فإن الكتاب أود أن أنوه السيد ريتشارد زنك وتود Wiernicki للتدريب والتوجيه المنهجي الفحص. نشكر أيضا يوحنا بولس سبنس لقراءة متأنية والاقتراحات التحرير. وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة MH 060397، الدماغ والسلوك مؤسسة البحوث، وايلي ليللي وشركة من خلال برنامج جائزة بحوث ليللي (LRAP).

1. التوسع والحفظ بالتبريد من الخلايا الفحص جاهز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة CHO-K1-DRD 2L (CHO-D 2L) الخلايا على طبق خلية ثقافة 15 سم 2 في وسائل الإعلام F12 هام لتستكمل مع 1.0 ميكرومتر L-الجلوتامين، 800 ميكروغرام / ميكرولتر G418، 300 ميكروغرام / هيغروميسين ميكرولتر، 100 ش / ميكرولتر البنسلين، 100 ميكروغرام / ميكرولتر الستربتوميسين، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2 حتى الخلايا هي 90-95٪ متموجة. غسل الخلايا مع 10 ميكرولتر الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وحصاد الخلايا عن طريق إضافة 3 ميكرولتر من العازلة تفارق خلية لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. resuspend الخلايا باستخدام 12 ميكرولتر من وسائل الإعلام والثقافة، والاعتماد استبعاد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي تعليق خلية في 500 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح في وطاف resuspend الكرية خلية في 5 ميكرولتر من وسائل الإعلام تجميد (10٪ ميثيل سلفوكسيد، 90٪ FBS). تمييع تعليق خلية لتحقيق تركيز الخلية المطلوبة (على سبيل المثال 1-20 × 10 6 خلية / ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 1.0 ميكرولتر من محلول الخلية إلى كل cryovial. احتضان cryovials في حاوية تجميد الخلايا في -80 درجة مئوية خلال الليل. نقل cryovials إلى السائل N 2 خزان للتخزين على المدى الطويل. </li></ol> 2. طلي الفحص خلايا جاهزة (وعكس ترنسفكأيشن الخيار) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد بسرعة على cryovial المجمدة من الخلايا في 37 درجة مئوية حمام الماء. حالما يتم إذابة الخلايا، ونقل الخلايا إلى 15 ميكرولتر المخروطية أنبوب يحتوي على 9 ميكرولتر من غروب-MEM، وتخلط بواسطة قلب الأنبوب 3-5X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في 500 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح في وطاف resuspend الخلايا في 1 ميكرولتر غروب MEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق الاستبعاد لتحديد بقاء الخلية وتمييع الخلايا قادرة على البقاء عند الضرورة (على سبيل المثال. 3 × 10 5 خلية / تركيز ميكرولتر) فيالأمثل-MEM. لوحة 10 ميكرولتر / جيد من الخلايا في نسيج الثقافة تعامل وحة 384 جيدا باستخدام ماصة الأقنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل التخفيفات المسلسل من المخيم في غروب MEM لتوليد منحنى القياسية لتقدير الإنتاج المخيم من قبل خلايا (وفقا لتوصيات بتصنيع - انظر القسم 7). إضافة 10 ميكرولتر / جيد من معايير المخيم إلى لوحة ملاحظة: منحنى معيار واحد يمكن أن يكون مستعدا على لوحة منفصلة أو الآبار فارغة في واحدة من لوحات مقايسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة، واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2 لمدة 1 ساعة. </li></ol> 3. عكس سيرنا ترنسفكأيشن الخيار * هذا القسم هو اختياري وذات الصلة إلى الشكل 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل سيرنا في DDH ريبونوكلياز خالية 2 O (على سبيل المثال 0.4 بمول / ميكرولتر). إضافة 5 ميكرولتر من الآبار الفردية لوحة 384 جيدا، وأجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 حد ذاتهج في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع Lipofectamine عام 2000 في غروب MEM بمعامل 0.006 (على سبيل المثال إضافة 6 ميكرولتر من Lipofectamine 2000 إلى 1،000 ميكرولتر من غروب-MEM)، ومزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الحل Lipofectamine 2000/Opti-MEM لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة 5 ميكرولتر من المخفف حل Lipofectamine 2000/Opti-MEM إلى الآبار الفردية لوحة 384 جيدا الذي يحتوي بالفعل سيرنا. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة فحص الخلايا على استعداد كما هو موضح أعلاه (القسم 2). أجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة إلى لوحة فحص حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية (5٪ CO 2) ل48-96 ساعة كما هو محدد لاستهداف الجينات نهدم (انظر المناقشة). </li></ol> 4. فحص جزيء صغير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يخفف من المخدرات من اهتمام (مثبطات على سبيل المثال. جزيء صغير) في غروب-MEM إلى 6X تركيزات النهائي المنشود. التخفيفات التسلسلي يمكن أن تكتمل باستخدام ماصات باليد أو محطة مناولة السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2.5 ميكرولتر / جيد للمجمع اختبار أو العازلة التي تحتوي على المركبات (مثل DMSO) إلى جانب الآبار باستخدام ماصة الأقنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة (الحضانة اختياري). </li></ol> 5. استمرار العلاج ناهض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 600 نانومتر (أي 6 أضعاف التركيز النهائي المطلوب من 100 نانومتر) حل quinpirole في غروب MEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2.5 ميكرولتر / جيد من حل نانومتر 600 quinpirole إلى جانب الآبار باستخدام ماصة الأقنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة، واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2 لمدة 2 ساعة. </li></ol> 6. التحفيز مخيم تراكم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء الحضانة 2 ساعة، وإعداد stimulatiعلى الحل في غروب MEM. ويتألف الحل التحفيز من 40 ميكرومتر forskolin، 2 ميكرومتر الاستيوفينون 3-1-methyxanthine (IBMX)، و 4 ميكرومتر سبيبيرون (جميع التركيزات في الخطوة 6 و4X تركيز النهائي المطلوب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرولتر / جيد من الحل التحفيز إلى جانب الآبار باستخدام ماصة الأقنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. </li></ol> 7. تبريد وتقدير من المخيم تراكم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قياس الإنتاج من المخيم من قبل الخلايا باستخدام المخيم ديناميكية 2 عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. لفترة وجيزة، إعادة المضادة للمعسكر ومعسكر cryptate-D2 في الماء المقطر. تجميد aliquots في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى القصير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع قسامة واحدة المضادة للمعسكر cryptate وقسامة واحدة من المخيم-D2 بشكل منفصل في تحلل العازلة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لجعل حلول العمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aي 10 ميكرولتر / جيد من حل العاملة المضادة للمعسكر cryptate و 10 ميكرولتر / جيد من الحل العمل المخيم-D2 إلى لوحة 384 جيدا باستخدام ماصة الأقنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحة في 100 x ج لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة في لوحة قارئ لوحة مضان (إعداد مقياس للحساسية السيارات) باستخدام الإثارة من 337 نانومتر، وقياس الانبعاثات في 620 نانومتر و 665 نانومتر في المصنوعات التعليمات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق تحليل ratiometric لتقييم منحنى القياسية في المخيم بتصنيع التعليمات. باستخدام القيم الناتجة، استقراء تراكم المخيم المقدر في آبار اختبار باستخدام برمجيات تحليل البيانات. </li></ol>

<ol>
	<li>Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+of+adenylate+cyclase+accounts+for+narcotic+dependence+and+tolerance.">Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).</li><li>Watts, V. J., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitization+of+adenylate+cyclase+by+Galpha(i/o)-coupled+receptors.">Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors.</a> Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).</li><li>Christie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+neuroadaptations+to+chronic+opioids:+tolerance,+withdrawal+and+addiction.">Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction.</a> Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).</li><li>Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+AGS3+during+morphine+withdrawal+promotes+cAMP+superactivation+via+adenylyl+cyclase+5+and+7+in+rat+nucleus+accumbens/striatal+neurons.">Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons.</a> Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).</li><li>Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=m-Opioid+receptor+desensitization+by+&#946;-arrestin-2+determines+morphine+tolerance+but+not+dependence.">m-Opioid receptor desensitization by &#946;-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence.</a> Nature. 408, 720-723 (2000).</li><li>Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+long-term+plasticity+underlying+addiction.">Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction.</a> Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).</li><li>Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opiate-induced+adenylyl+cyclase+superactivation+is+isozyme-specific.">Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific.</a> J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).</li><li>Sadana, R., Dessauer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+for+G+protein-regulated+adenylyl+cyclase+isoforms:+insights+from+knockout+and+overexpression+studies.">Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies.</a> Neurosignals. 17, 5-22 (2009).</li><li>Kim, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenylyl+cyclase+type+5+(AC5)+is+an+essential+mediator+of+morphine+action.">Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).</li><li>Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenylyl+cyclase+isoforms+as+novel+therapeutic+targets:+an+exciting+example+of+excitotoxicity+neuroprotection.">Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection.</a> Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).</li><li>Beazely, M. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+properties+of+adenylate+cyclases+type+5+and+6:+A+progress+report.">Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report.</a> Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).</li><li>Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J., Siehler, S., Milligan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10.">Chapter 10.</a> Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. 10, 189-217 (2010).</li><li>Lin, Y., Smrcka, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+molecular+recognition+by+G+protein+betagamma+subunits+on+the+path+to+pharmacological+targeting.">Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting.</a> Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).</li><li>Cumbay, M. G., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+sensitization+of+recombinant+adenylate+cyclases+by+activation+of+D2+dopamine+receptors.">Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).</li><li>Watts, V. J., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitization+of+endogenous+and+recombinant+adenylate+cyclase+by+activation+of+D2+dopamine+receptors.">Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors.</a> Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).</li><li>Nevo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adenylyl+cyclase+isozymes+on+acute+and+chronic+activation+of+inhibitory+receptors.">Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors.</a> Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).</li><li>Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+activation+of+the+m-opioid+receptor+with+the+endogenous+ligand+endomorphin+differentially+regulates+adenylyl+cyclase+isozymes.">Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes.</a> Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).</li><li>Beazely, M. A., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+a+novel+PKC+isoform+synergistically+enhances+D2L+dopamine+receptor-mediated+sensitization+of+adenylate+cyclase+type+6.">Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6.</a> Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).</li><li>Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+molecular+tools+to+dissect+the+role+of+Gs+in+sensitization+of+AC1.">Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1.</a> Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).</li><li>Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D2+receptor-induced+heterologous+sensitization+of+adenylyl+cyclase+requires+Gas:+Characterization+of+Gas-insensitive+mutants+of+adenylyl+cyclase+V.">Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V.</a> Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).</li><li>Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D(2)+Receptor-Mediated+Heterologous+Sensitization+of+AC5+Requires+Signalosome+Assembly.">Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly.</a> J. Signal Transduct. 2012, 210324 (2012).</li><li>Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+sensitization+of+adenylate+cyclase+is+protein+kinase+A-dependent+in+Cath.a+differentiated+(CAD)-D2L+cells.">Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells.</a> J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+adenylyl+cyclase+inhibitor+for+treating+neuropathic+and+inflammatory+pain.">Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain.</a> Sci. Transl. Med. 3, 65ra3 (2011).</li><li>Nordstedt, C., Fredholm, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modification+of+a+protein-binding+method+for+rapid+quantification+of+cAMP+in+cell-culture+supernatants+and+body+fluid.">A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid.</a> Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).</li><li>Xia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+morphine-induced+cAMP+overshoot:+a+cell-based+assay+model+in+a+high-throughput+format.">Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).</li><li>Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+cells+facilitate+cell-based+drug+discovery.">Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).</li><li>Varga, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adenylyl+cyclase+isoenzymes+in+CHO+and+B82+cells.">Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells.</a> Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).</li><li>Masri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+of+dopamine+D2+receptor/beta-arrestin+2+interaction+is+a+common+property+of+clinically+effective+antipsychotics.">Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).</li><li>Thaker, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+glioblastoma+multiforme+through+short+interfering+RNA+screening:+a+paradigm+for+therapeutic+development.">Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development.</a> Neurosurg. Focus. 28, E4 (2010).</li><li>Echeverri, C. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+RNAi+screening+in+cultured+cells:+a+user's+guide.">High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide.</a> Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Ejendal, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+antagonists+of+tick+dopamine+receptors+via+chemical+library+screening+and+comparative+pharmacological+analyses.">Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).</li><li>Meyer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"genome-to-lead"+approach+for+insecticide+discovery:+pharmacological+characterization+and+screening+of+Aedes+aegypti+D(1)-like+dopamine+receptors.">A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors.</a> PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478 (2012).</li><li>Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+insights+into+firefly+luciferase+and+other+bioluminescent+reporters+used+in+chemical+biology.">Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology.</a> Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).</li><li>Fan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+genetically+encoded+biosensors+using+firefly+luciferase.">Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase.</a> ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).</li><li>Jiang, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+cAMP+BRET+sensor+to+characterize+a+novel+regulation+of+cAMP+by+the+sphingosine+1-phosphate/G13+pathway.">Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway.</a> J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

في محاولة لتسهيل الدراسات التوعية مغاير، ونحن قد عدلت على نطاق واسع لدينا وسيلة مبسطة السابقة تحقيق &quot;مزيج وقراءة&quot; شكل غير قابلة للتعديل لالفرز الفائق الإنتاجية وآلية الفحص العمل. التعديلات الرئيسية لبروتوكول لدينا يمكن تلخيصها على النحو التالي: 1) استخدام الخل?...

تم اكتشاف أدينيليل محلقة التكيفية (AC) إشارة استجابة المعروفة باسم مغاير أو فائقة توعية الأولى في مختبر الحائز على جائزة نوبل، والدكتور مارشال Nirenberg. اقترح الدكتور Nirenberg أن زيادة الاستجابة AC لاحظ التالية تنشيط مستقبلات المواد الأفيونية δ المزمنة كانت آلية المشاركة في التسامح الأفيونية والاعتماد 1. بالإضافة إلى تنشيط مستقبلات المواد الأفيونية δ المزمن، يحدث هذا الرد neuroadaptive من AC يشير أيضا التالية تنشيط دائم لعدة Gαi / س يقترن مستقبلات أخرى 2. والجدير بالذكر أن العديد من هذه المستقبلات المقترنة مع الألم، والاضطرابات العصبية والنفسية والعصبية، وتشمل المواد الأفيونية μ / κ، D 2/4 الدوبامين، 5HT 1A، وM 2/4 مستقبلات المسكارينية 2. بالإضافة إلى النتائج د. Nirenberg، ومجموعة كبيرة من الأدلة التي تربط موجود توعية AC يشير إلى تنشيط مستقبلات المواد الأفيونية المزمنة على حد سواء <eم&gt; في المختبر والمجراة 3-7. كما تم المرتبطة توعية AC مع مجموعة متنوعة من الأمراض التي تنطوي على مستقبلات الدوبامين D 2 مثل بما في ذلك الفصام ومرض باركنسون (للمراجعة أنظر المرجع 2). على الرغم من الأهمية المحتملة للتوعية، وآلية دقيقة (ق) المرتبطة المستمرة Gαi / س يقترن تنشيط مستقبلات التي تؤدي إلى زيادة لا تزال مجهولة إلى حد كبير استجابة AC. توفر هذه الدراسات الأساس المنطقي لدراسة آليات لتوعية أدينيليل محلقة كهدف مهم العصبية الحيوية. وبالمثل، ينبغي أيضا الاعتراف أهمية الفسيولوجية للAC إشارة 8 وأهمية أن عقد الأشكال الإسوية AC الفردية في هذه الاستجابة التكيفية 2،9،10. في سياق بحثنا، الملامح العامة المرتبطة توعية مغاير من الأشكال الإسوية المؤتلف من AC موازية تلك الخصائص قصرcribed لدراسة الأشكال الإسوية الذاتية للAC. على وجه التحديد، وقد وجدت الأبحاث السابقة أن تفعيل بروتينات Gαi / س ومفارز إطلاق اللاحقة / إعادة ترتيب βγ هي المتطلبات الهامة للمستقبلات التي يسببها توعية جميع الأشكال الإسوية AC. بالإضافة إلى ذلك، تشير العديد من الدراسات أن يشير من تحركات البروتينات ومفارز Gβγ يشاركون في التوعية 2،11-13. أيضا عرض التكييف الفردية أنماط فريدة من نوعها ومتميزة توعية 12. على سبيل المثال، يرتبط التعرض المستمر للمستقبلات D 2 لمنبهات مع توعية AC1 وAC8 لكا 2 + / كالمودولين التحفيز 14،15، في حين لم يتم توعيتهم على AC3 وثيقة الصلة 2. ترتبط AC2، AC4، وAC7 عن كثب، ومع ذلك، يتم توعيتهم فقط النشاط AC2 حفز PKC-بقوة بعد التعرض لفترة طويلة من مستقبلات D 2 إلى ناهضات 7،14،16،17. بالإضافة إلى ذلك، AC5 وAC6 تظهر درجة ملحوظة من شاذ؛ غير سويتوعية ologous إلى الغاز وحفز forskolin تراكم المخيم التالية تفعيل مستقبلات D 2 14،18-20، ولكن يبدو أن تختلف في ما يتطلبه Gβγ الوحيدات-AC التفاعلات 21. على الرغم من أن معظم الدراسات من AC توعية استخدمت خطوط الخلايا نموذج (مثل الخلايا HEK293 التعبير عن الأشكال الإسوية AC الفردية)، يبدو أن هذه النتائج تترجم إلى نماذج الخلايا العصبية الأصلي 4،22. في الآونة الأخيرة، وآثار AC الإسوي مثبطات جزيء صغير المحددة في الخلايا HEK293 التعبير عن الأشكال الإسوية AC يمكن أيضا أن تترجم إليها في الدراسات المجراة السلوكية 23. من المرجح يعكس عدم وجود آلية الجزيئية التي تم تحديدها لتوعية مغاير تعقيد استجابة تكيفية وكذلك خصائص تنظيمية فريدة من نوعها للفرد AC الأشكال الإسوية 12. كشف هذه الدرجة من التعقيد يزداد تعقيدا من خلال استخدام منهجية مرهقة رقبعة محدودة المحققين الأكاديمية من استخدام نهج غير متحيز. على سبيل المثال، تشارك دراساتنا السابقة الآلي استخدام النماذج الخلوية مثقف باستمرار باستخدام 24 - و 48 جيدا زراعة الأنسجة شكل 15. وعادة ما نمت الخلايا المستزرعة لمدة 48 ساعة ثم تعرض لمعاملة المخدرات ناهض (2-18 ساعة)، يليه سلسلة من يغسل الخلايا وحضانات (الشكل 1). كان المخيم محددة بروتوكولات تراكم AC-الإسوي ثم يعمل تليها قياس تراكم المخيم باستخدام شاقة وتستغرق وقتا طويلا [3 H] المخيم منهجية 15،24 ملزمة. مدة من البداية الى النهاية لكل مقايسة مطلوب عموما ما مجموعه أربعة إلى خمسة أيام من الطلاء الخلية لتحليل البيانات (الشكل 1). وقد أدى تطبيق التكنولوجيات الجديدة والأتمتة إلى تحسينات ملحوظة للدراسات التوعية في الإعداد الصناعية ومركز HTS. على سبيل المثال، مجموعة العمل مع المركز الوطني للكيمىذكرت كال الجينوم اثنين يوم HTS إجراء فحص لتحديد جزيء صغير مثبطات مستقبلات المواد الأفيونية من μ يسببها التوعية في 1،536 جيدا شكل 25. ويصف هذه المادة جهودنا لتطوير مقايسة HTS للدراسات توعية مغاير باستخدام التكنولوجيات المتوفرة في معظم المؤسسات البحثية الأكاديمية. تم إنجاز هذه الاستراتيجية من خلال دمج استخدام الخلايا cryopreserved من نماذج الخلايا معربا عن heterologously على مستقبلات الدوبامين D 2 في تركيبة مع الذاتية الفردية أو المؤتلف الأشكال الإسوية أدينيليل محلقة (CHO-D-2L أو كلوة الجنين البشري AC6 / D 2 L). لتحسين الإنتاجية لدينا، ونحن لدينا 48 إعادة تصميم جيدا مقايسة توعية (حوالي&gt; 20 خطوات أكثر من 4-5 أيام) إلى خمس خطوات، مقايسة يوم واحد في شكل 384-جيدا أن كان أساسا &quot;خلط وقراءة&quot;. يستخدم الشكل الجديد وقت متجانسة المتاحة تجاريا حل مضان (HTRF) فحص لقياس المخيم وفقumulation في خلايا سليمة مع لوحة متعددة وضع القارئ. مقايسة قوية وقابلة للفحص جزيء صغير، ويمكن تطبيقها على نحو فعال للكشف عن مثبطات للتوعية مغاير. بالإضافة إلى ذلك، نحن نقدم البيانات التي يسمح استخدام هذا الاختبار مع ترنسفكأيشن عكس سيرنا لاستهداف أو الجينوم واسعة الفرز مكتبة سيرنا فقط مع تعديل طفيف على النهج العام.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">CHO-K1-DRD2L cells</td>
			<td style="width:144px;">DiscoveRx</td>
			<td style="width:148px;">930579C2</td>
			<td style="width:199px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Ham&#8217;s F12 media</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;">SH30026fs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;">SH3007003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">G418</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:144px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">50-230-5556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Penicillin/ streptomycin</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">15 cm dishes</td>
			<td style="width:144px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:148px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">DMSO</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Cell dissociation buffer</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">13150016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">10010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Cryovials</td>
			<td style="width:144px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">976171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">TC treated 384 well plates</td>
			<td style="width:144px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:148px;">6007688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:205px;">HTRF cAMP Dynamic 2 kit</td>
			<td style="width:144px;">Cisbio Bioassays</td>
			<td style="width:148px;">62AM4PEB</td>
			<td style="width:199px;">http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Synergy 4</td>
			<td style="width:144px;">Biotek</td>
			<td style="width:148px;">H4MLFPTAD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Prism 6</td>
			<td style="width:144px;">GraphPad Software</td>
			<td style="width:148px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">(&#177;)Quinpirole</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">Q111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Spiperone</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">S7395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Clozapine</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">C6305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Haloperidol</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">H1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">S-(-)Sulpiride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">S112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:205px;">Lipofectamine2000 transfection reagent</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:148px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:148px;">T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Water, DNase, RNase-free</td>
			<td style="width:144px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:148px;">821739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Gas siRNA</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">custom siRNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Non-targeting siRNA control</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">D-001206-14-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">siGlo Red</td>
			<td style="width:144px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:148px;">D-001630-02</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drug-induced sensitization of adenylyl cyclase: assay streamlining and miniaturization for small molecule and sirna screening applications

وقد تورط توعية أدينيليل محلقة (AC) إشارات في مجموعة متنوعة من الاضطرابات العصبية والنفسية والعصبية بما في ذلك تعاطي المخدرات ومرض الشلل الرعاش. تفعيل الحاد في Gαi / المستقبلات المرتبطة س يثبط النشاط AC، بينما تنشيط دائم لهذه النتائج المستقبلات في توعية مغاير من AC وزيادة مستويات مخيم داخل الخلايا. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن هذا تعزيز الاستجابة AC لوحظ سواء في المختبر والمجراة عقب تفعيل المزمن من عدة أنواع من المستقبلات Gαi / س مرتبطة بما في ذلك مد 2 الدوبامين وμ مستقبلات المواد الأفيونية. على الرغم من أن أفيد غيري من التوعية AC للمرة الأولى منذ أربعة عقود، آلية (ق) التي تكمن وراء هذه الظاهرة لا تزال مجهولة إلى حد كبير. عدم وجود بيانات الآلية يعكس يفترض أن التعقيد مع هذا الرد على التكيف، مما يشير إلى أن النهج nonbiased يمكن أن تساعد في تحديدجي المسارات الجزيئية المشاركة في توعية مغاير من AC. وقد تورط الدراسات السابقة كيناز وGbγ إشارات على أنها متداخلة المكونات التي تنظم توعية مغاير من AC. لتحديد أهداف إضافية فريدة ومتداخلة المرتبطة توعية AC، مطلوب تطوير والتحقق من صحة قابلة للمقايسة المخيم توعية لزيادة الإنتاجية. النهج السابقة لدراسة توعية عموما مرهقة تنطوي على خلية المستمر الصيانة الثقافة وكذلك منهجية معقدة لقياس تراكم المخيم الذي ينطوي على خطوات غسل متعددة. وبالتالي، فإن تطوير فحص خلية مقرها قوية والتي يمكن استخدامها لفحص إنتاجية عالية (HTS) في شكل جيد 384 تسهيل الدراسات المستقبلية. باستخدام اثنين من مستقبلات الدوبامين D 2 نماذج الخلوية (أي. CHO-D-2L وكلوة الجنين البشري AC6 / D 2L)، ونحن لدينا فحص وتحويلها توعية 48 جيدا (&gt; 20 الخطوات 4-5 أيام) إلى خمسة لياليTEP، مقايسة يوم واحد في شكل 384 جيدا. هذا الشكل الجديد هو قابل للفحص جزيء صغير، وعلينا أن نبرهن على هذا التصميم الفحص يمكن أيضا أن تستخدم بسهولة لترنسفكأيشن سيرنا عكس تحسبا لاستهداف الفرز مكتبة سيرنا.

الجزء الأول تطوير 384 التوعية مغاير كذلك فحص لتحديد مثبطات جزيء صغير باستخدام نموذج الخلية متاحة تجاريا. لدراسة توعية مغاير في نموذج الخلية، التي قطعناها على أنفسنا عددا من التحسينات التي مكنتنا من تبسيط الفحص إلى &quot;خل?...

Watch this Scientific Journal Video about Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications at JoVE.com

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

تنشيط دائم لG-البروتين يقترن مستقبلات نتائج المثبطة في توعية أدينيليل محلقة الإشارة. لتحديد المسارات الجزيئية الأساسية، ونهج nonbiased ضرورية، ولكن هذا يتطلب استراتيجية تطوير خلية مقرها قابلة المخيم توعية الفحص. هنا، نحن تصف مقايسة لتوعية جزيء صغير وسيرنا الفرز.

المخدرات التي يسببها-توعية انزيمات محلقة: تبسيط الفحص والتصغير لجزيء صغير وسيرنا تطبيقات الفحص

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

drug-induced-sensitization-adenylyl-cyclase-assay-streamlining

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.6K Views.  Purdue University.  تنشيط دائم لG-البروتين يقترن مستقبلات نتائج المثبطة في توعية أدينيليل محلقة الإشارة. لتحديد المسارات الجزيئية الأساسية، ونهج nonbiased ضرورية، ولكن هذا يتطلب استراتيجية تطوير خلية مقرها قابلة المخيم توعية الفحص. هنا، نحن تصف مقايسة لتوعية جز?...

Video: Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

الخلية المستندة إلى الفحص الكالسيوم لمتوسطة إلى فحص وظائف إنتاجية عالية باستخدام قناة الحزب FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

النطاق العريض للكشف عن الموجات فوق الصوتية البصرية للتطبيقات التصوير الطبي

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

مسامية السيليكون المجهرية الدقيقة لتسليم سيرنا التداوي

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

A السريع والكمية Fluorimetric طريقة لاستهداف البروتين جزيء صغير فحص المخدرات

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

تصنيع ميكانيكيا الانضباطي والحيويه المعادن سقالات للتطبيقات الطبية الحيوية

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

تشكيل الضوء بوساطة والزخرفة من الهلاميات المائية للتطبيقات خلية ثقافة

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin exine capsules (SECs) are obtained when spores or pollen are processed so as to remove the internal sporoplasmic contents. The resulting hollow microcapsules exhibit a high degree of micromeritic uniformity and retain intricate microstructural features related to the particular plant species. Herein, we demonstrate a streamlined process for the production of SECs from Lycopodium clavatum spores and for the loading of hydrophilic compounds into these SECs. The current SEC isolation procedure has been recently optimized to significantly reduce the processing requirements which are conventionally used in SEC isolation, and to ensure the production of intact microcapsules. Natural L. clavatum spores are defatted with acetone, treated with phosphoric acid, and extensively washed to remove sporoplasmic contents. After acetone defatting, a single processing step using 85% phosphoric acid has been shown to remove all sporoplasmic contents. By limiting the acid processing time to 30 hr, it is possible to isolate clean SECs and avoid SEC fracturing, which has been shown to occur with prolonged processing time. Extensive washing with water, dilute acids, dilute bases, and solvents ensures that all sporoplasmic material and chemical residues are adequately removed. The vacuum loading technique is utilized to load a model protein (Bovine Serum Albumin) as a representative hydrophilic compound. Vacuum loading provides a simple technique to load various compounds without the need for harsh solvents or undesirable chemicals which are often required in other microencapsulation protocols. Based on these isolation and loading protocols, SECs provide a promising material for use in a diverse range of microencapsulation applications, such as, therapeutics, foods, cosmetics, and personal care products.

This protocol/manuscript describes a streamlined process for the production of sporopollenin exine capsules (SECs) from Lycopodium clavatum spores and for the loading of hydrophilic compounds into these SECs.

كبسولات المستندة إلى مصنع استخراج للتطبيقات الكبسلة

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well as large-scale high-throughput screening (HTS) campaigns. Though laboratory automation has greatly increased the utility of microplates there remain instances where automation-based instrumentation is not feasible, cost-effective or compatible with microplate formatting needs. In these cases, microplates must be manually prepared. Problematic to manual microplate manipulations is that a number of difficulties can arise pertaining to the accurate tracking of sample operations, data record keeping and quality control (QC) inspection for well artifacts or formatting errors. As microplate well densities increase (i.e., 96-well, 384-well, 1536-well) the potential for introducing errors also drastically increases.&#160; Moreover, for small bench-top laboratory operations there exists a need to improve the ease and accuracy of sample handling in a cost-effective fashion. Herein, we describe a system that acts as a semi-automated pipetting guide referred to as the Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.). &#160;M.A.P.L.E. has multiple uses for supporting compound hit-picking and microplate preparation for assay development in high-throughput screening or laboratory benchtop operations, as well as QC/quality assurance (QA) diagnostic evaluation of microplate quality or visualizing well formatting errors.

Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.) is a computer-driven device that systematically illuminates microtiter wells to provide guidance for the manual preparation of microplates.&#160; M.A.P.L.E. improves the accuracy of microplate preparation while automating data recordkeeping. &#160;In addition, it can assist with examining microplate quality or aid in the detection of errors.&#160; &#160;

تطبيقات للواح الاضاءه المتوافقة مع اللوحة المفتوحة المصدر

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various biological activities including cell proliferation, survival, migration and differentiation. Several aberrations in the FGFR signaling pathway, owing to mutations or gene amplification events, have been identified in various types of cancers. Hence, recent research has focused on developing strategies involving therapeutic targeting of FGFRs. Current FGFR inhibitors at various stages of pre-clinical and clinical development include either small molecule inhibitors of tyrosine kinases or monoclonal antibodies, with only a few peptide- based inhibitors in the pipeline. Here, we provide a protocol using phage display technology to screen small peptides as antagonists of FGFR2. Briefly, a library of phage-displayed peptides was incubated in a plate coated with FGFR2. Subsequently, unbound phage was washed off by TBST (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20), and bound phage was eluted with 0.2 M glycine-HCl buffer (pH 2.2). The eluted phage was further amplified and used as input for the next round of biopanning. Following three rounds of biopanning, the peptide sequences of individual phage clones were identified by DNA sequencing. Finally, the screened peptides were synthesized and analyzed for affinity and biological activity.

Herein, we present a detailed protocol for screening small peptides that bind to FGFR2 using a phage display peptide library. We further analyze the affinity of the selected peptides toward FGFR2 in vitro and its ability to suppress cell proliferation.

فحص وتحديد الببتيدات الصغيرة التي تستهدف عامل نمو الخلايا الليفية Receptor2 باستخدام مكتبه الببتيد العرض Phage

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

Rapid Fabrication of Custom Microfluidic Devices for Research and Educational Applications

Microfluidic devices allow for the manipulation of fluids, particles, cells, micro-sized organs or organisms in channels ranging from the nano to submillimeter scales. A rapid increase in the use of this technology in the biological sciences has prompted a need for methods that are accessible to a wide range of research groups. Current fabrication standards, such as PDMS bonding, require expensive and time consuming lithographic and bonding techniques. A viable alternative is the use of equipment and materials that are easily affordable, require minimal expertise and allow for the rapid iteration of designs. In this work we describe a protocol for designing and producing PET-laminates (PETLs), microfluidic devices that are inexpensive, easy to fabricate, and consume significantly less time to generate than other approaches to microfluidics technology. They consist of thermally bonded film sheets, in which channels and other features are defined using a craft cutter. PETLs solve field-specific technical challenges while dramatically reducing obstacles to adoption. This approach facilitates the accessibility of microfluidics devices in both research and educational settings, providing a reliable platform for new methods of inquiry.

Here we present a protocol to design and fabricate custom microfluidic devices with minimal financial and time investment. The aim is to facilitate the adoption of microfluidic technologies in biomedical research laboratories and educational settings.