ونحن ممتنون جدا لفيكتور GJ رودجرز للمشورة قيمة. نشكر جميع أعضاء الفريق لياو للعمل التعاوني وثيقة للغاية وللمساعدة في هذه الدراسة. وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (المنح AI076504 لJL).

1. بلازميد التركيبات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم الإطارات القراءة مفتوحة من الجينات بواسطة PCR، واستنساخ المنتجات PCR-TOPO PCRII في ناقلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد المنتجات من قبل التسلسل، واستنساخ [كدنا] الترميز CyPet-(قبل SUMO1)-YPet، CyPet SUMO1، وYPet المجالات الحفاز SENP1 في ناقلات (ب) pET28 مع علامة hexahistidine N-الطرفية. </li></ol> 2. بروتين تعبير وتنقية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل خلايا الإشريكية القولونية من سلالة BL21 (DE3) مع pET28 (ب) ناقلات ترميز CyPet-(قبل SUMO1)-YPet، CyPet SUMO1، YPet والمجالات الحفاز SENP1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو البكتيريا تحول في المتوسط ​​2xYT لمدة 3 ساعة عند 37 درجة مئوية (في 250 دورة في الدقيقة تهتز) للتوصل إلى الكثافة البصرية من 0.5 في 600 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرومتر الآيزوبروبيل β-D--thiogalactoside (IPTG) (تركيز النهائي) للحث على التعبير البروتين ويهز لمدة 16 ساعة في 25 في 200 دورة في الدقيقة C °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد البكتيريا عن طريق centrifugأوجه في 10،000 دورة في الدقيقة عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و resuspend لهم في منطقة عازلة من 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.4)، 50 ملي كلوريد الصوديوم، و 5 ملي الاميدازول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن الخلايا لمدة 10 دقيقة في 5-ثوانى فترات في وضع السلطة في 25 W باستخدام MiSonics 4000 sonicator وجمعها بواسطة الطرد المركزي في 35000 XG في 4 لمدة 30 دقيقة C °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العمود الخرز مع 500 مل ني NTA للثقافة L 1 ونقل طاف في العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الراتنج مع العازلة من 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.4)، 500 كلوريد الصوديوم ملم، و 10 ملم الاميدازول مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل البروتين مع العازلة من 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.4)، 500 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 500 ملي الاميدازول وغسيل الكلى في منطقة عازلة من 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.4)، 50 مم كلوريد الصوديوم و 1 ملي dithiothreitol (DTT) في 4 ° C ليلة وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيزات البروتينات تنقيته بواسطة الفحص برادفورد. يتبع طريقة بديلة لقياس تركيز البروتين سوف يكون SDS-PAGE الكهربائي للهلام وملطخة باللون الأزرق ثم Coomassie مع التصويرالكمية. </li></ol> 3. الكمية الحنق تحليل الطيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتستند الاستراتيجية العامة لفحص على الحنق يشير (الشكل 1). الزوج الحنق، وكانت المعلمة وCyPet YPet، إلى N-C-ومصطلحات، على التوالي، من SUMO1 مسبقة. SENP1 يشق البروتين الانصهار CyPet-(قبل SUMO1)-YPet في موقع الغليسين-الغليسين في لSUMO1 C-محطة، وبالتالي يطلق الذيل SUMO مع YPet. والحنق تتعطل إشارة، مما أدى إلى زيادة الانبعاثات من من CyPet وحدث تراجع كبير في الانبعاثات في YPet في الطول الموجي الإثارة CyPet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن عند اثارته ضوء طول موجي 414 نانومتر، والانبعاثات الإجمالية مضان من CyPet-(قبل SUMO1)-YPet في 530 نيوتن متر يمكن أن تستمد من ثلاثة مصادر: الانبعاثات المطلقة الحنق الناجم عن YPet، وCyPet المباشر الانبعاثات وYPet المباشر الانبعاثات (الشكل 2). </li></ol><img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq1.jpg" /> حيث FL 530/414 &lt;/ دون&gt; هو مجموع الانبعاثات في مضان 530 نيوتن متر عند متحمس في 414 نانومتر، FL الحنق هو إشارة المطلقة الحنق، FL CyPet (تابع) هو CyPet الانبعاثات المباشرة عندما متحمس في 414 نانومتر، وFL YPet (تابع) هو YPet توجيه الانبعاثات عند 414 نانومتر متحمس في. ومنخفض من (تابع) لتقف على المساهمة. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والانبعاثات المباشرة من CyPet في 530 نيوتن متر كان يتناسب مع الانبعاثات في 475 نانومتر في حين متحمس في 414 نانومتر مع نسبة ثابتة من α. تم إعداد CyPet-SUMO1 بتركيزات 50، 100، 200، 500، 750 و نانومتر ومم 1 ، ولقد تم قياس الانبعاثات في 475 و 530 نانومتر بعد الإثارة في 414 نانومتر لتحديد α (الشكل 3-1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كان الانبعاثات المباشرة من YPet في 530 نيوتن متر تحت الإثارة في 414 نانومتر يتناسب مع الانبعاثات أعمالها في 530 نيوتن متر عند متحمس في 475 نانومتر مع نسبة ثابتة من β. أعد YPet بتركيزات 50، 100، 200، 500، 750 Aوقد تم قياس الثانية 1000 نيوتن متر، والانبعاثات في 530 نيوتن متر عند منتهى السعادة لعينات من موجات من 414 نانومتر و475 إلى تحديد β (الشكل 3-2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يهضم CyPet-(قبل SUMO1)-YPet من SENP1، والانقسام صدر CyPet-SUMO1 والذيل مع SUMO1 YPet. عندما كان في منتهى السعادة لمجمع 414 في نانومتر، انخفضت الانبعاثات مضان في 530 نيوتن متر (&#39;FL 530/414)، ولكن لا يزال من الممكن تقسيمها إلى ثلاثة أجزاء على النحو التالي: </li></ol><img alt="المعادلة 2" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq2.jpg" /> حيث FL &quot;530/414 هو مجموع الانبعاثات في مضان 530 نيوتن متر عند الهضم بعد متحمس في 414 نانومتر، FL&quot; الحنق هو المتبقية المطلقة الحنق إشارة، FL CyPet &quot;(475/414) هو الانبعاثات في 475 نانومتر CyPet بعد الهضم عندما متحمس في 414 نانومتر (هنا هو من الانبعاثات CyPet قسمين: غير مهضوم CyPet-(قبل SUMO1)-YPet وهضمها CyPet-SUMO1)، وYPet FL(530/475) هو الانبعاثات YPet عندما متحمس في 475 نانومتر، والتي هي مستمرة ما إذا كان يهضم CyPet-(قبل SUMO1)-YPet أم لا. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الهضم من قبل SENP1، ما تبقى من الحنق الانبعاثات (&#39;FL الحنق) هو: </li></ol><img alt="المعادلة 3" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq3.jpg" /> حيث C هو التركيز الكلي للCyPet-YPet-(قبل SUMO1) و x هو تركيز هضمها CyPet-(قبل SUMO1)-YPet. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من خلال الجمع بين كافة العناصر، والكشف عن مضان الانبعاثات في 530 نيوتن متر تحت الإثارة من 414 نانومتر (FL &quot;530/414) هو: </li></ol><img alt="المعادلة 4" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq4.jpg" /> 4. الحنق القائم على الفحص البروتياز لدراسة الحركية إنزيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد حضنت CyPet-(قبل SUMO1)-YPet مع المجال الحفاز في SENP1 C ° 37 في مخزن مؤقت 20 مم 0.1٪ تريس، حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.4)، 50 مم كلوريد الصوديوم، (ت /ت) توين-20 و 1 ملم DTT إلى وحدة تخزين ما مجموعه 80 مل ونقلها إلى 384 لوحة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأجريت أشواط من خلال قياس الانبعاثات مضان في 475 و 530 نانومتر بعد الإثارة في 414 نانومتر في لوحة مضان القارئ multiwell لمدة 5 دقائق مع 15 ثانية فترات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ارتبط معدل التفاعل (V) مع تغيير في كمية الركيزة (S) على النحو التالي: </li></ol><img alt="المعادلة 5" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq5.jpg" /><ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيز المنتج زادت أضعافا مضاعفة من 0 كما [S] 0 (الأصلي تركيز الركيزة) عندما ر = 0: </li></ol><img alt="المعادلة 6" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq6.jpg" /><ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما ر = 0، سرعة الأصلي (V 0) هو: </li></ol><img alt="المعادلة 7" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq7.jpg" /><ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واضربتم إصلاح entration من SENP1، وتمت زيادة تركيز CyPet-YPet-(قبل SUMO1) من 100 مرة أكثر من تركيز الانزيم، الذي هو مطلوب من قبل ميكايليس-Menten المعادلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد تم تحليل كل من القراءات الفلورسنت من خلال طريقة التحليل الكمي والحنق المرسومة في البرنامج GraphPad V بريزم لتناسب المعادلة ميكايليس-Menten. ويمكن أيضا الانحدار غير الخطية أن يقوم بمساعدة أكثر حزم البرمجيات الشائعة مثل برامج جداول البيانات (مثل Microsoft Excel). </li></ol> 5. ممثل النتائج يمكن تحديد النضج من قبل SUMO1 من SENP1 عن طريق رصد التغيرات في إشارة مضان في 475 و 530 نانومتر خلال العملية. وأظهرت النتيجة أن سرعة الهضم قبل SUMO1 من SENP1 بطريقة تعتمد الركيزة بالجرعات (الشكل 4). هذا يشير إلى أن المجال الحفاز لSENP1 المعارض النشاط ممتازة لنضوج ما قبل SUMO1 ل. ومفاعل الأوليةتم حساب السرعات نشوئها من التحليل الوارد أعلاه مع تركيزات مختلفة الركيزة (الجدول 1). يستخدم عادة نسبة ك M القط / K لمقارنة كفاءة الإنزيمات المختلفة مع بعضها الركيزة أو إنزيم خاص مع ركائز مختلفة. K M والحد الأقصى V يمكن الحصول عليها من المعادلة ميكايليس-Menten من قبل المتهم بالتآمر في السرعات المختلفة، المقابلة الأولية لتركيزات مختلفة من CyPet-(قبل SUMO1)-YPet (الشكل 5) والتي تم الحصول عليها ك القط على النحو التالي: <img alt="المعادلة 8" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq8.jpg" /> وفقا لتحليل أعلاه، كان يحسب K M 0.21 ± 0.04 ميكرومتر، ك القط كان 6،90 ± 0.28 ق -1، والقط / K M ك نسبة كانت (3.2 ± 0.55) X10 7 M -1 </sup<html> &gt; ق -1. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig1.jpg" /> الشكل 1. رسم بياني لفحص البروتيني الحنق القائم لنضوج ما قبل SUMOs SENP ل. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig2.jpg" /> الشكل 2. التحليل الكمي للإشارة الفلورسنت والمساهمات التي متقبل والجهات المانحة والحنق. تشريح أطياف الانبعاثات من CyPet FL CyPet-(قبل SUMO1)-YPet تحت الإثارة في 414 نانومتر. (530/414) والانبعاثات CyPet لفي 530 نيوتن متر تحت الإثارة من 414 نانومتر، FL الحنق هو الانبعاثات YPet الحنق الناجم في 530 نيوتن متر تحت الإثارة من 414 نانومتر، وFL YPet (530/414) هو الانبعاثات YPet لفي 530 نيوتن متر تحت الإثارة من 414 نانومتر. load/4430/4430fig3.jpg &quot;/&gt; الشكل 3. حساب الانبعاثات الاتجاه α β عامل و. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig4.jpg" /> الشكل 4. تحليل الكمي ل-CyPet YPet-(قبل SUMO1) يهضم بنسب مختلفة من المجال الحفاز لSENP1. تم رصد ردود الفعل داخل 5 دقائق الأولى. <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig5.jpg" /> الشكل 5. ميكايليس Menten تحليل رسومي للهضم CyPet-(قبل SUMO1)-YPet من قبل SENP1. تم التخطيط البيانات وتحليلها من قبل GraphPad بريزم V والانحدار غير الخطية. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> [S] (ميكرومتر) </td><td> V 0 (ميكرون / ثانية) </td></tr><tr><td> 0،115 </td><td> 0.0023 ± 0.00005 </td></tص&gt; <tr><td> 0،214 </td><td> 0.0028 ± 0.00004 </td></tr><tr><td> 0،407 </td><td> 0.0033 ± 0.00007 </td></tr><tr><td> 0،594 </td><td> 0.0037 ± 0.00013 </td></tr><tr><td> 0،725 </td><td> 0.0043 ± 0.00012 </td></tr><tr><td> 1،471 </td><td> 0.0051 ± 0.00036 </td></tr><tr><td> 1،899 </td><td> 0.0050 ± 0.00031 </td></tr><tr><td> 2،300 </td><td> 0.0050 ± 0.00062 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. الأولية السرعات تحديد نضوج ما قبل SUMO1 من قبل SENP1. في كل تركيز الركيزة، واستخدمت أربع عينات لقياس عملية الهضم. جاء الانحراف المعياري من أشكال مختلفة من هذه العينات الأربع. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> K M (ميكرومتر) </td><td> ك القط (ق-1) </td><td> ك القط / ك M (M -1 ق •-1) </td></tr><tr><td> 0.21 ± 0.04 </td><td> 6.90 ± 0.28 </td><td> 3.2 ± 0.55 × 10 7 </td></tr></tbody></table> الجدول 2. المعلمات الحركية من النضج ما قبل SUMO1 من قبل SENP1 من كمية الحنق التحليل. جاء الانحراف المعياري من العينات الأربع في كل تركيز الركيزة.

<ol>
	<li>Johnson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+modification+By+SUMO.">Protein modification By SUMO.</a> Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).</li><li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus:+different+functions,+similar+mechanisms.">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes &amp; Development. 18, 2046-2059 (2004).</li><li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO:+a+history+of+modification.">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).</li><li>M&#252;ller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO,+ubiquitin's+mysterious+cousin.">SUMO, ubiquitin's mysterious cousin.</a> Nature. , 202-210 (2001).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SP-RING+for+SUMO:+new+functions+bloom+for+a+ubiquitin-like+protein.">SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein.</a> Cell. , 5-8 (2001).</li><li>Drag, M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeSUMOylating+enzymes-SENPs.">DeSUMOylating enzymes-SENPs.</a> IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).</li><li>Mukhopadhyay, D., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+in+reverse:+the+SUMO+proteases.">Modification in reverse: the SUMO proteases.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).</li><li>Reverter, D., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+SENP2+protease+interactions+with+SUMO+precursors+and+conjugated+substrates.">Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).</li><li>Shen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+protease+SENP1+induces+isomerization+of+the+scissile+peptide+bond.">SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).</li><li>Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+substrate+for+deubiquitinating+enzymes+based+on+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer+between+terbium+and+yellow+fluorescent+protein.">A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein.</a> Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).</li><li>Mikolajczyk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+Ubiquitin-related+Modifier+(SUMO)-specific+Proteases:+PROFILING+THE+SPECIFICITIES+AND+ACTIVITIES+OF+HUMAN+SENPs.">Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).</li><li>Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distrubition+and+paralogue+specificity+of+mammalian+deSUMOylating+enzymes.">Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes.</a> Biochem. J. , 335-344 (2010).</li><li>Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+profiling+of+human+deSUMOylating+enzymes+(SENPs)+with+synthetic+substrates+suggests+an+unexpected+specificity+of+two+newly+characterized+members+of+the+family.">Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family.</a> Biochemical Journal. 409, 461 (2008).</li><li>Engels, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+assay+for+DEN1+peptidase+activity.">A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity.</a> Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).</li><li>Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-resonance-energy-transfer-based+protease+activity+assay+and+its+use+to+monitor+paralog-specific+small+ubiquitin-like+modifier+processing.">A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing.</a> Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).</li><li>Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+optimization+of+fluorescent+proteins+for+intracellular+FRET.">Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.</a> Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تم استخدام التكنولوجيا الحنق لدراسة ما قبل النضج SUMO1 من قبل SENP1 9. وقد استخدم CFP-YFP حيث يتحرك هذا الزوج الحنق وتحليل ratiometric، والتي هي نسبة انبعاثات متقبل لالمانحة، تم استخدامه لوصف خصائص الحركية. ومع ذلك، لا يوجد أي النظر في الجهات المانحة ومتقبل الذاتي مضان في ratiom...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> PCR الثاني TOPO كيت </td><td> إينفيتروجن </td><td> K466040 </td></tr><tr><td> 2xYT </td><td> البحث منتجات شركة Internationa.l </td><td> X15600 </td></tr><tr><td> ني NTA Agrose </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 88222 </td></tr><tr><td> Coomassie الجمع (برادفورد) ريجنت الفحص </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 23238 </td></tr><tr><td> 384 لوحة جيدا (أسفل الزجاج) </td><td> غرينر </td><td> 781892 </td></tr><tr><td> FlexStation II 384 قارئ لوحة </td><td> الجزيئية الأجهزة </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative fret (f&#246;rster resonance energy transfer) analysis for senp1 protease kinetics determination

وتستخدم على نطاق واسع تعديلات ما بعد النقل عكسها من البروتينات مع البروتينات مثل اليوبيكويتين أو اليوبيكويتين-(Ubls) لتنظيم نشاط حيوي البروتين وأدوار متنوعة في العديد من العمليات البيولوجية. على سبيل المثال، SUMO يعدل تساهميا عدد كبير أو البروتينات مع أدوارا هامة في العديد من العمليات الخلوية، بما في ذلك الخلايا دورة التنظيم وبقاء الخلية والوفاة، استجابة DNA الأضرار، والإجهاد استجابة 1-5. SENP، وSUMO محددة البروتيني، تكون بمثابة ببتيداز داخلية في نضوج السلائف SUMO أو باعتبارها isopeptidase لإزالة SUMO من البروتينات هدفه وتحديث دورة SUMOylation 1،3،6،7. ويتميز كفاءة الحفاز أفضل أو خصوصية انزيم من نسبة الثوابت الحركية، ك القط / M K. في العديد من الدراسات، وقد تم تحديد المعلمات الحركية للSUMO-SENP أزواج بطرق مختلفة، بما في ذلك على أساس هلام بولكرلميد الغربي صمة عار، رادioactive التي تحمل علامات المسمى الركيزة، مجمع الفلورسنت أو البروتين الركيزة 8-13. ومع ذلك، فإن تقنيات بولكرلميد هلام القائم، والتي تستخدم في &quot;الأم&quot; هي بروتينات ولكن شاقة وتطالب من الناحية الفنية، التي لا تخضع بسهولة لأنفسهم التحليل الكمي مفصلة. وحصلت ك القط / M K من الدراسات التي تستخدم tetrapeptides أو البروتينات مع ACC (7-الأمينية-4-carbamoylmetylcoumarin) أو AMC (7-الأمينية-4-methylcoumarin) fluorophore إما يصل الى اثنين من أوامر من حجم أقل من ركائز الطبيعية أو لا يمكن التمييز بوضوح على شهادة الأيزو والأنشطة ببتيداز داخلية من SENPs. واستخدمت مؤخرا فحوصات البروتيني، الحنق القائم على دراسة الأنزيمات deubiquitinating (يصف) أو SENPs مع الزوج الحنق من بروتين فلوري سماوي (CFP) وبروتين فلوري الصفراء (YFP) 9،10،14،15. تم استخدام نسبة الانبعاثات إلى الانبعاثات متقبل المانحة كمعلمة الكمية لرصد الحنق إشارة لميلان البروتينيtivity المصير. ومع ذلك، تجاهل هذا الأسلوب إشارة عبر التلوث ومتقبل في موجات من الانبعاثات المانحة ومتقبل المانحة الذاتي مضان وبالتالي لم يكن دقيقا. وضعنا رواية شديدة الحساسية والكمية الفحص البروتيني الحنق القائم لتحديد معالم الحركية في مرحلة ما قبل النضج SUMO1 من SENP1. وهندسيا الحنق CyPet الزوج وYPet بكفاءة الحنق تحسنت بشكل ملحوظ ومضان العائد الكم، واستخدمت لتوليد CyPet-(قبل SUMO1)-YPet الركيزة 16. نحن متباينة وكميا إشارات مضان المطلقة ساهمت من قبل الجهة المانحة ومتقبل والحنق على موجات متقبل والانبعاثات على التوالي. تم الحصول على قيمة القط ك / M K ك (3.2 ± 0.55) X10 7 M -1 ق -1 من SENP1 نحو SUMO1 المسبق، وهو ما يتفق مع المعايير العامة الحركية الأنزيمية. لذلك، هذه المنهجية صالحة ويمكن استخدامSA النهج العام لتوصيف البروتياز الأخرى كذلك.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative FRET FÃ¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination at JoVE.com

Quantitative FRET F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

يوصف أسلوب الرواية التي تنطوي على التحليل الكمي من الحنق (فورستر نقل الطاقة الرنين) إشارات لدراسة حركية الانزيم.<em&gt; K<sub&gt; M</sub</em&gt; و<em&gt; ك<sub&gt; القط</sub</emتم الحصول على&gt; لفي المجال المائي الحفاز SENP1 (سومو / Sentrin البروتيني محددة 1) إلى ما قبل SUMO1 (صغير اليوبيكويتين مثل التعديل). ويمكن تطبيق المبادئ العامة لهذه الدراسة البروتيني الحركية الكمية-الحنق القائم على البروتياز الأخرى.

الكمية الحنق (فورستر نقل الطاقة الرنين) تحليل لتحديد حركية SENP1 البروتياز

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

quantitative-fret-frster-resonance-energy-transfer-analysis-for-senp1

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Bioengineering

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Unit 1

Work and Kinetic Energy

SCIENTISTS IN ACTION

18.9K Views.  University of California, Riverside. يوصف أسلوب الرواية التي تنطوي على التحليل الكمي من الحنق (فورستر نقل الطاقة الرنين) إشارات لدراسة حركية الانزيم. K M

Video: Quantitative FRET F&#246;rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated micro-plates. Under these conditions, cells spread and divide in all directions resulting in an inherent variability in cell shape, morphology and behavior. The high cell-to-cell variance of the overall population impedes the success of HCA, especially for drug development. The ability of micropatterns to normalize the shape and internal polarity of every individual cell provides a tremendous opportunity for solving this critical bottleneck 1-2.
To facilitate access and use of the micropatterning technology, CYTOO has developed a range of ready to use micropatterns, available in coverslip and microwell formats. In this video article, we provide detailed protocols of all the procedures from cell seeding on CYTOOchip micropatterns, drug treatment, fixation and staining to automated acquisition, automated image processing and final data analysis. With this example, we illustrate how micropatterns can facilitate cell-based assays. Alterations of the cell cytoskeleton are difficult to quantify in cells cultured on homogenous substrates, but culturing cells on micropatterns results in a reproducible organization of the actin meshwork due to systematic positioning of the cell adhesion contacts in every cell. Such normalization of the intracellular architecture allows quantification of even small effects on the actin cytoskeleton as demonstrated in these set of protocols using blebbistatin, an inhibitor of the actin-myosin interaction.

Adhesive micropatterns that normalize cellular architecture can be used to increase sensitivity in the detection of drug effects, improve reproducibility and simplify automated image acquisition and analysis. Such technology will benefit drug/siRNA screening assays, performed on conventional cell culture supports and consequently suffering from excessive cell-to-cell variability.

تحسن التصور والتحليل الكمي لتأثيرات الدواء باستخدام خلايا Micropatterned

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

التصاق الفحص عن التردد في الموقع تحليل حركية عبر صلي التفاعلات الجزيئية في خلية واجهة سيل

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans&#039; Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

انجذاب كهربي المستندة ميكروفلويديك للتحليل الكمي بناء على الطلب<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; &#39;تنقل

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

المخدرات التي يسببها-توعية انزيمات محلقة: تبسيط الفحص والتصغير لجزيء صغير وسيرنا تطبيقات الفحص

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

نقل التلألؤ الرنين الطاقة لدراسة التغييرات بتكوين جزئي في غشاء البروتينات أعرب في خلايا الثدييات

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

قياس TCR-PMHC التجليد<em&gt; في الموقع</em&gt; باستخدام الميكروسكوب الفحص القائم على الحنق

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as &#945;-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

كشف حساسية Proteopathic البذر آخر مع الحنق التدفق الخلوي

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

متعدد الألوان كشف الإسفار عن القطرة على microfluidics عن طريق الألياف البصرية

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

بروتوكول لعن طريق نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق) أجهزة الاستشعار لقياس -Force القوات الميكانيكية عبر مجمع ينك النووية

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

الاعتراف الجزيئية والهندسة مع البوليمرات الحيوية المحاكاة على واحدة المسورة الكربون الأنابيب النانومترية

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...