تسمح هذه الطريقة بتحديد التغيرات في الخواص الفيزيائية لجدار الخلية النباتية أثناء التطور وربط هذه التغييرات المجهرية بنمو عضو بأكمله. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها ليست غازية ولا تتطلب أي علاج يسمح بالقياس الكمي في الجسم الحي للخصائص الفيزيائية لجدار الخلية إضافة دقة تحت خلوية سريعة نسبيا. للبدء ، انشر طبقة رقيقة من غراء السيليكون في طبق بتري مع زلة غطاء واتركه في الهواء لمدة 45 ثانية.
باستخدام الملقط ، ضع الشتلات على الغراء ووجه اتجاهها لتجنب التلامس بين الأجزاء البارزة للشتلات والكابولي. ثم اضغط على الجذر برفق على طبقة غراء السيليكون لربطها بإحكام. اتركه لمدة 45 ثانية ، وأضف حل 1X PBS.
قم بتركيب ناتئ نيتريد السيليكون القياسي بطرف هرمي في حامل مسبار AFM للسائل ، وقم بمحاذاة الليزر على الكابولي بالقرب من موضع الطرف. ثم حرك الصمام الثنائي للصور لوضع بقعة الليزر في وسط الكاشف. قم بمعايرة حساسية الانحراف عن طريق إجراء مسافة بادئة بحجم منحدر يبلغ 3 ميكرومتر ، ومعدل مسافة بادئة وتراجع يبلغ 0.6 ميكرومتر في الثانية وعتبة زناد تبلغ 0.5 فولت.
تأكد من أن المسبار لا يتفاعل مع العينة وقم بمعايرة ثابت زنبرك الكابولي. باستخدام الأداة المساعدة للضبط الحراري ، انقر فوق معايرة متبوعة باللحن الحراري أو على أيقونة الضبط الحراري في شريط أدوات نطاق النانو وأدخل درجة حرارة الكابولي. بعد تحديد نطاق التردد ، انقر فوق زر سائل المذبذب التوافقي للعينة.
بعد ذلك ، انقر فوق البيانات المكتسبة في لوحة الضبط الحراري. الآن ، اضبط متوسط عرض المرشح على ثلاثة. اضبط عرض حاوية PSD لتقليل الضوضاء في البيانات المكتسبة عن طريق حساب المتوسط وتعيين حدود الملاءمة حول ذروة الرنين الأولى.
انقر فوق حساب ثابت الربيع K ، ثم انقر فوق نعم في النافذة المنبثقة ، واسأل عما إذا كان المستخدم يريد استخدام هذه القيمة. باستخدام المجهر الضوئي المقلوب عند تكبير قطعة العين 10 و 20 و 40 مرة ، ضع مسبار AFM على سطح خلية البشرة الرابعة الممدودة من الجذر الأساسي لضمان وضعها في وسط الخلية. مع قيمة ثابتة الربيع المحسوبة مسبقا ، تم الحصول على منحنيات قوة بحجم منحدر يبلغ 3 ميكرومتر ، وعتبة الزناد 11 نانونيوتن ، ومعدل المسافة البادئة والتراجع 0.6 ميكرومتر في الثانية في نقاط محددة.
احصل على منحنيات قوة من ثلاث خلايا لكل جذر لكل علاج والتقط ما لا يقل عن 150 منحنى قوة لكل جذر. يوضح هذا المخطط نتيجة متوقعة عند إجراء تجربة المسافة البادئة للقوة على عينات حية موضوعة في مركز خلية منطقة استطالة الجذر. عندما يبدأ طرف AFM في المسافة البادئة ، سطح جدار الخلية ، تبدأ القوة في الزيادة بسبب معارضة جدار الخلية للتشهير.
تستمر زيادة القوة حتى يتم الوصول إلى الحد الأقصى لقيمة القوة. بعد هذه النقطة ، يبدأ جزء التفريغ من المسافة البادئة. تنمو القوة بعد القطع المكافئ في جزء المسافة البادئة ، وهو أمر مهم لتناسب كل منحنى مع نموذج التنبؤ للمسافة البادئة الهرمية المستخدمة في العمليات الحسابية.
كمعلمة مناسبة ، يجب أن يتوافق موضع نقطة الاتصال مع سطح جدار الخلية قبل المسافة البادئة ويعتبر أصل إزاحة طرف AFM. منحنيات القوة التي يستحيل فيها اكتشاف نقطة الاتصال قبل التخلص من المسافة البادئة. علاوة على ذلك ، يجب أن يكون منحنى التحميل والتفريغ لتجربة المسافة البادئة للقوة خاليا من الضوضاء.
بعد تركيب كل منحنى قوة مع النموذج ، تم الحصول على الرسوم البيانية التي أظهرت توزيع تردد القيم التي تم الحصول عليها لمعامل يونغ الظاهر. يوضح هذا الرسم البياني التردد الذي تم الحصول عليه من خلال مجموعة من 201 مسافة بادئة ناجحة على تسع خلايا مختلفة لثلاث نباتات مختلفة من كولومبيا زيرو نمت في ظروف التحكم. قد تكون المسافة البادئة صعبة بالنسبة لبعض الأنماط الجينية بسبب مورفولوجيا الجذر.
على سبيل المثال ، نمت متحولة مزدوجة TTL 1 PRC 1-1 في إجهاد تناضحي شديد. توضح هذه الرسوم البيانية التوزيع الاحتمالي للقيم التي تم الحصول عليها لمعامل يونغ الظاهر من تسع خلايا مختلفة. فقط الرسم البياني H الذي يتوافق مع خلية واحدة يمكن تركيبه على توزيع Gaussian.
يمكن دمج المعدن المعروض هنا مع تقنيات أخرى مثل دراسات معدل النمو أو تحليل التركيب الكيميائي لجدار الخلية. ستكمل هذه التقنيات الأخرى المعلومات لفهم كيفية تأثير التركيب الكيميائي على الخواص الفيزيائية للجدار الخلوي على نمو العضو.
