نشكر اماندا Rychel للمساعدة في تطوير والفاصل الزمني بروتوكول Pillitteri لين لبناء POLAR :: POLAR-EGFP. ونحن ممتنون أيضا للABRC لتوفير الساعة RB بناء. وقد تم تطوير هذا البروتوكول من خلال الدعم المقدم من جائزة PRESTO من تكنولوجيا العلوم اليابان والوكالة. وأيد أيضا البحث عن POLAR من جامعة واشنطن أبحاث صناديق الملوك (RRF-4098) والمؤسسة الوطنية للعلوم (MCB-0855659). تتمتع الشركة بميزة هو زميل أبحاث الدراسات العليا NSF (DGE-0718124)، والكوت هو محقق HHMI-GBMF.

1. البذور التعقيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد البذور حل التعقيم: 33٪ التبييض المنزلية، 0.1٪ تريتون X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بذور المكان المطلوب بناء تحمل مراسل الفلورسنت (ق) وراثى (ق) في أنبوب مل 1.7 و 1 مل من تطبيق الحل التعقيم. احتضان على nutator لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غطاء محرك السيارة العقيمة، استخدم pipettor حل لإزالة أنبوب التعقيم من، وترك البذور وراء. شطف مع الماء 1 مل العقيمة. كرر أربع مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في C ° 4 لمدة يومين أو أكثر. </li></ol> 2. إعداد غرفة الشرائح وسائل الإعلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط 20 مل من محلول 0.5٪ من أجار Bacto (الاغاروز يست نقية) في الماء في قارورة 200 مل، والميكروويف حتى يذوب. توخي الحذر عند الغليان الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبريد ° C. حل لحوالي 60 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 1 مل من محلول الآجار مع pipettor وتطبيق ببطء على الزجاج الغلاف الداخلي الشريحة غرفة (لاب تيك II تشامبيريد ساترة # 1.5 النظام الألماني). حل ثhich حار جدا أو تطبيقها بسرعة كبيرة جدا قد تذوب الغراء أو الزجاج الكراك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة على الفور مل الثاني من الحل أجار. ينبغي على وسائل أجار الآن تغطي كامل الجزء السفلي من الغرفة الشريحة. هذه الوسائط هي الحد الأدنى كافية لدعم التنمية في فلقة المصنع الذي يحتوي على العناصر الغذائية المخزنة، لمدة أربعة إلى خمسة أيام من خلال الحفاظ على الرطوبة والسماح انتشار الغاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشريحة باردة على الفوق مع غرفة مغطاة. إذا تم تغطيتها بإحكام قارورة، قد يتم حفظ الحل وإعادة تسخينها لاستخدامها في المستقبل. </li></ol> 3. تشريح البذور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أنبوب من البذور العقيمة من 4 ° C التخزين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع منديل ورقي على مسرح المجهر تشريح وبلل بالماء. ضبط الأنسجة لخلق سطح أملس. ويستخدم نسيج لتحقيق الاستقرار بذور تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة 20-30 البذور من الأنبوب إلى الأنسجة، والحرص على وضعها في مجال نطاق تشريح وجهة نظر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط حاد (Roboz، رقم 5 تلميح البيولوجيا)، وإزالة بعناية معطف البذور من الداخل الشتلات. يجب إزالة كل integuments الخارجي والداخلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تصوير فلقة، من المفيد لإزالة التحتفلقي والجذير الجنيني. النبتات تحتوي على مواد مغذية كافية لتطوير لعدة أيام بموجب هذا البروتوكول. إذا سليمة، فإن التحتفلقي تصويب وإطالة بشكل كبير، نقل فلقة من الوقت مضي مجال الرأي. استخدام مشرط لشريحة النبتات خالية من التحتفلقي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد النبتات تشريح مغمورة في الماء، في microtube أو ما شابه ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار 3،4-3،6 حتى يتم الوصول إلى العدد المرغوب فيه من النبتات. ويوصى 15-20 تشريح بنجاح قبل التركيب. </li></ol> 4. تصاعد النبتات في غرفة الشرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زلة صغيرة باستخدام غطاء (18 ملم 2)، وقطع طريق وسائل الإعلام وأجار رفع طبقة بأكملها ارتفاعا من قاعدة الزجاج الشريحة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة تشريح النبتات مع حد أدنى من المياه من عقدأنبوب في الشريحة غرفة، تحت طبقة أجار رفع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض بلطف على أجار والنبتات. إذا كان الماء الزائد هو الحاضر، نقع بعيدا بمنديل، والحرص على عدم تعكير صفو النبتات. يجب أن العينات لم تعد تتحرك بسهولة عند جبل كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غطاء على الشريحة والشريحة غرفة الانتقال إلى مرحلة المجهر. </li></ol> 5. الفاصل الزمني التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء المجهر مبائر مقلوب لصورة fluorophore المطلوب (ق). LSM700 المعلمات المستخدمة: لGFP، الإثارة في 488 نانومتر، وجمع مع تمريرة الفرقة مرشح في 440-530 نانومتر؛ لطلب تقديم العروض، الإثارة في 555 نانومتر، وجمع مع تمريرة الفرقة مرشح في 570-610 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفتيش العينات التي شنت عن الضرر. شنت صحيح برمجة مواقع سليمة، النبتات في صناعة البرمجيات المجهر. زن في 2009: التركيز على فلقة مع 20x الهدف والانتقال إلى مركز الهدف من الشريحة الغرفة. تحت وضع الاستحواذ وتغيير التكبير إلى 0.5 وحجم الإطار &lt;/ em&gt; ل48x48 بيكسل. حدد مربع الاختيار مواقف والمسح الضوئي الصور ... نبذة زر تحت المواقف، ثم زيادة أعداد بلاط الأفقي والرأسي ل30-35. عندما اكتمال التفحص، انقر فوق الزر مواقف تحت علامة التبويب الأبعاد ومكان مرمى في كل فلقة لمراقبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء زد يشمل البشرة فلقة من جميع زن samples.In 2009: انقر على مربع الاختيار Z-المكدس. حدد كل موقف ضمن قائمة المركز وانقر فوق الانتقال إلى الزر. التركيز على الطائرة العلوي من البشرة فلقة وانقر على زر المجموعة الأولى تحت Z-المكدس. التركيز إلى أدنى الموضع الذي مرئيا البشرة مفيد وانقر فوق الزر تعيين آخر. انقر على زر التالي لالأمثل، مما يدل على أفضل شريحة سمك Z-، لتعيين. التحقق من كل فلقة للتأكد من أن هذه الإعدادات تشمل جميع العينات، ويمكن لا ض المعلمات يتم تعيين لفرديidual مناصب في عام 2009 زين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد سلسلة زمنية في القرار المطلوب والطول. فترات من 15-30 دقيقة لمدة ثلاثة أيام هي فعالة للديناميات البروتين في انقسام الخلايا البشرة. يمكن تغيير هذا الفاصل الزمني عند الضرورة. زن في 2009: انقر فوق خانة الاختيار السلاسل الزمنية. تحت السلاسل الزمنية، على دورات لعدد من الصور المطلوبة باستخدام شريط التمرير أو الكتابة في حقل النص. تعيين الفاصل الزمني إلى 30 واستخدم القائمة المنسدلة لتحديد الحد الأدنى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ xyzt متعددة موقف الفحص. ملاحظة أنه يجب أن يقتصر عدد مواقف من المواصفات المسح، وإذا إجمالي وقت الفحص أكبر من الفاصل الزمني المطلوب، ونقطة الوقت لن يكون صحيحا. A أقصاها ستة مواقع في وقت واحد أمر ممكن عندما GFP التصوير وRFP في 59 Z-الشرائح في فاصل زمني دقيقة باستخدام 30-نظامنا. زن في 2009: تغيير حجم الإطار إلى الدقة المطلوبة وانقر فوق ابدأ التجربة. </li></ol> 6. تحرير الفيديو <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من ملف البيانات مبائر، وجعل الكثافة القصوى Z-إسقاط كل تركيبة الوقت / موقف وتصدير وملفات الصور في شكل ضياع مثل TIFF. يجب أن تكون أسماء الملفات في سلسلة واحدة في موقف (على سبيل المثال، POLAR-GFP_pos1_0001، POLAR-GFP_pos1_0002، وما إلى ذلك، وليس POLAR-GFP_0001_pos1) لبرنامج للجمع بينهما في فيلم. زن في 2009: نسخة الاستعمال: المجموعة الثانوية تحت علامة التبويب معالجة لتقسيم المناصب في ملفات منفصلة، ​​ثم أقصى كثافة الإسقاط. وأخيرا، وتصدير TIFF (ملف: تصدير، صورة دقة كاملة نافذة - سلسلة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام FIJI 7،8 إلى محاذاة الصور المتعاقبة عن طريق تشغيل الماكرو bUnwarpJ 9 (الإضافات: التسجيل: bUnwarpJ). تغيير وضع التسجيل لمونو. يمكن لجميع خيارات متقدمة استخدام القيم الافتراضية. لفترة طويلة متواليات الفاصل الزمني، قم بتحميل وتثبيت الماكرو &quot;+ تمشيا أفيني مطاطا صورة التسجيل 2D&quot;، والتي سيتم تطبيقها bUnwarpJ لسلسلة من الصور تلقائيا، و y المفتوحةباستخدام البيانات المتوفرة لدينا الملف: استيراد: تسلسل الصور لاستخدامها. إلغاء اجتماعات الأطراف معالم استخراج والتشغيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام FIJI / يماغيج أو كويك تايم برو لفتح سلسلة من الصور الانحياز وحفظ في تنسيق الفيديو المطلوب (AVI هو خيار جيد). </li></ol>

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Embryonic+Cell+Lineage+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans.">The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64 (1983).</li><li>Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A., Bate, M., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3+Mitosis+and+Morphogenesis:+Point+and+Counterpoint.">Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint.</a> Development of Drosophila melanogaster. , (1993).</li><li>Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Lineage+Patterns+and+Homeotic+Gene+Activity+During+Antirrhinum+Flower+Development.">Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development.</a> Current Biology. 5, 1449 (1995).</li><li>Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inz&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854 (2002).</li><li>Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Analysis+of+Cell+Division,+Cell+Growth,+and+Differentiation+at+the+Shoot+Apical+Meristem+in+Arabidopsis.">In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 16 (1), 74 (2004).</li><li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Profiling+of+Stomatal+Meristemoids+Reveals+New+Component+of+Asymmetric+Cell+Division+and+Commonalities+among+Stem+Cell+Populations+in+Arabidopsis.">Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23 (9), 3260 (2011).</li><li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36 (2004).</li><li>Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. &. #. 2. 2. 5. ;. n. c. h. e. z., Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. r. t. i. z. -., C, J., Kybic, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+and+Elastic+Registration+of+Histological+Sections+Using+Vector-Spline+Regularization.">Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization.</a> Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, 85-95 (2006).</li><li>Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Out+of+the+Mouths+of+Plants:+The+Molecular+Basis+of+the+Evolution+and+Diversity+of+Stomatal+Development.">Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development.</a> Plant Cell. 22 (2), 296 (2010).</li><li>Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -. Y., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Time-lapse+Documentation+Using+Confocal+and+Multi-Photon+Microscopy+Reveals+the+Mechanisms+of+Invasion+into+the+Arabidopsis+Root+Vascular+System+by+Fusarium+oxysporum.">In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum.</a> Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011 (2007).</li><li>Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Analysis+of+Stem-cell+Divisions+in+the+Arabidopsis+thaliana+Root+Meristem.">Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem.</a> Plant Journal. 48, 619 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هذه التقنية الوقت الفاصل بين مبائر يسمح الدراسات الطولية التعبير البروتين الموسومة fluorescently والترجمة في الخلايا الفردية في البشرة فلقة arabidopsis، والتي في حالة POLAR وغيرها من البروتينات بشكل حيوي تغيير أمر بالغ الأهمية لفهم صحيح وظيفتها. سابقا، وقد استخدم التصوير ا?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> Bacto آجار </td><td> BD </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> واحد الدائرة الشريحة </td><td> نونك (الحرارية العلمية) </td><td> 155360 </td><td> أو من مجلسين (155379) </td></tr><tr><td> ليزر متحد البؤر المسح المجهر </td><td> زايس </td><td> LSM700 </td><td> زن 2009 البرمجيات </td></tr><tr><td> 20X عدسة الهدف </td><td> زايس </td><td> 420650-9901 </td><td> NA 0.8، خطة لامزيغ- </td></tr><tr><td> تشريح المجهر </td><td> بنز (الوطني) </td><td> 431TBL </td><td> من ينير أدناه </td></tr><tr><td> # 5 ملقط، علم الأحياء تلميح </td><td> Roboz الأدوات الجراحية </td><td> RS-4978 </td><td> نصائح جيدة جداحاسمة </td></tr></tbody></table>

long-term, high-resolution confocal time lapse imaging of arabidopsis cotyledon epidermis during germination

يمكن التصوير في الجسم الحي من ديناميات السلوك الخلوية في جميع أنحاء سلسلة التنموية تكون تقنية قوية لفهم آليات الزخرفة الأنسجة. خلال التنمية الحيوانية، مفتاح تكاثر الخلايا والزخرفة الأحداث تحدث بسرعة كبيرة. على سبيل المثال، في ايليجانس Caenorhabditis يتم إكمال كافة الانقسامات الخلوية اللازمة لخطة الهيئة اليرقات في غضون ست ساعات بعد الإخصاب، مع دورات الإنقسامية سبعة 1، وmitoses ستة عشر أو أكثر من مرحلة التطور الجنيني ذبابة الفاكهة تحدث في أقل من 24 ساعة 2. في المقابل، الانقسامات الخلوية خلال تطوير مصنع بطيئة، وعادة بناء على أمر من يوم 3،4،5. هذا يفرض تحديا فريدا من نوعه، والحاجة لفترة طويلة الأجل التصوير الحي لتوثيق السلوكيات الحيوية من انقسام الخلايا والتمايز الأحداث خلال توالد الأعضاء النباتية. ل arabidopsis البشرة هو نظام نموذجا ممتازا لإشارات التحقيق، مصير الخلية، والتنمية في النباتات. في فلقة، هذا النسيج يتكون من الهواء وخلايا مقاومة للماء الرصيف تتخللها الثغور موزعة بالتساوي، والصمامات التي تفتح وتغلق للتحكم في تبادل الغازات وفقدان المياه. تباعد السليم لهذه الثغور أمر بالغ الأهمية لوظيفتها، وتنميتها يلي سلسلة من الخطوات غير المتماثلة وتقسيم تمايز الخلايا لإنتاج المنظمة البشرة (الشكل 1). يسمح هذا البروتوكول مراقبة الخلايا والبروتينات في البشرة على مدى عدة أيام للتنمية. هذا الإطار الزمني الدقيق للتمكن الوثائق الخلايا الجذعية الانقسامات وتمايز خلايا البشرة، بما في ذلك خلايا الثغور والرصيف البشرة. يمكن تنصهر البروتينات الفلورية إلى البروتينات التي تهم تقييم ديناميتها خلال انقسام الخلايا والعمليات التمايز. هذه التقنية تتيح لنا أن نفهم توطين بروتين الرواية، POLAR 6، خلال المرحلة انتشار الثغور-نسب الخلايا في الالبشرة ه فلقة arabidopsis، وحيث يتم التعبير عن ذلك في الخلايا التي تسبق الأحداث تقسيم غير المتماثلة وينتقل إلى منطقة مميزة للقشرة الخلية قبل وقت قصير من شعبة يحدث. يمكن تسجيل الصور والفيديو بسهولة باستخدام تبسيط إنتاج البرامج العامة المجال لتصور دينامية توطين البروتين وأنواع الخلايا لأنها تتغير مع مرور الوقت.

<html> يظهر مجموعة من النقاط التي تم جمعها الوقت بالمعلومات مع هذا الأسلوب في الشكل 3. وصفت أغشية الخلايا مع RFP (الساعة RB) وتنصهر لGFP البروتين POLAR تحت المروج موطنه الأصلي (POLAR :: POLAR-GFP) 6 في النطاق الزمني 30-دقيقة، ونحن نرى انقسامات الخلية جنبا إلى جنب مع الت?...

Watch this Scientific Journal Video about Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination at JoVE.com

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

وصفنا باستخدام بروتوكول الشرائح غرفة وسائل الاعلام الى شل النبتات مصنع للتصوير مبائر للبشرة على مدى عدة أيام للتنمية وتوثيق التمايز الثغور. يمكن تتبع البروتينات Fluorophore الموسومة بشكل حيوي بواسطة التعبير وتوطين التحت خلوية، وزيادة فهم أدوارهم ممكن خلال انقسام الخلايا وتمايز الخلايا من نوع.

على المدى الطويل، عالية الدقة الفاصل الزمني متحد البؤر التصوير من<em&gt; الطفلق ل arabidopsis</em&gt; البشرة خلال إنبات

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

long-term-high-resolution-confocal-time-lapse-imaging-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

13.6K Views.  University of Washington. وصفنا باستخدام بروتوكول الشرائح غرفة وسائل الاعلام الى شل النبتات مصنع للتصوير مبائر للبشرة على مدى عدة أيام للتنمية وتوثيق التمايز الثغور. يمكن تتبع البروتينات Fluorophore الموسومة بشكل حيوي بواسطة التعبير وتوطين التحت خلوية، وزيادة فهم أدوارهم ممكن خلال انقسام ا...

Video: Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

التصوير خلايا الثدييات على المدى الطويل باستخدام الميكروسكوب واسعة الميدانية

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

ثنائي الفوتون axotomy والوقت الفاصل بين التصوير مبائر يعيش في الأجنة الزرد

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

التصور التنمية الجمجمة في sox10: Kaede الذي الزرد المعدلة وراثيا عن طريق الخط الوقت الفاصل بين متحد البؤر المجهري

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories can face is the development and attainment of these methods. Observation of phenotypes in a process of interest is a typical objective of research labs studying gene function and this is often achieved through image capture. A particular process that is amenable to observation using imaging approaches is the corrective growth of a seedling root that has been displaced from alignment with the gravity vector. Imaging platforms used to measure the root gravitropic response can be expensive, relatively low in throughput, and/or labor intensive. These issues have been addressed by developing a high-throughput image capture method using inexpensive, yet high-resolution, flatbed scanners. Using this method, images can be captured every few minutes at 4,800 dpi. The current setup enables collection of 216 individual responses per day. The image data collected is of ample quality for image analysis applications.

This protocol describes a process for rapid collection of images of Arabidopsis seedlings responding to a gravity stimulus using commercially-available flatbed scanners. The method allows for inexpensive, high-volume capture of high-resolution images amenable for downstream analysis algorithms.

باستخدام ماسحات ضوئية مسطحة لجمع عالية الدقة، ساقطا التوقيت صور من Gravitropic استجابة نبات الأرابيدوبسيس الجذر

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

الجمع بين الخلية الانقسامية المزامنة وعالية الدقة [كنفوكل] الفحص المجهري لدراسة دور البروتينات المتعددة الوظائف دورة الخلية أثناء الانقسام

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

أسلوب متعدد الاستخدامات لتركيب نبات يترك لتصوير الوقت الفاصل بين إينترافيتال

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

وضع علامات محددة من النيوكليويدات الميتوكوندريا لمرور الوقت المجهر الإضاءة منظم

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA، طريقة لتركيب Drosophila Larva للتصوير على المدى الطويل الفاصل الزمني

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...