إعداد شرائح فرس النهر البشري الحادة للتسجيلات الكهربية

باستخدام أسلوبنا، يمكننا اختبار المواد المضادة للصرع المحتملة داخل عينات الدماغ البشري للمساعدة في تطوير المخدرات للصرع الفص الصدغي. أنسجة الدماغ البشري لديه ميزة اختراق الغطاء الترجمي بين البحوث الأساسية والتطبيقات السريرية. في يوم الإجراء أو في وقت متأخر قدر الإمكان في اليوم السابق, ذوبان 50 ملليلتر من محلول 10x الكولين ACSF في حمام الماء 37 درجة مئوية وإضافة محلول ذوبان و 50 ملليلتر من 10x حل اثنين إلى ما يقرب من 300 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج.

إضافة التركيزات النهائية من الجلوكوز وكلوريد الكالسيوم إلى الخليط ويحرك حتى يذوب. ثم، إضافة الماء المقطر المزدوج إلى حجم النهائي من 500 ملليلتر. قياس التناضح.

وملء زجاجة مع ما يقرب من 100 ملليلتر من 1X الكولين ACSF. في يوم الإجراء, هدئ 1x الكولين aCSF على الجليد واستخدام موزع غاز الزجاج متصلة بغاز كاربوجين لcarogenate الحل لمدة لا تقل عن 10 إلى 15 دقيقة. على الأقل 10 إلى 15 دقيقة قبل الإجراء، قبل الدفء تخزين aCSF، والبوتاسيوم عالية بالإضافة إلى 4-أمينوبريدين aCSF، وانخفاض المغنيسيوم بالإضافة إلى bicuculline إلى 35 درجة مئوية مع carbogenation.

لتحضير غرفة الواجهة، قم بقطع ورق الفلتر من أربعة في اثنين من السنتيمتر لكل حجرة تحمل الشريحة وكومة القطع فوق بعضها البعض. ثم، ضع سلاسل قطنية رقيقة حول قطعة من ورق التصفية داخل المقصورات لكسر التوتر في المحلول وضمان تدفق زوجي. ووضع ثلاثة إلى أربعة قطعة 1.5 في سنتيمتر واحد من ورق التصفية فوق قطعة أكبر من ورقة التصفية في كل حجرة.

قبل الحصول على شرائح الأنسجة، استخدم 70٪ الإيثانول لمسح منطقة التحضير ووضع غطاء على المنطقة. مكان الغراء السوبر، واثنين من ملاقط حادة، ملعقة، مشرط مع شفرات، وشفرة لقطع الخام من أنسجة الدماغ بالقرب من الاهتزاز. مسح علبة العازلة ولوحة عينة من هزاز مع 70٪ الإيثانول.

عندما تكون علبة العازلة جافة تمامًا، غطيها برقائق الألومنيوم ووضعها في حمام الثلج. ملء حمام الجليد مع الثلج المسحوق والحفاظ على الحمام في ناقص 20 درجة مئوية حتى التحضير. ثم، مسح شفرة هزاز وشفرة حلاقة مع 70٪ الإيثانول ومعايرة هزاز لتقليل أي اهتزازات عمودية وتلف الأنسجة أثناء إجراء التقطيع.

مباشرة بعد الحصول على عينة الأنسجة, إزالة الأنسجة من نقل الكولين aCSF وقطع أي أجزاء محروقة من الأنسجة. قطع سطح حتى لتسهيل الإلتصاق من قطعة الأنسجة على لوحة العينة واستخدام هزاز لشريحة أنسجة الدماغ إلى شرائح 400 ميكرومتر سميكة، وضبط السعة وسرعة الهزاز حسب الضرورة أثناء القطع. يمكن لبعض أجزاء من الحصين الإنسان تكون أكثر مقاومة للقطع من غيرها.

يمكن أن تأخذ المزيد من الرعاية والوقت إلى حد كبير تحسين نوعية العينة. استخدام مشرط لتقليم شرائح الدماغ لتناسب في غرفة تسجيل واستخدام ملعقة ملقط صغيرة لوضع بعناية شرائح على قطعة صغيرة من ورقة تصفية في غرفة واجهة لمدة ساعة واحدة على الأقل. لتسجيل نشاط الصرع ، ضع غشاء شبه نفاذي ملتصق بطوق بلاستيكي في الغرفة وربط أنابيب التدفق وتدفق الغرفة بمضخة م peristaltic.

ملء الأنابيب والغرفة مع aCSF مُدفأة مسبقاً. لإعداد أقطاب تسجيل، سحبت ملء واحد إلى اثنين من ماصات الزجاج megaohm مع 154 ميل كلوريد الصوديوم ميليمولار. ضع الماصات في حامل قطب كهربائي واستخدم ملاقط وملعقة لنقل شريحة فرس النهر من غرفة الواجهة إلى طبق بيتري مليء بـ aCSF carbogenated.

قم بإزالة ورق التصفية دون تقليب الشريحة ووضع الشريحة في غرفة التسجيل. عقد شريحة في مكان مع شبكة شريحة ووضع الأقطاب الكهربائية في المنطقة ذات الاهتمام. ابدأ التسجيل.

وينبغي أن يكون نشاط الانفجار الناجم عن البوتاسيوم عالية بالإضافة إلى 4-aminopyridine مرئية بعد دقيقتين إلى خمس دقائق من الغسيل في, في حين أن تحريض الأحداث مثل المضبوطات من قبل المغنيسيوم منخفضة بالإضافة إلى bicuculline يمكن أن يستغرق ما يصل إلى 30 دقيقة. تطبيق البوتاسيوم عالية بالإضافة إلى 4-aminopyridine يحفز نشاط الصرع في شكل أحداث انفجار في غضون بضع دقائق. يمكن أن يسبب حدوث النوبات مثل مع مدة أكثر من 10 ثانية مع تطبيق المغنيسيوم منخفضة بالإضافة إلى bicuculline.

عدد الأحداث انفجار يقلل سواء أثناء تطبيق اللاكوساميد وتطبيق dimethylethanolamine، على الرغم من أن السعات هي في معظمها لا تتأثر. ويمكن أيضا تحسين نوعية أنسجة المخ عن طريق الحد من التلوث والأضرار أثناء التحضير. ويمكن أيضا شرائح الدماغ البشرية المعدة مع أساليبنا يمكن استخدامها للتحقيق في الوظائف الفسيولوجية الأساسية للخلايا العصبية باستخدام المشبك التصحيح أو التحقيق في التعبير الجيني باستخدام تقنيات مختلفة.

بدأت المختبرات في جميع أنحاء العالم في دراسة الآليات الأساسية داخل الدماغ البشري، ويمكن استخدام هذه الرؤى للمساعدة في تطوير الأدوية ويمكن اختبارها باستخدام أساليبنا المقترحة.