيح، لتسجيل التيارات نجمي، والقطب خارج الخلية، لتسجيل fEPSP، التي حركها التحفيز SC في قرن آمون CA1 المنطقة. B) آثار الممثل التسجيلات في وقت واحد من fEPSPs (اللوحة العليا) والتيارات نجمي (اللوحة السفلى) أثار-SC synaptically من التحفيز في presenc(ه) من المخدرات الدوائية. وتسجل لأول مرة في الردود وجود مستقبلات GABA A مانع (بيكروتوكسين، 100 ميكرومتر، آثار السوداء) لعزل ردود مثير. الطلب اللاحق من مستقبلات الغلوتامات مانع ionotropic (حمض kynurenic، 5 مم، آثار الرمادي الداكن)، ويحول دون fEPSP والجزء الأكبر من التيار طويلة الأمد astroglial، فضح مكون صغيرة وسريعة عابرة استجابة الحالية نجمي، الذي هو حساسة لنقل مانع الغلوتامات (TBOA، 200 ميكرومتر، آثار رمادي فاتح). مقياس بار، fEPSP 0،1 بالسيارات، نجمي السلطة الفلسطينية الحالي 15 و 10 ميللي ثانية. C 1). تتبع عينة من البوتاسيوم astroglial الحالي (1-2)، والتي يمكن أن تكون معزولة عن الاستجابة أثار، كما هو موضح في B (اللوحة السفلى، أسود التتبع)، وذلك بطرح عنصر الحالية المتبقية في حمض kynurenic (2) من إجمالي الحالية ( 1). مقياس بار، و 20 PA، 1 ثانية. C 2) تتبع عينة من نقل الغلوتامات الحالي (2-3)، التي حصلت عليها من الطرح الأول TBOA<html> بطء مكون nsensitive (3) من حمض الحالي في kynurenic (2). مقياس بار، و 2.5 السلطة الفلسطينية، 25 ميللي ثانية. D) عينة من آثار تيار الداخل سجلت في المشبك الجهد (اللوحة السفلى) وإزالة الاستقطاب الغشاء المقابلة المسجلة في فرض الرقابة الحالية (اللوحة العليا) التي يسببها في نجمية من التحفيز SC. شريط النطاق، المشبك الجاري 1،5 بالسيارات، الجهد المشبك 5 السلطة الفلسطينية، 1 ثانية. E) سجلت المدخلات والمخرجات يوضح منحنيات العلاقة بين ابلا الألياف قبل المشبكي (المدخلات) والتيار مجموع astroglial (الإخراج) في وقت واحد ردا على التحفيز SC (ن = 6). الزيادات الحالية astroglial خطيا مع زيادة الألياف ابلا، كما fEPSP العصبية. F) وترد عينة من آثار الاستجابة العصبية (fEPSP) والتيار نجمي لتقرن بالس التحفيز في فترة 40 ميللي ثانية interpulse. وأثار synaptically-المعارض الحالية astroglial، مثل الخلايا العصبية تيسير تقرن بالس. مقياس بار، 0.1 بالسيارات، 5 السلطة الفلسطينية، 20 ميللي ثانية. الصفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4418/4418fig3.jpg" alt="الشكل 3" fo:content-width="3.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4418/4418fig3highres.jpg"/> الشكل 3. التسجيلات المزدوجة من synaptically التي يسببها استجابات الخلايا العصبية وastroglial في المناطق CA1 وCA3 من قرن آمون. A) إعادة بناء خلية الهرمية CA1 حقن sulforhodamine-B (أحمر، 0.1٪)، ونجمية مليئة ديكستران فلوريسئين (أخضر، 0.1٪)، وذلك باستخدام خلية كاملة التصحيح، المشبك التقنية. شريط النطاق، 10 ميكرومتر. B 1) آثار الممثل التسجيلات خلية كاملة في وقت واحد من إمكانات غشاء المسجلة في فرض الرقابة الحالية من خلية الهرمية CA1 ونجمية المجاورة. إطلاق إمكانات العمل العصبية (أسود التتبع)، أثار عن طريق الحقن لإزالة إستقطاب PA 20 نبضة الحالية، تثير أي رد في نجمية مجاورة (رمادي التتبع). مقياس بار، و 20 بالسيارات، 10 باسكال، 100 ميللي ثانية. آثار عينة B 2) من تسجيلات خلية كاملة المزدوج للخلية الهرمية CA1 في البطلينوس المتداولةف ونجمية المجاورة في المشبك الجهد بعد التحفيز SC في وجود بيكروتوكسين (100 ميكرومتر). SC التحفيز تثير إمكانات مثير بعد المشبكي (الكامن الاستثاري بعد المشبكي، أسود التتبع)، ويرتبط إلى تيار صغير نجمي وطويلة الأمد (رمادي التتبع). مقياس بار، 5 بالسيارات، 10 باسكال، 100 ميللي ثانية. C) مخطط شريحة الحصين تصور في التلفيف المسنن (DG) والمناطق CA3 ترتيب القطب محفزة، لتنشيط ألياف المطحلب، القطب ماصة التصحيح (الرمادي)، لتسجيل التيارات نجمي، والقطب خارج الخلية، إلى سجل fEPSP، التي حركها CA3 تحفيز ألياف المطحلب. آثار الممثل D، E) إقران التسجيلات من CA3 fEPSPs (لوحات العليا، آثار سوداء في D 1 و D 2) ونجمي خلية كاملة الردود (أقل ألواح آثار الرمادية في D 1 و D 2) لتحفيز واحد من المطحلب CA3 الألياف عند 0.02 هرتز (تقريب أقحم في) (D 1) أو على التردد 1 هرتز التحفيز (D 2). شريط لنطاق D <sub&gt; 1 وD 2، 0.2 بالسيارات، 15 باسكال، والوقت: D 1 1 ثانية؛ D 2 100 ميللي ثانية. أقحم شريط النطاق، 0.1 بالسيارات، 100 ميللي ثانية.

Watch this Scientific Journal Video about Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices at JoVE.com

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

إعداد شرائح الدماغ الحادة من الحصين معزولة، فضلا عن التسجيلات في وقت واحد من الخلايا النجمية الكهربية والخلايا العصبية في<em&gt; الطبقة المشععة</emيوصف&gt; خلال التحفيز للضمانات SCHAFFER. ويتجلى عزلة الدوائية من البوتاسيوم astroglial والتيارات نقل الغلوتامات.

تسجيلات الكهربية المزدوجة للSynaptically-استجابات Astroglial والخلايا العصبية في الحصين شرائح الحاد

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

dual-electrophysiological-recordings-synaptically-evoked-astroglial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

27.1K Views.  Collège de France. إعداد شرائح الدماغ الحادة من الحصين معزولة، فضلا عن التسجيلات في وقت واحد من الخلايا النجمية الكهربية والخلايا العصبية في الطبقة المشععة خلال التحفيز للضمانات SCHAFFER. ويتجلى عزلة الدوائية من البوتاسيوم astroglial والتيارات نقل الغلوتامات.

Video: Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH). These gonadotropins are essential for the regulation of reproductive function. The GnRH-containing neurons are distributed diffusely throughout the hypothalamus and project to the median eminence where they release GnRH from their axon terminals into the hypophysiotropic portal system (1). In the portal capillaries, GnRH travels to the anterior pituitary gland to stimulate release of gonadotropins into systemic circulation. GnRH release is not continuous but rather occurs in episodic pulses. It is well established that the intermittent manner of GnRH release is essential for reproduction (2, 3).
Coordination of activity of multiple GnRH neurons probably underlies GnRH pulses. Total peptide content in GnRH neurons is approximately 1.0 pg/cell (4), of which 30% likely comprises the releasable pool. Levels of GnRH during a pulse (5, 6), suggest multiple GnRH neurons are probably involved in neurosecretion. Likewise, single unit activity extracted from hypothalamic multi-unit recordings during LH release indicates changes in activity of multiple neurons (7). The electrodes with recorded activity during LH pulses are associated with either GnRH somata or fibers (8). Therefore, at least some of this activity arises from GnRH neurons.
The mechanisms that result in synchronized firing in hypothalamic GnRH neurons are unknown. Elucidating the mechanisms that coordinate firing in GnRH neurons is a complex problem. First, the GnRH neurons are relatively few in number. In rodents, there are 800-2500 GnRH neurons. It is not clear that all GnRH neurons are involved in episodic GnRH release. Moreover, GnRH neurons are diffusely distributed (1). This has complicated our understanding of coordination of firing and has made many technical approaches intractable. We have optimized loose cell-attached recordings in current-clamp mode for the direct detection of action potentials and developed a recording approach that allows for simultaneous recordings from pairs of GnRH neurons.

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Activity in neuronal systems often requires synchronous action potential discharges from neurons within a specific population. For example, pulses of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) likely require coordinated activity between GnRH neurons. We present our methodological approach for reliably obtaining simultaneous electrophysiological recordings from the diffusely distributed GnRH neurons.

المزدوج من تسجيلات الجسدية لإفراز هرمون موجهة الغدد التناسلية (GnRH) الخلايا العصبية التي تم تحديدها بواسطة بروتين الفلورية الخضراء (GFP) في شرائح طائية

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

تقرن تسجيلات خلية كاملة في عضوي شرائح الحصين

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

الكهربية والمورفولوجية توصيف العصبية الحادة رقائق في الدماغ عن طريق شرائح الموثوقة التصحيح، المشبك التسجيلات

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

التحقيق في متشابك وسم / القبض على والصليب التقاط باستخدام الحاد شرائح الحصين من القوارض

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

تسجيل اللدونة متشابك في شرائح هيبوكامبال الحاد تحتفظ في صغيرة الحجم-إعادة التدوير، ونضح-، وغمر من نوع نظام الدائرة

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

حاد<em&gt; في فيفو</em&gt; تسجيلات الكهربية للميكانيات الميدانية المحلية والنشاط متعدد الوحدات من مسار هيبيرديركت في الفئران تخدير

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

تقييم كثافة المشبك في الدماغ القوارض هيبوكامبال شرائح

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

أوبتوجينيتيك الرائعة للذبذبات ثيتا هيبوكامبال في التصرف الفئران

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for sudden death. Despite an abundance of available treatment options, about 30% of patients are drug-resistant. Several novel therapeutics have been developed using animal models, though the rate of drug-resistant patients remains unaltered. One of probable reasons is the lack of translation between rodent models and humans, such as a weak representation of human pharmacoresistance in animal models. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Described here is a method for high quality preparation of human hippocampal brain slices and subsequent stable induction of epileptiform activity. The protocol describes the induction of burst activity during application of 8 mM KCl and 4-aminopyridin. This activity is sensitive to established AED lacosamide or novel antiepileptic candidates, such as dimethylethanolamine (DMEA). In addition, the method describes induction of seizure-like events in CA1 of human hippocampal brain slices by reduction of extracellular Mg2+ and application of bicuculline, a GABAA receptor blocker. The experimental set-up can be used to screen potential antiepileptic substances for their effects on epileptiform activity. Furthermore, mechanisms of action postulated for specific compounds can be validated using this approach in human tissue (e.g., using patch-clamp recordings). To conclude, investigation of vital human brain tissue ex vivo (here, resected hippocampus from patients suffering from temporal lobe epilepsy) will improve the current knowledge of physiological and pathological mechanisms in the human brain.

The presented protocol describes the transport and preparation of resected human hippocampal tissue with the ultimate goal to use vital brain slices as a preclinical evaluation tool for potential antiepileptic substances.

إعداد شرائح فرس النهر البشري الحادة للتسجيلات الكهربية

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.