وأيد هذا المشروع البحثي عن طريق الملحق الأذربيجانية، 5 R01 NS056380. وقدم دعم إضافي من خلال ناقلات الفيروسية الأساسية والأساسية الميكروسكوب من إيموري علم الأعصاب NINDS كور المرافق منحة، P30NS055077. نشكر ماوس إيموري المعدلة وراثيا واستهداف الجينات الأساسية لاشتقاق خط الماوس من GENSAT؛ جريج Pazour لمستقر SSTR3-GFP IMCD3 خط الخلية، وبرادلي يودر لSstr3-GFP lentiviral بناء. تم الحصول على الاجسام المضادة من دراسات الإنمائية الضفة هجين، وضعت تحت إشراف معاهد الصحة القومية، والتي تحتفظ بها جامعة أيوا، قسم العلوم البيولوجية، مدينة أيوا، IA 52242. وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية من قبل IACUC ولجنة السلامة الأحيائية في جامعة إيموري.

يصرح باستخدامها فئران بالغة من قبل خلع عنق الرحم الميكانيكية. وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية من قبل IACUC ولجنة السلامة الأحيائية في جامعة إيموري. 1. الجيل الجنين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصليب تاموكسيفين محرض لجنة المساواة العرقية خط، CAGGCreER، وخط مراسل dsRedCre (تيراغرام (CAG-Bgeo، DsRed *-MST) 1Nagy) (الشكل 1) 5،6. لرصد توقيت النسبي للاستجابة صه في الخلايا الوليدة، عبر CAGGCreER وخط dsRed مع Olig2-EGFP BAC الفئران المعدلة وراثيا (تيراغرام (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (الشكل 1) 7،8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل تاموكسيفين في الإيثانول بنسبة 100٪، وأداء حقن داخل الصفاق من 2.5 ملغ تاموكسيفين لكل 40 غرام من وزن الجسم في الإناث الحوامل في الجنينية 6.5 (E6.5) للحث على لجنة المساواة العرقية التعبير ووضع العلامات dsRed في مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 ساعة في وقت لاحق تشريح الأجنة، وتحديد الأجنة إيجابية dsRed باستخدام المجهر الفلورسنت، ونقلها إلى طبق الثقافة وobservه الانقسامات خلية واحدة خلال التصوير خارج الحي (انظر أدناه). </li></ol> 2. كله ماوس الثقافة الأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح E8.5 الأجنة في مرحلة ما قبل حرارة متوسطة غسل تحتوي على DMEM/F12 (1:1) تستكمل مع 10٪ مصل العجل الوليد و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين (P / S) 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد تشريح والأجنة مكان على 37 درجة مئوية مرحلة التسخين تحت المجهر الفلورسنت وتحديد وGFP و / أو dsRed إيجابية (انظر أدناه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تصل إلى 2 الأجنة إلى 500 قطرة ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة قبل معايرتها تحتوي على الجرذ 50٪ مصل من الذكور سبراغ داولي و 50٪ DMEM/F12 (1:1) دون أحمر الفينول تستكمل مع L-الجلوتامين و 1٪ من 1 M HEPES في 0.85٪ كلوريد الصوديوم وP / S 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق طبقة رقيقة (0.1 سم) من معايرتها الزيوت المعدنية الخفيفة على المدى المتوسط ​​لمنع التبخر ونقل الطبق الثقافة التي تحتوي على الأجنة إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة. </li></ol> 3.العدوى الفيروسية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل أهداب التسمية في الظهارة العصبية، إضافة 5-10 ميكرولتر من Sstr3-GFP الفيروسة البطيئة، ما يقرب من 2 مليون virions، إلى 500 قطرة معايرتها ميكرولتر من مستنبت يحتوي على E8.5 الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 18 ساعة من الثقافة، ونقل الأجنة المصابة إلى عدة قطرات من غسل المتوسطة لتغسل الفيروس وتحضير شريحة الأنبوب العصبي. </li></ol> 4. الأنبوب العصبي إعداد شريحة للتصوير لايف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الأنبوب العصبي للجنين E8.5 في مرحلة ما قبل حرارة متوسطة غسل باستخدام سكين صغيرة الحجم 0.025 مم، على طبق أجار 1٪ المغلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع معزولة الأنبوب العصبي الجانب البطني أسفل في قطرة 150 ميكرولتر من مستنبت معايرتها دون أحمر الفينول على ملم بولي-L-يسين المغلفة طبق أسفل الزجاج 35. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كميات صغيرة من 1:1 خليط مصنوعة من 100٪ نقية الفازلين والشمع الذائب (شمعة من IKEA) حول الأنبوب العصبي التي شنت، واضغط بلطف بواسطة قطعة ضيقة من الزجاج ساترة من أجللشل حركة العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية صحن مع طبقة رقيقة (~ 0.1 سم) من معايرتها الزيوت المعدنية الخفيفة (الشكل 2). </li></ol> 5. يعيش التصوير والوقت الفاصل بين المجهري متحد البؤر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الطبق تحت A1R الليزر الضوئي نيكون متحد البؤر المجهر المقلوب مجهزة غرفة البيئية التي ينظم درجة الحرارة، وتعيين إلى 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 60X الهدف النفط الغمر لتسجيل GFP أهداب الخلايا وصفت وإيجابية dsRed، في حين أن استخدام الهدف النفط الغمر 40X لرصد Olig2-GFP إيجابية الخلايا وdsRed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح عناصر البرنامج شيكل لاقامة الوقت الفاصل بين التصوير الظروف. كل 10 دقيقة اكتساب Z-مداخن تصل إلى 25 ميكرون مع تباعد من 1.5 ميكرون (الهدف 40X) وحتى 8 ميكرون مع تباعد من 0.4 ميكرون (60X الهدف). استخدام 488 و 561 نانومتر موجات الإثارة وقناة تبث إذا لزم الأمر. الحصول على صور في 512 X 512 حجم. إعداد عدة مناطق المعرفة من قبل المستخدم إدارة النزاهة المؤسسيةerest لأداء تسجيل في وقت واحد. تم تعديل التعرض الأمثل لقوة الليزر وسطوع الصورة عن طريق استخدام الليزر منخفض الكثافة (ما يصل الى 11٪ للmCherry 561؛ يصل إلى 4.5٪ EGFP 405/488)، سرعة المسح الضوئي 1، 2 متوسط ​​خط وحجم ثقب دبوس (61 ميكرون لdsRED؛ 28.1 ميكرون لOlig2؛ 72 ميكرون لSSTR3GFP؛ 61.3 ميكرون لdsRED وSSTR3GFP؛ 58 ميكرون لdsRED وOlig2). تمكين استخدام للصحفيين الفلورسنت المشفرة وراثيا لنا للكشف عن سطوع مع قوة الليزر منخفض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات المسجلة باستخدام برنامج 3D Imaris إعادة الإعمار. </li></ol> 6. المناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الأجنة أو أنابيب العصبية معزولة في بارافورمالدهيد 4٪ / 0.1 م العازلة الفوسفات على الجليد (4 ° C) لمدة 1 ساعة في طبق زجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينات 2 ساعة في برنامج تلفزيوني على الجليد (4 ° C) (تغيير PBS عدة مرات) ووضعها في السكروز 30٪ / 0.1 م العازلة الفوسفات أكثر من ليلة أو حتى الأجنة بالوعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغرس في أكتوبر، وتجميد الثلج الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية. Perform باجتزاء على ناظم البرد (10 مم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشرائح لمدة 10 دقيقة في محلول الغسيل التي تحتوي على 1٪ مصل الأغنام الحرارة المعطل و 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الأجسام المضادة الأولية في محلول الغسيل في أعقاب تركيزات: الجرذ وحيدة النسيلة المضادة للRFP (5F8،) 1:200؛ أرنب المضادة للArl13b المصل 1:1500 والماوس وحيدة النسيلة المضادة للArl13b 01:05 (295B/54)؛ أرنب المضادة للOlig2 1:300؛ monoclonals ماوس Pax6، صه وNkx2.2 للجميع 1:10؛ والأرنب بولكلونل Ki67 1:500. إضافة حوالي 150 ميكرولتر لكل شريحة في غرفة ترطيب شقة، وتغطي مع parafilm لتجنب الجفاف وترك أكثر من ليلة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشرائح في حل يغسل ثلاث مرات، في كل مرة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الأجسام المضادة الثانوية اليكسا فلور 488، 568، 350 في الحلول يغسل في 1:200 التركيز. استخدام هويشت 1:3،000 أو TO-PRO-3 1:500 إلى نوى وصمة عار. إضافة 150 ميكرولتر لكل شريحة، وترك 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في غرفة ترطيب محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشرائح في غسل حل TWس مرات، و 30 دقيقة في كل مرة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل الشرائح في 80٪ إطالة الذهب كاشف مكافحة تتلاشى وعرض في غضون 24 ساعة. </li></ol>

<ol>
	<li>Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+pattern+in+the+neural+tube:+motor+neuron+induction+by+diffusible+factors+from+notochord+and+floor+plate.">Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate.</a> Cell. 73, 673-686 (1993).</li><li>Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+induces+the+differentiation+of+ventral+forebrain+neurons:+A+common+signal+for+ventral+patterning+within+the+neural+tube.">Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube.</a> Cell. 81, 747-756 (1995).</li><li>Briscoe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeodomain+Protein+Code+Specifies+Progenitor+Cell+Identity+and+Neuronal+Fate+in+the+Ventral+Neural+Tube.">Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube.</a> Cell. 101, 435-445 (2000).</li><li>Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ciliary+localization+sequences+within+the+third+intracellular+loop+of+G+protein-coupled+receptors.">Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors.</a> Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).</li><li>Vintersten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+red:+red+fluorescent+protein+expression+in+mouse+ES+cells,+embryos,+and+adult+animals.">Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals.</a> Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).</li><li>Hayashi, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+recombination+in+diverse+tissue+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre:+a+tool+for+temporally+regulated+gene+activation/inactivation+in+the+mouse.">Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse.</a> Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).</li><li>Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).</li><li>Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olig2++neuroepithelial+motoneuron+progenitors+are+not+multipotent+stem+cells+in+vivo.">Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).</li><li>Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+vivo+imaging+of+postimplantation+mammalian+embryos+using+whole+embryo+culture.">Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture.</a> Genesis. 34, 228-235 (2002).</li><li>Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+individual+cell+divisions+in+mouse+neuroepithelium+shows+asymmetry+in+cilium+formation+and+Sonic+hedgehog+response.">Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response.</a> Cilia. 1 (6), (2012).</li><li>Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mouse+development+with+confocal+time-lapse+microscopy.">Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نظامنا فيفو السابقين تمكننا من مراقبة مباشرة الانقسامات خلية واحدة داخل الظهارة العصبية النامية في الوقت الحقيقي. وكمثال على ذلك درسنا الانقسامات الخلوية داخل الأنبوب العصبي الجنيني الماوس ومراقبتها إما تشكيل هدب أو استجابة صه. أكدنا نتائج التصوير دينا (ن = 24) تتسق مع نتائج من الأبواب الثابتة (ن = 178) مما يدل على تقنية قمنا بها توفر البيانات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. يعتمد أسلوبنا في لجنة المساواة العرقية الاستقراء التي تقتصر على مجموعة فرعية من الخلايا بحيث جرعة من عقار تاموكسيفين يجب أن يكون دقيقا. عملنا خارج الجرعات لوصفها الخلايا واحد. ونحن نعتقد أنه سيكون من السهل لتسمية الحيوانات المستنسخة صغيرة من الخلايا مع زيادة طفيفة في الجرعة يعتمد على التحليل الأولي من الخط CAGGcreER، والتي أظهرت استجابة الجرعة التي تعتمد على تاموكسيفين 6. بالإضافة إلى ذلك، فإن الظروف ثقافة الجنين هي الحاسمة، كما يحدث نمو غير طبيعي إذا كانت الشروط هي خارج.أكدنا أن التنمية شرع عادة في ظل الظروف ثقافة كنا، والتي من المعروف أنها تعمل لمدة 36 ساعة على الأقل 11. لجنة المساواة العرقية وخطوط لجنة المساواة العرقية مراسل محرض التي نستخدمها هي المتاحة للعموم بحيث يمكن الحصول عليها بسهولة مما يجعل هذه التقنية قابلة للتكيف تماما للباحثين مع مجموعة متنوعة من الأسئلة. القوة الحقيقية للتقنية لدينا هو أنه في وضع العلامات وراثيا الخلايا واحدة، نهجنا يمكن استخدامها لاستجواب سلوك خلية واحدة في العديد من خطوط الماوس متحولة الحالية والمستقبلية. هذا وسوف تكون حاسمة في فهم ما يجري حقا خاطئ في العديد من هذه الخطوط والملاحظة المباشرة من الخلايا داخل الجنين الثدييات خلال التنمية لم درست على نطاق واسع. لدينا incorporaton من صحفيين الفلورسنت المشفرة وراثيا للكشف عن سطوع مع قوة الليزر منخفض يوفر ميزة حقيقية لمثل هذه الملاحظة. فمن السهل أن نتصور البروتينات الموسومة fluorescently بمناسبة العضيات الخلوية محددة أو TR أخرىللصحفيين anscriptional متكاملة يجري في المستقبل. ونحن مهتمون في توقيت قريب من تشكيل هدب الابتدائية واستجابة صه في الخلايا الوليدة من الخلية الانقسام. ومع ذلك، فإن خط المعدلة وراثيا التي مكنتنا من رصد استجابة صه أعرب Olig2-EGFP في جميع أنحاء السيتوبلازم، النافية لنا من رؤية علامة من هدب الأولية، Sstr3-GFP في نفس الخلية. وبالتالي، فإننا قد استفادت كثيرا من إما مقيدة Olig2-EGFP النووية أو متميزة طيفيا Sstr3 الفلورسنت الانصهار البروتين. بالإضافة إلى استخدام خط المستهدفة والمعدلة وراثيا، أظهرنا أن لدينا تقنية يمكن تكييفها باستخدام بنيات الفيروسية والتي تصيب الظهارة العصبية في الثقافة يوفر بيانات مفيدة. وسيكون هذا مفيدا للمحققين في توفير وسيلة أسرع من الجيل من خط الماوس المعدلة وراثيا. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للتحقق من صحة نهج جيل من مثل هذا الخط، بل البيانات المتوفرة لدينا ادعت العابرةسوف خط الجينى معربا عن Sstr3-GFP تكون ذات فائدة كبيرة لهذا المجال. يوفر طريقة لدينا الأدوات التي الحقل يمكن رصد سلوك الخلية أكثر مباشرة. بالإضافة إلى الموارد الغنية من المسوخ الماوس نتوقع هذا الأسلوب لتكون قوية وخاصة في دراسة مجموعة من السلوكيات الخلوية في الموقع.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>005438</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd</td>
			<td>MMRRC,</td>
			<td>010555-UCD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAGGCreER</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>003724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn calf serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-416F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Serum SD male</td>
			<td>Harlan Bioproducts</td>
			<td>4520</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Hepes</td>
			<td>BioWhittaker</td>
			<td>17-737E</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sstr3-GFP lentivirus</td>
			<td>Emory Viral Core</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-knife, size 0.025 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62091</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-0-10-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% petroleum jelly</td>
			<td>Kroger</td>
			<td>FL9958c</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 3D software</td>
			<td>Bitplane AG</td>
			<td>Imaris 7.2.3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated sheep serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16210-072</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafolmaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer</td>
			<td>Lab made</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-RFP (5F8)</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>110411</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Arl13b serum</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Olig2</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonals Pax6</td>
			<td>Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>Pax6</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonalsShh</td>
			<td>Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>5E1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonals Nkx2.2</td>
			<td>Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal Ki67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB15580</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11029</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11031</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 350</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11046</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC22989</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3605</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold anti-fade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo live imaging of single cell divisions in mouse neuroepithelium

قمنا بتطوير نظام يجمع بين التصوير الحي من علامات الفلورسنت وشرائح زراعة من الظهارة العصبية الجنينية الماوس. ونحن قد استفادت من خطوط الماوس القائمة لخلية تتبع نسب الوراثية: خط جنة المساواة العرقية تاموكسيفين محرض وخط مراسل لجنة المساواة العرقية معربا عن dsRed على إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية بوساطة. باستخدام مستوى منخفض نسبيا من عقار تاموكسيفين، كنا قادرين على إحداث إعادة التركيب في عدد صغير من الخلايا، والسماح لنا لمتابعة انقسامات الخلية الفردية. بالإضافة إلى ذلك، لاحظنا استجابة النسخي إلى القنفذ الصوتي (صه) إشارات باستخدام Olig2-EGFP المعدلة وراثيا خط 1-3 ونحن رصدها تشكيل أهداب عن طريق إصابة شريحة مثقف مع فيروس معربا عن علامة أهداب، Sstr3-GFP 4. من أجل صورة الظهارة العصبية، ونحن حصاد الأجنة في E8.5، عزل الأنبوب العصبي، شنت شريحة العصبية في ظروف زراعة السليم في غرفة التصوير، وأجرى الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر. لدينا السابقينفيفو طريقة التصوير الحي تمكننا من تتبع الانقسامات خلية واحدة لتقييم توقيت النسبية لتشكيل أهداب الابتدائية واستجابة صه بطريقة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. هذه الطريقة يمكن تكييفها بسهولة باستخدام علامات الفلورسنت متميزة ويوفر مجال الأدوات التي لمراقبة سلوك الخلية في الوضع الطبيعي وفي الوقت الحقيقي.

هنا أجرينا السابقين فيفو تصوير حي من خلية واحدة الانقسامات داخل الظهارة العصبية الماوس E8.5. لتسمية الخلايا الفردية، ونحن يسببها لجنة المساواة العرقية recombinase البكتيري المحور في مجموعة فرعية من الخلايا التي تحتوي على خط مراسل لجنة المساواة العرقية التي عبرت عن dsRed على إعادة التركيب 5،6 (الشكل 3A). وهكذا، بعد 48 ساعة كنا قادرين على مراقبة الانقسامات خلية واحدة خلال التصوير خارج الحي (أرقام 4A-D). وفي نفس الوقت، نحن رصدها عندما أصبحت الخلايا المسمى صه المراعية من قبل بما في ذلك مراسل النسخي صه تعديل BAC المعدلة وراثيا خط Olig2-EGFP (أرقام 3C-D؛ أرقام 4G-N) 1-3. لمراقبة تشكيل أهداب ولدت لنا Sstr3-GFP الفيروسة البطيئة لتصيب الأجنة في الثقافة (الشكل 3B؛ أرقام 4A-D) 4. وقد أجريت المناعي لتأكيد النتائج في الجسم الحي (أرقام 4E-F). في الوقت فاتوأظهرت ه متحد البؤر المراقبة التصوير من أجنة مراسل dsRedCre معربا عن Olig2-EGFP أو المصابين Sstr3-GFP الفيروسة البطيئة خلال الثقافة في المختبر في الشكل 5 10. من أجل أن تكون على يقين من أن التعبير Sstr3-GFP كنا نستخدمها لتصور أهداب لا تتدخل مع أي عملية بيولوجية كامنة، ونحن تؤكده بيانات التصوير الحي لدينا مع الأبواب الثابتة الجنين من النوع البري. لأننا وجدنا نفس النسبة المئوية من اتواقت في تشكيل أهداب واستجابة صه، فإنه يشير إلى أن الفيروس لم SSTR3-GFP لا تؤثر هذه العمليات (الشكل 5A). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4439/4439fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4439/4439fig1.jpg" /> الشكل 1. مخطط تدفق الإجراء التصوير الحي فيفو السابقين باستخدام الماوس الظهارة العصبية. الصليب الماوس النهائي وtamoxiوصفت العلاج الفين يليها جنين فأر كامل طريقة الثقافة. ويتم اختيار الأجنة معربا عن بروتينات الموسومة fluorescently وعلى استعداد للتصوير لايف. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4439/4439fig1large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4439/4439fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4439/4439fig2.jpg" /> الشكل 2. الأنبوب العصبي إعداد شريحة للتصوير لايف. هي التي شنت A) E8.5 الجنين غير محول مع أول ظهور للأزواج الجسيدة. B) أنبوب العصبية تشريح في المتوسط ​​قبل تحسنت باستخدام سكين صغيرة. C) شريحة الأنبوب العصبي الجانب البطني أسفل على بولي-L-يسين الزجاج المطلي طبق أسفل. D) كمية صغيرة من خليط مصنوعة من هلام البترول وشمع تطبيقها في جميع أنحاء الأنبوب العصبي وغطت بلطف بواسطة NAقطعة من الزجاج ساترة RROW. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4439/4439fig2large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/4439/4439fig3.jpg" /> الشكل (3). تصور البروتينات fluorescently الموسومة في الخلايا الحية من الأنبوب العصبي مع المجهري متحد البؤر. A) تسميات DsRed الخلايا الفردية. B) أعرب في أهداب الأولية لأنها تشكل (النصال الصفراء) الفيروسة البطيئة SSTR3-GFP. CD) E8.5 الجنين يحمل Olig2-GFP يظهر التعبير GFP داخل الظهارة العصبية. شريط هو 30 ميكرون (A، D)، 15 ميكرومتر (B) و 1.5 ميكرومتر (C). <img alt="الشكل 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4439/4439fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4439/4439fig4.jpg" /> الشكل 4. رصد تشكيل أهداب وإشارات صه في تقسيم الخلايا في الأنبوب العصبي النامية. م) وحيد الخلية إيجابية dsRed تمر تقسيم يظهر أشكال هدب في خلية ابنة واحدة قبل الخلية الأخرى (C، أبيض السهم). تم تصوير الفيلم بمعدل إطار واحد كل 10 دقيقة. EF) المناعي باستخدام أجسام مضادة ضد RFP باللون الأخضر (لdsRed تتبع النسب) وArl13b باللون الأحمر (لأهداب). توسيع منطقة محاصر (E)، دون هويشت (F). GN) الخلية إيجابية dsRed يخضع تقسيم (IM). يتم التعبير عن Olig2-GFP فقط في ابنة واحدة (J، N). تم تصوير وتسجيل بمعدل إطار واحد كل 10 دقيقة. شريط هو 5 ميكرون (AD)، 50 ميكرون (F)، و 25 ميكرومتر (GN). <img alt="الرقم 5" fo:content-width="6in"FO: SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4439/4439fig5highres.jpg&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4439/4439fig5.jpg&quot; /&gt; الشكل 5. عد من الخلايا إيجابية dsRed مع أهداب والمظهر صه. رقم) من الخلايا dsRed تمر الانقسام وتوطين أهداب. الرمز * يعني ويعيش التصوير تشكيل أهداب كان متزامن. ب) عدد dsRed وOlig2-GFP إيجابية الخلايا تمر الانقسام وإشارات صه.

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium at JoVE.com

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

نحن هنا تطوير الأدوات اللازمة لل<em&gt; خارج الحي</em&gt; التصوير الحي لتتبع الانقسامات خلية واحدة في الماوس E8.5 الظهارة العصبية

فيفو السابقين التصوير لايف من الانقسامات الخلوية واحدة في الظهارة العصبية ماوس

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

ex-vivo-live-imaging-of-single-cell-divisions-in-mouse-neuroepithelium

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

10.3K Views.  Emory University School of Medicine. نحن هنا تطوير الأدوات اللازمة لل خارج الحي التصوير الحي لتتبع الانقسامات خلية واحدة في الماوس E8.5 الظهارة العصبية

Video: Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

متعددة الماوس تشريحي عصبي التصوير بالرنين المغناطيسي

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

يعيش بين محاور التصوير الجذر الظهرية بعد بضع الجذور

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

عالية الدقة التصوير لايف من سلوك خلية في الظهارة العصبية النامية

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

التصوير حية من الانقسام في تطوير الجنينية الماوس اللحاء

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

فيفو السابقين التصوير من بعد الولادة مخيخي الحبيبة الهجرة الخلية باستخدام متحد البؤر الفحص العياني

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

متزامنة<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; اختبار وظيفي اثنين من شبكية العين من قبل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نظام مخطط كهربية

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate decisions, will be crucial to design therapeutic strategies for many diseases affecting the nervous system. Current methods to track cell populations rely on their final outcomes in still images and they generally fail to provide sufficient temporal resolution to identify behavioral features in single cells. Moreover, variations in cell death, behavioral heterogeneity within a cell population, dilution, spreading, or the low efficiency of the markers used to analyze cells are all important handicaps that will lead to incomplete or incorrect read-outs of the results. Conversely, performing live imaging and single cell tracking under appropriate conditions represents a powerful tool to monitor each of these events. Here, a time-lapse video-microscopy protocol, followed by post-processing, is described to track neural populations with single cell resolution, employing specific software. The methods described enable researchers to address essential questions regarding the cell biology and lineage progression of distinct neural populations.

A robust protocol to monitor neural populations by time-lapse video-microscopy followed by software-based post-processing is described. This method represents a powerful tool to identify biological events in a selected population during live imaging experiments.

يعيش تصوير متبوعاً بخلية واحدة تتبع لرصد خلية علم الأحياء وتطور نسب السكان العصبية متعددة

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Fluorescence القرار خلية واحدة تعيش تصوير ساعات الإيقاعية المورفولوجية في الدماغ اليرقات الثقافة

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.